第40讲 基因工程及生物技术安全性与伦理问题-【备考无忧】备战2025年高考生物一轮复习优质课件

选修三 第40讲 基因工程及生物技术 的安全性与伦理问题 第九单元 生物技术与工程 1 01 重组DNA技术的基本工具 02 基因工程的操作程序 考点 03 基因工程的应用与蛋白质工程 04 生物技术的安全性与伦理问题 2 目标要求 1.理解基因工程的概念；　 2.阐明重组DNA技术三种基本工具的作用；　 3.阐明基因工程的基本操作程序及各步骤的作用；　 4.掌握DNA粗提取和鉴定的方法， 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR产物；　 5.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造， 可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质；　 6.认同生物技术在造福人类社会的同时 也可能会带来安全性与伦理问题。　 3 基因工程 基因工程 提供 表达目的基因 基因在 体内的表达 体外 水平 克服远缘杂交不亲和障碍、 生物性状。 供体 受体 目的基因 基因重组 受体 分子 原理 本质 操作环境 操作水平 定向改造 ☞也叫重组DNA技术 优 点 4 重组DNA技术的基本工具 01 5 能识别 的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 重组DNA技术的基本工具 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1.来源 2.种类 主要来自原核生物 数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶。 3.作用特点 专一性 作用部位 一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。 双链DNA分子 6 4.识别序列 EcoR Ⅰ 5’…G-A-A-T-T-C…3’ 3’…C-T-T-A-A-G…5’ Sma Ⅰ 5’…C-C-C-G-G-G…3’ 3’…G-G-G-C-C-C…5’ BamH Ⅰ 5’…G-G-A-T-C-C…3’ 3’…C-C-T-A-G-G…5’ Taq Ⅰ 5’……T-C-G-A……3’ 3’……A-G-C-T……5’ 限制酶所识别的序列的特点是： 呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。 在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 7 5.切割结果 （1）产生黏性末端 EcoR Ⅰ (只能识别GAATTC序列，在G与A之间切割) 黏性末端：AATT- 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 8 （2）产生平末端 Sam Ⅰ (只能识别CCCGGG序列，在C与G之间切割) 平末端 5.切割结果 9 1.请结合右图，推断EcoR Ⅰ限制酶 切一次可断开 个磷酸二酯键， 产生 个游离的磷酸基团， 消耗 分子水， 产生 个黏性末端。 两 2 2 两 A A A T T T C T A G A T A T C G 习题巩固 2.要想获得目的基因需要限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性末端？ 产生几个游离的磷酸基团？ 要切两个切口，产生四个黏性末端， 产生四个游离的磷酸基团。 10 习题巩固 3.(源于选择性必修3 P71“旁栏思考”) 原核生物中存在限制酶的意义： 当遭受外源DNA(如噬菌体)的入侵时，限制酶可切割外源DNA使之失效，以保证自身安全。 4.(源于选择性必修3 P74“拓展应用”) 限制酶不切割原核生物本身DNA分子的原因： 原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 5.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点， 据图回答： （1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段； （2）用Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段； （3）同时用Sma Ⅰ 和Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段； 2 3 5 习题巩固 12 6.写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamH Ⅰ: EcoR Ⅰ: Hind Ⅲ: Bgl Ⅱ: GATC- AATT- AGCT- GATC- *思考：你从中发现什么现象了？ 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。（P75） ——同尾酶 习题巩固 13 重组DNA技术的基本工具 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 1.作用 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。 注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化） 2.种类 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 只缝合__________ 缝合__________和__________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 磷酸二酯键 14 （2）T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率 相同。 1.判断以下说法是否正确： 因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。 （1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶 连接起来。 （3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。 习题巩固 15 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子或DNA的一条链 形成DNA的一条链 基因工程、DNA复制 DNA复制 只能将单个核苷酸连接到已有链的3' -OH末端上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 DNA连接酶和DNA聚合酶的比较 16 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 双链DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 产生 黏性末端或平末端 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较 17 2.根据所学知识，完成以下填空。 ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 A. 切断a处的酶为_______ B. 连接a处的酶为_______ C. 切断b处的酶为_______ ① ③④ ② a： ；b： 。 T G A A T C T G A A T C b a 磷酸二酯键 氢键 习题巩固 18 3.请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端， 再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列， 能否再被所用的限制酶识别？ （1）若两个相同黏性末端都是由同种限制酶 （EcoR Ⅰ）切割后所得， （填“能”或“不能”） 再被所用的限制酶识别。 能 （2）若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的 识别序列 （填“能” 或“不能”）再被所用的 限制酶识别。 不能 习题巩固 19 重组DNA技术的基本工具 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1.作用 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌 等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 将目的基因转入受体细胞， 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 20 2.最常用的载体——质粒 一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 其基因属于细胞质基因。 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 21 3.运载体需具备的条件 目的基因 插入位点 ①有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入（携带）目的基因； 复制原点 ②在受体细胞中稳定存在并能自我复 制或整合到受体DNA上，随受体 DNA同步复制； 标记基因 ③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA 分子的细胞； 抗性基因或 荧光蛋白基因 ④对受体细胞无害、易分离。 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 22 标记基因的筛选原理 23 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 标记基因的筛选原理 24 用相同的限制酶切割目的基因和运载体。 产生相同末端，便于连接。 1.目的基因是要与运载体结合的， 那如何处理质粒？ ★重组质粒的形成 用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。 习题巩固 25 用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶（同尾酶）分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。 a b c d a、b、c、d 四个黏性末端相同。 限制酶切割 DNA连接酶连接 启动子方向 目的基因转录方向 单酶切的缺点 26 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 缺点1 缺点2 缺点3 反向连接重组DNA 质粒自身环化 目的基因自身环化 单酶切的缺点 27 用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段 限制酶a切割 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 DNA连接酶连接 a b c d 黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。 双酶切 28 限制酶a切割 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 DNA连接酶连接 a b c d 质粒不会重新环化 目的基因不会被环化 优点1 优点2 优点3 目的基因与质粒 不会发生反向连接 确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。 双酶切 29 2.图甲是含有目的基因 的外源DNA片段，图乙 是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （1）上述操作中不宜选用Sma I， 原因是Sma I会破坏 和 。 （2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA 片段后， 。 目的基因 抗性基因 目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中 习题巩固 30 ①切割目的基因时： 。 ②切割质粒时： 。 能切下目的基因且不破坏目的基因 至少保留一个完整的标记基因，便于筛选 习题巩固 31 3.目的（外源）基因在受体细胞中为什么能表达？ ②不同生物的基因在表达时都遵循 “中心法则”，在受体细胞内定向表达； ①不同生物的DNA分子的结构基本相同； ③所有生物共用一套遗传密码。 DNA RNA 蛋白质 转录 翻译 复制 T C G A A G C T 习题巩固 32 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 主要来源于原核生物 具有专一性 来源： 特点： 作用部位： 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位： 种类： 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 磷酸二酯键 E.Coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶 课堂小结 33 习题巩固 1.(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3 和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应 限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接， 以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　 ) A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 C 只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coli DNA连接酶无法连接酶3切出的平末端，A不符合题意； 用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意； 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意； 酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。 34 习题巩固 2.大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的 一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因和lacZ 基因。 在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏， 则大肠杆菌菌落呈蓝色； 若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。 关于图中操作的叙述正确的是( ) A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶 B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2+处理大肠杆菌 C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色 D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养 B 也有蓝色 习题巩固 3.(2023·广东佛山南海区高三摸底测试)下图1表示某DNA片段及限制酶酶切位点，用限制酶XhoⅠ和SalⅠ分别处理该DNA片段后，酶切产物电泳分离的结果如图2所示。下列叙述错误的是(　　) A.不同的限制酶切割DNA后形成的黏性末端可能相同 B.限制酶XhoⅠ与限制酶SalⅠ识别的核苷酸序列不同 C.泳道①②分别是限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ处理得到的产物 D.用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段， 可得到6种电泳产物 C 不同的限制酶识别的序列不同，但可能会产生相同的黏性末端，A正确；结合图1和图2可知，限制酶XhoⅠ与限制酶SalⅠ识别的核苷酸序列不同，B正确；由题图分析可知，泳道①②分别是限制酶SalⅠ和限制酶XhoⅠ处理得到的产物，C错误；用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段，该片段共有5个酶切位点，可得到6种电泳产物，D正确。 36 习题巩固 4.(2023·湖北选择性考试)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp (氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 D DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因(TetR)，氨芐青霉素抗性基因(AmpR)不受影响，则重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 37 2.DNA在不同浓度的___________中溶解度不同， 它能溶于___________的NaCl溶液。 DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 3.在一定温度下，DNA遇_________试剂会呈现蓝色。 ☞初步分离DNA和蛋白质 NaCl溶液 2 mol/L ☞溶解DNA ☞鉴定DNA 二苯胺 1.DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精。 ☛二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 38 二、材料用具 1.材料 富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、 二苯胺试剂和蒸馏水等。 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 2.用具 烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。 DNA的粗提取与鉴定 39 三、方法步骤 （1）研磨的目的： （2）研磨时间不宜太长： （3）研磨不宜太用力 （4）有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶： 1.通过研磨释放 DNA 称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量。 研磨效果好（有利于充分研磨）。 DNA的粗提取与鉴定 40 2.过滤获取含DNA的上清液 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。 为减少 DNA 的损失，过滤过程一般使用纱布 可能含有核蛋白、多糖等杂质 低温放置几分钟的作用 ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 三、方法步骤 41 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。 3.冷却酒精析出DNA 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 三、方法步骤 42 4.DNA的鉴定 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 实验组 对照组 水浴加热 ☛溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关 三、方法步骤 43 习题巩固 1.(2023·广东高考)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是： 裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　 ) A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 D DNA主要存在于细胞核内，而裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确； DNA、RNA、蛋白质和多糖等物质在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，通过适当的分离方法去除混合物中的多糖、蛋白质等，B正确； DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度使DNA溶解或析出，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确； 进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。 44 2.(2024·梅州一模)以菜花为材料提取DNA时，需将材料进行研磨，研磨液的成分常含有SDS(蛋白质变性剂)、EDTA(DNA酶抑制剂，稳定DNA活性)、Tris(缓冲剂)。下列有关叙述错误的是(　 ) A.若选择鸡血细胞为材料，则省去了研磨过程 B.SDS可以使蛋白质变性，便于DNA与蛋白质分离 C.EDTA可以防止DNA水解成核糖核苷酸 D.Tris可以调节溶液中的pH 习题巩固 C 鸡血细胞利用细胞吸水涨破的原理 脱氧核苷酸 鸡血细胞悬浮液作为实验材料，利用细胞吸水涨破的原理，省去了研磨过程，A正确； SDS是蛋白质变性剂，可使蛋白质结构变得松散，使染色体中DNA和蛋白质分离，B正确； DNA的基本单位是脱氧核苷酸，EDTA是DNA酶抑制剂，可以防止DNA水解成脱氧核苷酸，C错误； Tris是缓冲剂，可调节溶液中的pH，D正确。 45 习题巩固 3.(2024·河北沧州高三模拟)下列关于“DNA粗提取”的相关操作，错误的是（　　） A.应选用DNA含量相对较高的材料， 如鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜 B.可利用DNA和蛋白质在不同浓度NaCl溶液中溶解度的不同， 将两者分开 C.研磨材料得到的滤液应在4 ℃冰箱中静置或离心， 取沉淀进行后续操作 D.向经酒精处理得到的白色丝状物中加入蛋白酶， 可提高DNA的相对含量 上清液 C 基因工程的操作程序 02 47 苏云金杆菌 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达 Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 培育转基因抗虫棉的简要过程 48 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ 2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 习题巩固 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白 （Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统 来杀死棉铃虫。 49 基因工程的操作程序 一、目的基因的筛选与获取 1.筛选合适的目的基因 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得 预期表达产物等相关的基因。 主要是指 的基因，也可以是具有调控作用的因子。 基因按功能可分为结构基因(能转录并翻译)、转录基因(只转录)和调控基因(调控其他基因表达) 编码蛋白质 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选； ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 筛选方法 50 2.目的基因的获取方法 一、目的基因的筛选与获取 （3）利用PCR获取和扩增目的基因 （1）从基因文库中获取 （2）通过DNA合成仪直接合成 （1）从基因文库中获取 基因文库的类型 基因组文库 部分基因文库（主要是cDNA文库） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 ①基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 该生物 基因组文库 每个受体菌含有一段不同的DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体 （1）从基因文库中获取 52 含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。 ②cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成 mRNA 杂交双链 单链DNA 双链cDNA (cDNA) 该生物 cDNA文库 基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子， cDNA文库中的基因不含以上结构。 与载体连接 导入受体菌群 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 某一发育时期 （1）从基因文库中获取 53 质粒 质粒 cDNA片段 逆转录酶 导入细菌中 逆转录 cDNA mRNA cDNA文库 细胞 基因组DNA 质粒 质粒 DNA片段 导入细菌中 基因组文库 54 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间基因交流 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 （1）从基因文库中获取 55 2.目的基因的获取方法 （2）通过DNA合成仪直接合成 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA 基因比较小、核苷酸序列已知 56 2.目的基因的获取方法 （3）利用PCR获取和扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此， 穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 PCR是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 PCR——聚合酶链式反应 ①PCR的原理 DNA半保留复制 57 ③体外DNA复制所需的基本条件 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） DNA模板 引物（2种） 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 四种脱氧核苷酸(dNTP) 激活真核细胞和 细菌的DNA聚合酶 dATP dGTP dCTP dTTP （3）利用PCR获取和扩增目的基因 58 dATP 腺嘌呤脱氧核苷酸 dADP 腺苷（A) 腺嘌呤 脱氧 核糖 P P P ~ ~ OH H 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 脱氧核苷三磷酸 59 3′ 5′ 子链的延伸方向是5 ′→3 ′ DNA聚合酶 3′ 5′ 模板链 子链 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端 引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) 子链合成需要引物 引物 60 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 什么是引物 子链延伸 子链延伸 引物是决定PCR特异性的关键 -5 ′ 3′- 引物 5′- -3′ 5′- -3′ 引物 3′- -5′ 引物 61 1.延伸时需要加入两种引物，原因是: DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 2.两种引物的要求： ①引物自身及引物之间不应存在互补序列； ②引物5'端可以修饰，3'端不可修饰； ③引物长度要适宜，过短容易让引物随机结合， 过长会导致延伸温度太高从而不利于Taq DNA聚合酶发挥作用； 习题巩固 ④引物G-C含量要适宜。 62 参与的组分 在PCR的作用 目的基因DNA 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) 引物 缓冲液 Mg2+ 高温 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（两种） 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 维持反应体系的pH 激活DNA聚合酶的活性 ③体外DNA复制所需的基本条件 63 （3）利用PCR获取和扩增目的基因 第1步：变性 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 当温度超过90℃时， 双链DNA解旋为单链。 95℃ ④PCR的过程 64 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 第2步：复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 50℃ 长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高 ④PCR的过程 65 思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。 原因是 ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的 碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 第2步：复性 ④PCR的过程 66 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 第3步：延伸 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 72℃ ④PCR的过程 67 DNA解链为单链 高温(95℃)变性 低温(50℃)复性 中温(72℃)延伸 引物结合到互补DNA链 Taq酶从引物起始进行子链的合成 PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。 ④PCR的过程 68 ④PCR的过程 69 目的基因DNA________后________，____与单链相应互补序列 结合；然后以_________为模板在 作用下进行_____，即将4种___________加到___________，如此重复循环多次。 受热变性 解为单链 引物 延伸 单链DNA 耐高温的DNA聚合酶 引物的3 ′端 脱氧核苷酸 每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。 变性 复性 延伸 变性：加热至90℃以上，___________________; 复性：冷却至 ℃左右，引物与单链DNA结合； 延伸：加热至72℃左右， 从引物起始进行 互补链的合成。如此重复循环多次。 双链DNA解聚为单链 50 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶只能特异性地复制处于 之间的DNA序列,使其成指数倍增加。 两个引物 PCR过程归纳 70 利用PCR获取和扩增目的基因条件 ①____：DNA的两条链。 ②____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。 ③原料：A、T、G、C四种__________。 ④酶： 酶。 ⑤其他条件：需要一定的 溶液和能严格控制温度的温控设备。 模板 引物 脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合 缓冲 由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____， 因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____， 即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 产物 模板 一倍 指数 PCR过程归纳 71 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋 方式 解旋酶催化 边解旋边复制 场所 主要在细胞核内 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 温度 细胞内温和条件 结果 合成整个DNA分子 联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链 DNA在高温下变性解旋 全部解旋后再复制 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 耐高温的DNA聚合酶 控制温度，需在不同温度下进行 扩增特定的DNA片段或基因 72 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 引物A 引物B 扩增一次 PCR相关计算 73 中长链-短链DNA____个 2 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 3 3 扩增两次 PCR相关计算 74 中长链-短链DNA____个 4 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 7 7 短链-短链DNA______个 2 出现完整的目的基因 扩增三次 PCR相关计算 75 扩增次数 1次 2次 3次 4次 n次 DNA总数 21 22 23 24 2n 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链 DNA 含引物A(或B) 的DNA 2 0 0 2 2 2 4 0 2 2 6 8 2 2(n-1) 2n-2n 1 3 7 15 2n-1 PCR相关计算 76 一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次： ①子代DNA分子数为：___个 ②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个 ③子代含有的目的基因数目：_____个 ④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个 ⑤复制过程中共需引物_______个 ⑥第n次复制需要引物___个 2n 2 2n-1 2n＋1 - 2 2n 2n-2n PCR相关计算 77 1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有(　　) A.8个 B.6个 C.4个 D.2个 A 习题巩固 78 图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为________。 15/16 2.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似。 习题巩固 79 3.SRY—PCR是对移植前的胚胎进行性别鉴定的技术。 以Y染色体上SRY基因（性别决定基因）的一段序列作引物，用被测胚胎DNA作_____进行PCR扩增。根据SRY基因序列设计的引物长度一般为20～24个核苷酸，其不宜过短的原因主要是__________________。两种引物中G＋C的含量相差不宜过大，原因主要是________________________________。 防止引物随机结合 C、G含量差别大， 低温复性难统一 模板 习题巩固 80 4.用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 RNA链 DNA链 mRNA 杂交双链 单链DNA 双链cDNA 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 习题巩固 RT-PCR扩增 81 5.实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。 下列说法错误的是（ ） 习题巩固 82 A.做RT－PCR之前， 需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针 B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录 为DNA后再进行扩增 C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒 D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体， 其原理都是抗原—抗体杂交 C 习题巩固 83 ⑤PCR产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳技术 （3）利用PCR获取和扩增目的基因 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向看与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 84 ② PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 一次PCR一般要经历30次循环。 一、实验原理 DNA片段的扩增及电泳鉴定 ① PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA 双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温 度的仪器。 1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 85 2.DNA片段电泳鉴定的原理 ① DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以 带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着 与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 一、实验原理 86 ②线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子大小呈 ，分子越大则所受阻力越大，也越难在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢，随着时间的推移，不同大小的DNA分子就会在凝胶中呈现出一个一个的条带。 ③ 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯 下被检测出来。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 反比 87 二、PCR实验 DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR反应体系的配方 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 （实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶 （即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 注意：反应体系总体积为50μL，一般按照用量由大到小的顺序来加样，最后才加DNA聚合酶，这样既保证所加各试剂体积的准确性也能保护酶的活性 88 二、PCR实验 加样 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 扩增 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 89 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 二、PCR实验 90 三、DNA片段的电泳鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小， 用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 ①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子， 以形成加样孔。 2.制备凝胶 ——加样孔侧连电极负极。 91 ②凝胶溶液完全凝固， 小心拔出梳子，取出 凝胶放入电泳槽内。 ③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 电泳缓冲液用来维持pH值，使DNA带负电荷。 2.制备凝胶 92 3.电泳加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 凝胶载样缓冲液类似层析液 三、DNA片段的电泳鉴定 93 4.电泳、观察 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 三、DNA片段的电泳鉴定 94 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 95 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、 枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成 小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放 在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 四、注意事项 96 四、DNA片段琼脂糖凝胶电泳图谱分析 DNA片段的扩增及电泳鉴定 将待测样品电泳条带与Marker(已知长度的DNA片段)进行对比，即可知道待测样品中DNA片段的长度，其中条带的宽度反映了DNA含量的多少。如下图所示：几个待测样品中DNA片段长度基本一致，约为 bp，其中 样品中DNA含量最少。 750 F2 97 习题巩固 1.下列关于凝胶电泳实验操作，叙述错误的是(　 ) A.加样孔应靠近负极端，以便带负电的DNA分子向正极移动 B.接通电源后电泳一段时间，离加样孔越近的DNA分子越小 C.紫外灯照射下，凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关 D.通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳 B 若DNA分子带负电，则靠近加样孔的一端为负极，接通电源，带负电的DNA分子向正极移动而使不同DNA逐渐分离，A正确； 相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢，分子量越小，迁移速度越快，电泳一段时间，离加样孔越近的DNA分子迁移越慢，分子量越大，B错误； 为了便于对分离后的DNA片段进行检测，在凝胶制备中加入核酸染料，能够与DNA分子结合发荧光，DNA含量越多，荧光强度越强，即凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关，C正确； 点样时应在样品中加入指示剂，根据指示剂泳动的位置判断是否停止电泳，D正确。 98 习题巩固 2.镰状细胞贫血是一种 单基因遗传病，由正常 血红蛋白基因(HbA)突变 为镰状细胞贫血症基因(Hbs)引起，HbA和Hbs的某片段如图甲。对胎儿基因检测的主要原理是：MstⅡ限制酶处理扩增后的DNA；加热使酶切片段解旋，用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交；凝胶电泳分离。图乙是凝胶电泳后荧光出现的三种可能情况。下列叙述错误的是(　 ) A.提取胎儿DNA样品后，扩增DNA需要添加dNTP和特定的引物 B.用MstⅡ限制酶处理DNA不充分，可能把正常人误判为携带者 C.若某胎儿检测结果为图乙b，则该胎儿为镰状细胞贫血症患者 D.荧光标记序列越长，图乙c中两个DNA条带间的距离越大 D 提取胎儿DNA样品后，进行PCR扩增DNA需要添加dNTP为原料，同时需要特定的引物，A正确。 据图甲分析可知，由于致病基因Hbs片段中碱基发生了替换，与正常基因相比MstⅡ限制酶的切割位点减少了一个，因此用MstⅡ限制酶处理DNA不充分，可能把正常人误判为携带者，B正确。 分析图乙可知，b中的DNA分子较大，并且只有一种类型，因此可以确定为镰状细胞贫血症基因的一条链与荧光标记的序列进行了杂交，即只含有致病基因，若某胎儿检测结果为图乙b，则该胎儿为镰状细胞贫血症患者，C正确。 图乙c中同时具有正常基因和致病基因，为该病致病基因的携带者。若荧光标记序列越长，则与正常基因片段配对区域越多，不会使图乙c中两个DNA条带间的距离变大,距离与分子量大小有关D错误。 99 基因工程的操作程序 二、基因表达载体的构建 1.构建基因表达载体的目的 （1）使目的基因在受体细胞中 稳定存在且遗传给下一代； （2）使目的基因在受体细胞中 能够表达且发挥作用。 ——基因工程的核心工作。 100 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。 位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。 供目的基因插入载体中 便于重组DNA的筛选 能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上 二、基因表达载体的构建 2.基因表达载体的组成 101 基因表达载体与基因克隆载体 基因克隆载体必须具备的条件 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 基因表达载体必须具备的条件 基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子之间的部位 基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点的序列。 102  项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 作用 一段DNA， 分别位于上、下游 mRNA上三个相邻碱基， 首尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译过程的结束 启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的比较 ①组成型启动子：在多数或全部组织中保持持续的活性； ②组织特异性启动子：可以使外源基因的表达只发生在某些特定的 器官或组织部位； ③诱导性启动子：使外源基因在特定条件即诱导物作用时才表达。 103 基因工程的操作程序 三、将目的基因导入受体细胞 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 ___________法、 花粉管通道法 _________技术 Ca2＋处理法 受体细胞 受精卵、体细胞 _______ 原核细胞 农杆菌转化 显微注射 受精卵 只有该步骤没有涉及碱基互补配对原则 104 花粉管 花粉粒 柱头 花柱 子房 胚囊 卵细胞 胚珠 精子 1.植物细胞 （1）花粉管通道法 我国科学家独创的一种方法 ①可以用微量注射器将含 目的基因的DNA溶液 直接注入子房中。 ②可以在植物受粉后的一定时间 内，剪去柱头，将DNA溶液滴 加在花柱切面上，使目的基因 借助花粉管通道进入胚囊。 三、将目的基因导入受体细胞 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 105 （2）农杆菌转化法 ①农杆菌是一种在土壤中生活的 微生物，能在自然条件下感染 双子叶植物和裸子植物，而对 大多数单子叶植物没有感染能力。 ②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物， 吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA （可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞 的DNA上。 采用最多 1.植物细胞 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。 106 转化 目的基因进入 内，并且在受体细胞内维持 和 的过程。 受体细胞 稳定 表达 此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 （2）农杆菌转化法 107 表现出新性状的植物 含重组Ti质粒的农杆菌 Ti质粒 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 导入植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 植物细胞 （2）农杆菌转化法 108 两次拼接 ①第一次拼接： ②第二次拼接(非人工操作)： 目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 （2）农杆菌转化法 109 两次导入 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌； 含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 ①第一次导入： ②第二次导入(非人工操作)： （2）农杆菌转化法 110 具体操作方法 ①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与 农杆菌共培养，然后筛选转化细胞， 并再生成植株； ②可以将花序直接浸没在含有农杆菌 的溶液一段时间，然后培植植株并 获得种子，再进行筛选、鉴定等。 受体细胞为_______ 体细胞 受体细胞为_______ 受精卵 （2）农杆菌转化法 111 （3）基因枪法 适用于单子叶植物 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 1.植物细胞 112 2.动物细胞 注射器 固定吸管 显微注射仪 将含有目的基因的 表达裁体提纯 →显微注射入动物的受精卵 →受精卵发育 →获得具有新性状的动物 受精卵 受体细胞 三、将目的基因导入受体细胞 （1）显微注射法 利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中，这个受精卵将发育成具有新性状的动物。将目的基因导入动物受精卵最有效的方法。 113 科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。 如慢病毒载体、腺病毒载体等。 2.动物细胞 （2）病毒介导法 114 1.为什么受体细胞选受精卵而不是正常体细胞？ ①受精卵具有全能性且体积大，易操作； ②动物体细胞的全能性受限。 如果做转基因植物的话，受体细胞可以采用植物的体细胞，因为植物可以组培，即便一个体细胞也可以让他发育成一个完整的植株，但是如果做转基因动物，那就不能用体细胞作为受体细胞，因为要保证全身上下的细胞都带有目的基因，如果已经是一个成熟的个体，只往它身上的某个部位比如肝脏细胞导入基因，就不能保证身体所有细胞都带上，所以唯一的受体细胞就是受精卵。 习题巩固 115 3.微生物细胞 （1）原核生物作为受体细胞的优点 ①繁殖快 ②单细胞 ③遗传物质少 （2）导入方法——Ca2+处理法（感受态细胞法） 大肠杆菌 感受态细胞 Ca2+ 混合 表达载体 缓冲液 溶于 吸收DNA，完成转化 使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态 用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞膜的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。 三、将目的基因导入受体细胞 116 胰腺 提取筛选 胰岛素mRNA 胰岛素cDNA 逆转录 重组 质粒 质粒 导入 大肠杆菌 mRNA 胰岛素原 胰岛素 加工 注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质 通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 用原核生物生产胰岛素示意图 （2）导入方法——Ca2+处理法（感受态细胞法） 117 2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？ 如果这么做，效果会怎样？ 有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。 习题巩固 118 基因工程的操作程序 四、目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否导入受体细胞 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的 接种实验 PCR扩增、 DNA分子杂交技术 抗原-抗体杂交技术 RT-PCR扩增、 RNA分子杂交技术 119 1.检测目的基因是否导入受体细胞 （1）PCR扩增 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 是否扩增出目的基因 PCR操作 电泳操作 非转基因棉花 转基因抗虫棉 阴性对照 Marker 四、目的基因的检测与鉴定 120 （2）DNA分子杂交技术 碱基互补配对 原理 探针 目的基因 带标记的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 1.检测目的基因是否导入受体细胞 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 121 ① 首先取出转基因生物的基因组DNA。 ② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或 化学发光催化剂）等作标记，以此做探针。 ③ 使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带， 表明目的基因已插入染色体DNA中。 基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸 序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA， 探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。 （2）DNA分子杂交技术 122 2.检测目的基因是否转录出mRNA （1）RNA分子杂交技术 （2）RT-PCR扩增 转基因生物 提取RNA RNA作为模板 逆转录 cDNA PCR操作、电泳 是否扩增出目的基因 四、目的基因的检测与鉴定 123 扩增目的基因 检测目的基因 产生突变基因 用模板DNA和目的基因相关引物扩增 用待测DNA和 相关引物扩增 有扩增产物则含有目的基因 无扩增产物则不含目的基因 可在引物中或引物的5`端引入突变序列 产生大量目的基因 产生大量突变基因 PCR的应用 PCR相关应用 124 抗原— 抗体杂交技术 3.检测目的基因是否翻译出蛋白质 过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 苏云金杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 注射到小鼠体内 抗体 标记抗体 转基因生物 提取蛋白 电泳分离 抗体 抗原 杂交 放射性检测 （杂交带） 四、目的基因的检测与鉴定 125 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未侵染上病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 个体水平上的检测 126 1.目的基因的筛选和获取-前提 DNA合成仪合成 基因文库获取 利用PCR获取和扩增 2.构建基因表达载体-核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因 3.将目的基因导入受体细胞-关键 花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、 显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物) 4.目的基因的检测与鉴定-保证 分子水平：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 课堂小结 127 习题巩固 D 1.(2024年1月·甘肃高考适应性演练)胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家 打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物， 下列叙述错误的是(　 ) A.用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步 B.构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶 C.大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体 D.抗原—抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞 用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，A正确； 在构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子，B正确； 大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体，C正确； 抗原—抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成人胰岛素，若抗原—抗体杂交结果为阳性，说明人胰岛素基因在大肠杆菌中成功表达，则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中，D错误。 128 习题巩固 D 2.转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。下列有关说法错误的是(　 ) A.大肠杆菌转化实验中可使用Ca2＋处理以提高转化效率 B.目的基因导入受体细胞前必须构建基因表达载体以便稳定存在 C.将DNA溶液滴加在受粉后的花柱切面上， 可以使目的基因进入胚囊 D.农杆菌转化法中需要进行两次体外拼接和两次导入 可以用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其能吸收周围环境中的DNA分子(使大肠杆菌处于感受态细胞状态)，有利于重组的基因表达载体导入其中，提高转化效率，A正确。 将目的基因导入受体细胞前必须构建基因表达载体，这是基因工程的核心步骤，B正确。 花粉管通道法：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注射到子房中，也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，C正确。 农杆菌转化法总体上有两次的拼接过程，发生在Ti质粒与目的基因之间(体外拼接)、携带目的基因的T-DNA与植物细胞的染色体DNA之间(体内拼接)；基因表达载体两次的导入过程，即基因表达载体导入农杆菌、农杆菌导入植物细胞，D错误。 129 习题巩固 CD 3.(多选)查尔酮异构酶(CHI)普遍存 在于高等植物中，有助于提高植物 的耐盐碱性。如图，科研人员构建 了CHI基因与质粒的重组表达载体，并将其导入酿酒酵母中， 使酿酒酵母的耐盐碱性大大提高，下列叙述错误的是(　 ) A.图示质粒上的卡那霉素抗性基因可作为标记基因 B.构建重组表达载体时，选择的限制酶是KpnⅠ和PstⅠ C.启动子作为DNA聚合酶识别和结合的部位，驱动CHI基因转录 D.可用适宜浓度的Mg2＋溶液处理酿酒酵母，以提高转化效率 导入含有卡那霉素抗性基因质粒的微生物可以在含有卡那霉素的培养基中生长，所以卡那霉素抗性基因可作为标记基因，A正确； 构建重组表达载体，需要利用相同的限制酶来切割含有目的基因的DNA分子和载体质粒，由于含有CHI基因的DNA分子和载体质粒上都具有KpnⅠ、PstⅠ酶的切割位点，故选择的限制酶是KpnⅠ和PstⅠ(不能选EcoRⅠ，因为切割位点在启动子上游，若选用，会将启动子切除掉)，B正确； 启动子作为RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动CHI基因转录，C错误； 为了提高基因表达载体导入酵母细胞的转化效率，常采用适宜浓度的Ca2＋(CaCl2)溶液处理酵母细胞，D错误。 130 习题巩固 B 4.(2023·浙江6月选考)某研究小组利用转基 因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到 野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验 得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各 1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。 为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是(　 ) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′→3′ 仅有Gata3基因时无法扩增出条带 由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因均能正常表达出相关蛋白质，即Gata3基因的启动子可以控制GFP基因表达，A错误； 由于启动子在左侧，目的基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′→3′，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； 利用引物1和引物2进行PCR扩增，大片段包含GFP基因编码区和非编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，只有非编码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误； 若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 131 习题巩固 C 5.(2024·泰安模拟)通过设计引物，运用PCR技术 可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中 获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个 碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与 模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端 分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。 下列有关叙述正确的是(　 ) A.在该PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、 Taq DNA聚合酶等 B.第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 C.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体 D.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA分子占1/2 形成两条链不等长的突变基因，其中②较长 1/4 在该PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等，但不需要加入解旋酶，A错误； 第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，B错误； 引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入载体，避免发生自身环化和反向连接，C正确； 在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D错误。 132 习题巩固 B 6.研究者将含有乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因的DNA片段分别制成探针，与从转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的mRNA分别进行杂交，结果如表所示。下列叙述正确的是(　 ) A.乳铁蛋白肽基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达 B.人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达 C.表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列相同 D.乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是mRNA片段 探针 乳腺细胞 口腔上皮细胞 蹄部细胞 乳铁蛋白肽基因探针 出现杂交带 未现杂交带 未现杂交带 人干扰素基因探针 出现杂交带 出现杂交带 出现杂交带 分析表格数据，乳铁蛋白肽基因探针只在乳腺细胞中出现杂交带，说明乳铁蛋白肽基因只在转基因奶牛的乳腺细胞中表达，A错误； 人干扰素基因探针在多种细胞中出现杂交带，说明其可在转基因奶牛的多种体细胞中表达，B正确； 两种基因探针所含的脱氧核苷酸的种类可能相同，但核苷酸的数量和排列顺序不一定相同，C错误； 乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是有遗传效应的DNA片段，D错误。 133 基因工程的应用与蛋白质工程 03 134 基因工程的应用与蛋白质工程 一、基因工程的应用 1.农牧业方面 转基因抗虫植物 农牧业方面的应用 转基因抗病植物 转基因抗除草剂植物 改良植物的品质 提高动物的生长速率 改良畜产品的品质 抗逆性 135 2.医药卫生领域 一、基因工程的应用 （1）对________________________进行基因改造， 使它们生产药物。 （2）让哺乳动物批量生产______。 （3）可能使建立___________工厂的设想成为现实。 微生物或动植物的细胞 药物 移植器官 抗生素≠干扰素 ①抗生素：抗细菌药物 ②干扰素：抗病毒药物 （1） 基因工程改造微生物或动植物的细胞生产药物 是人体或动物受到病毒侵染后产生的一种细胞因子，是一种具有干扰病毒复制作用的 ，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。 糖蛋白 ①传统生产方法 ②现代生产方法 干扰素基因 质粒 重组质粒 大肠杆菌或酵母菌 大量可以生产干扰素的大肠杆菌或酵母菌 构建 导入 培养 干扰素 从人血液中的白细胞提取。 137 （2）利用转基因哺乳动物批量生产药物——乳腺生物反应器 药用蛋白基因 乳腺中特异表达的基因的启动子 重组载体 哺乳动物受精卵 早期胚胎 代孕母体 转基因动物 培 养 胚胎 移植 分娩 显微注射 乳汁中含有药物蛋白 1.乳腺生物反应器指的是转基因动物的乳腺吗？ 不是，乳腺生物反应器指的就是这个转基因生物。 2.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？ 几乎所有细胞。 138 （3）用转基因动物作为器官移植的供体 利用基因工程对猪的器官进行改造，解决器官移植的来源问题。 ①猪的内脏构造、大小、血管分布与人相似； 最大的难题 猪的优点 ②猪体内隐藏的致病基因远远少于灵长类动物。 存在免疫排斥反应。 对猪器官改造的方法 ②设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术， 培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 ①在器官供体的基因组中导入某种调节因子， 以抑制抗原决定基因的表达； 139 3.食品工业方面 一、基因工程的应用 （1）概念 基因工程构建基因工程菌 工业发酵批量生产 （2）步骤 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。 （3）应用 阿斯巴甜 苯丙氨酸残基 天冬氨酸残基 利用基因工程菌，除了可以生产药物， 还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 基因工程菌 比较项目 乳腺生物反应器 基因工程菌生产药物 基因结构 基因产物 受体细胞 导入方式 生产条件 产物提取 哺乳动物基因的结构与人类结构基本相同。 细菌或酵母菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异。 与天然蛋白质完全相同。 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性。 哺乳动物的受精卵 微生物细胞 显微注射法 Ca2+处理法（感受态细胞法） 不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大。 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件。 从动物乳汁中提取，相对简单。 （一般经过工业发酵后）从微生物细胞（或发酵液）中提取，相对复杂。 乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别（在生产人的药物蛋白方面） 141 4.在其他方面的应用 一、基因工程的应用 利用经过基因改造的微生物生产清洁能源 培育可以降解多种污染物的“超级细菌”治理环境污染 142 习题巩固 B 1.运用基因工程构建的生物反应器可实现药用蛋白的批量生产，目前常用的生物反应器有“乳腺生物反应器”和“膀胱生物反应器”，其构建过程如下：构建药用蛋白基因的表达载体，并将表达载体导入动物的受精卵中，然后从这个受精卵发育而成的个体的乳汁或者尿液中提取药用蛋白。下列相关说法错误的是(　 ) A.构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子 等重组在一起 B.在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的细胞中 不含有药用蛋白基因 C.与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制 D.将表达载体导入哺乳动物的受精卵时，常采用显微注射技术 启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可用于驱动基因的转录，构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，以保证目的基因在乳腺细胞中表达，A正确； 受体细胞是动物的受精卵，所以在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的其他细胞中也含有药用蛋白基因，只是没有表达，B错误； “乳腺生物反应器”只能从哺乳期雌性个体的乳汁中获取产物，与“乳腺生物反应器”相比，“膀胱生物反应器”的优点是雌雄个体的尿液中都可提取到产物，且不受年龄的限制，因而受体来源更广泛，C正确； 将表达载体导入哺乳动物的受精卵(全能性最高)时，常采用显微注射技术，D正确。 143 2.(多选)干扰素是由淋巴 细胞产生的一种细胞因子， 在临床上常用于治疗病毒感染性疾病， 科研人员通过构建基因工程菌来生产干扰素。 下图为构建工程菌的流程图，图中质粒A上m、n分别是启动子和终止子，目的基因的b链为模板链。下列叙述错误的是(　 ) A.②过程需在b链5′端加接Nco Ⅰ的识别序列 B.①过程需要逆转录酶，RNA可从淋巴细胞中获得 C.③过程在酶的催化下有氢键形成 D.④过程常用方法为Ca2＋处理法 习题巩固 AC 转录只能从模板链的3′端开始 b链是模板链，转录只能从模板链的3′端开始，结合图中质粒上启动子和终止子的方向分析可知，应在a链5′端加接Nco Ⅰ的识别序列，b链5′端加接BamH Ⅰ的识别序列，才能保证目的基因正向插入质粒，A错误； ①过程为逆转录，该过程需要逆转录酶，干扰素由淋巴细胞产生，因此可从淋巴细胞中获得控制干扰素合成的mRNA，B正确； ③过程通过DNA连接酶将目的基因与质粒连接，该过程有氢键形成，但氢键形成无需酶的催化，C错误； ④过程是将构建的基因表达载体导入大肠杆菌(微生物)，常用方法为Ca2＋处理法，D正确。 144 基因工程的应用与蛋白质工程 二、蛋白质工程 指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 1.改造蛋白质的方法 改造或合成基因 2.蛋白质工程的基础 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 ☞第二代基因工程 145 3.基本原理 二、蛋白质工程 预期的蛋白质功能 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 获得所需蛋白质 创造出自然界不存在的蛋白质 逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反 4.蛋白质工程的应用 二、蛋白质工程 医药工业 研发药物，如延长干扰素的保存时间和速效胰岛素； 制备人鼠嵌合抗体。 其他工业 改进 的性能或开发新的工业用酶。 农业 通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量； 改造微生物 ，设计优良微生物农药，增强防治病虫害的效果。 酶 蛋白质的结构 鼠抗体 人抗体 恒定区 恒定区 可变区 可变区 嵌合抗体 对人体的不良反应减少 制备人鼠嵌合抗体 148 比较项目 蛋白质工程 基因工程 区别 过程 实质 结果 联系 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性， 以获得人类所需的 新的生物类型和生物产品 创造出自然界不存在的蛋白质 生产出自然界已有的蛋白质 ①蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶可以通过蛋白质工程进行修饰、改造 蛋白质工程与基因工程的区别和联系 149 如何确定一个操作过程是基因工程技术还是蛋白质工程技术？ 是否合成新的基因 蛋白质工程 是否对原有基因进行改造 是 否 是 否 蛋白质工程 基因工程 看蛋白质 看基因 是否为 天然蛋白质 是 否 蛋白质工程 基因工程 蛋白质工程与基因工程的区别和联系 150 习题巩固 1.对天然的蛋白质进行改造，为什么不是直接对蛋白质分子进行操作， 还是通过对基因的操作来实现的？ ①基因决定蛋白质的合成，改造基因即为改造蛋白质； ②改造基因可以遗传，改造蛋白质无法遗传； ③改造基因比改造蛋白质更容易操作。 习题巩固 A 1.蛋白质工程是基因工程的延伸，下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是(　 ) A.通过蛋白质工程改造后的蛋白质的性状不可以遗传 B.蛋白质工程和基因工程都需要构建基因表达载体 C.蛋白质工程需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具 D.蛋白质工程经常要建立蛋白质高级结构的三维模型 蛋白质工程是通过对基因进行修饰改造或重新合成，从而改造蛋白质进而改造性状，其本质是通过基因控制性状，故可遗传，A错误； 蛋白质工程是通过对基因进行修饰改造或重新合成，然后进行表达，同基因工程一样，都需要构建基因表达载体，且构建基因表达载体时需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具，B、C正确； 蛋白质工程先要根据预期蛋白质功能设计建立蛋白质高级结构的三维模型，D正确。 152 2.天然人白细胞介素-2(IL-2)是一种由133个氨基酸残基组成的多肽，该多肽含有3个半胱氨酸，其中一个半胱氨酸(Cvs125)残基以游离方式存在，另两个(Cys58和Cys105)缩合成活性所必需的二硫键，人们利用定位诱变技术将基因中编码Cvs125的碱基TGT转换成TCT或GCA，使Cvs125转换成丝氨酸或丙氨酸，不仅避免了错误配对发生，而且产生的新IL-2的生物活性不受影响，其热稳定性也得到了明显的改善。下列相关叙述正确的是(　 ) A.天然的IL-2是由白细胞分泌的具有免疫能力的抗体 B.人工改造合成新IL-2，属于蛋白质工程 C.可通过直接改造IL-2的氨基酸成为新IL-2从而改善其稳定性 D.利用定位诱变后的基因表达新IL-2的过程不遵循中心法则 习题巩固 B 白细胞介素属于免疫活性物质，不是抗体，A错误； 蛋白质工程可以生产自然界中本不存在的蛋白质，据题可知，利用定位诱变技术这一过程可以产生新的蛋白质，所以属于蛋白质工程，B正确； 蛋白质工程通过对基因修饰或基因合成间接改造蛋白质的结构从而改变其稳定性，C错误； 基因表达蛋白质的过程遵循中心法则，D错误。 153 生物技术的安全性与伦理问题 04 154 生物技术的安全性与伦理问题 155 生物技术的安全性与伦理问题 一、转基因产品的安全性 优点 缺点 ①解决粮食短缺问题； ②大大减少农药的使用量，减少环境污染； ③增加食物营养，提高附加值； ④增加食物种类，提升食物品质； ⑤提高生产效率，带动相关产业发展 ①可能出现新的过敏原或重组形成新病原微生物； ②可能产生抗除草剂的超级杂草； ③可能使疾病的传播跨越物种的界限（基因污染）； ④可能会破坏生物多样性； ⑤可能会对人类生活环境造成 二次污染。 156 外源基因通过转基因作物或家养动物扩散到其他栽培作物或自然野生物种中，并成为后者基因的一部分，在环境生物学中称为基因污染。基因污染主要是由基因重组引起的。 1.基因污染的途径 ①转基因植物的相关基因通过花粉传播而进入附近的野生植物或 邻近的非转基因农作物。 ②转基因作物在自然条件下存活并发育成为野生的、杂草化的 转基因植物。 基因污染 ③土壤微生物或动物肠道微生物吸收转基因作物后获得外源基因。 植物和微生物的生长和繁殖可能使基因污染成为一种蔓延性的灾难，而更为可怕的是，基因污染是不可逆的。 157 2.防止基因污染的方法 ①我国科学家将来自于玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉 ，因而可以防止转基因花粉的传播。 失去活性 基因污染 ②基因工程中，若将目的基因导入并整合到受体细胞的染色体DNA上，减数分裂形成的花粉中可能含有目的基因，通过传粉，可能造成基因污染。 花粉即为植物的精子，有细胞结构，所含的细胞器： 线粒体、内质网、中心体、高尔基体、核糖体等，但没有叶绿体。 可以把目的基因导入细胞质的叶绿体DNA上，避免基因污染。 158 生物技术的安全性与伦理问题 二、关注生殖性克隆人 取出 体细胞 取核 核移植 去核卵母细胞 重构胚胎 诱导 发育 移植 胚胎干细胞 诱导 各种细胞组织或器官 移植 代孕母体 分娩 克隆人 治疗性克隆 生殖性克隆 有本质区别 159 二、关注生殖性克隆人 项目 治疗性克隆 生殖性克隆 概念 利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到 的目的。 通过克隆技术产生独立生存的新个体 目的 用于生育， 产生新个体 水平 水平 个体水平 联系 都属于 生殖， 产生的新个体或新组织的核遗传物质均不发生变化。 用于医学研究或治疗疾病 无性 细胞 治疗疾病 160 3.我国对待生殖性克隆人的态度 不赞成、不允许、不支持、 不接受任何生殖性克隆人实验 四不原则 4.我国政府对治疗性克隆的态度 我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。 有效监控 严格审查 二、关注生殖性克隆人 161 生物技术的安全性与伦理问题 三、禁止生物武器 种类 ①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等； ②病毒类：天花病毒，某些动物的痘病毒、 通过基因工程改造的流感病毒等； ③___________类：肉毒杆菌毒素等。 特点 致病能力___；攻击范围___；传播途径多、范围大；成本低等 散布途径 可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 生化毒剂 强 广 162 《禁止生物武器公约》 彻底销毁生物武器是全世界爱好和平的人民的共同期望。1972年4月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁止发展、生产、储存细菌（生物）及毒素武器和销毁此种武器公约》（简称《禁止生物武器公约》），该公约于1975年3月生效。1984年11月，我国也加入了这一公约。 在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器， 并反对生物武器及其技术和设备的扩散。 三、禁止生物武器 163 习题巩固 B 1.(2023·北京高考)抗虫作物对害虫的生存产生压力，会使害虫种群抗性基因频率迅速提高，导致作物的抗虫效果逐渐减弱。为使转基因抗虫棉保持抗虫效果，农业生产上会采取一系列措施。以下措施不能实现上述目标的是(　 ) A.在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子 B.大面积种植转基因抗虫棉，并施用杀虫剂 C.转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植 D.转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带 大面积种植转基因作物并使用杀虫剂会导致不含抗性基因的害虫大量死亡，抗性基因频率会越来越高，B符合题意。 在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子；转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植；转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带等措施均会减少对害虫的杀伤力，会使一部分害虫体内的非抗性基因保留下来，有利于保持抗性基因与非抗性基因的基因频率相对稳定，使转基因抗虫棉保持抗虫效果，A、C、D不符合题意。 164 习题巩固 D 2.(2023·浙江1月选考)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是(　 ) A.试管婴儿技术应全面禁止 B.治疗性克隆不需要监控和审查 C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险 D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 试管婴儿属于有性生殖，合理范围内，试管婴儿技术是可以使用的，A错误； 治疗性克隆要在严格监管下进行，B错误； 生殖性克隆会引起严重的道德、伦理、社会和法律问题，C错误。 165 习题巩固 A 3.生物技术的发展给人类带来诸多好处的同时，也引发了许多关于生物技术安全性与伦理问题的担忧。下列观点合理的是(　 ) A.转基因生物的研究和应用均需要进行安全性评价后才能进行 B.通过试管婴儿无性生殖技术，可用于解决不孕不育问题 C.应反对一切形式的针对人类细胞的克隆研究 D.可以通过微生物改造研究生物武器，提高国防实力 转基因作为一项技术本身是中性的，由这项技术研发出来的产品需要经过一系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市，A符合题意； 试管婴儿是通过体外受精开展的有性生殖技术，B不符合题意； 一定程度内，可以对人类细胞进行克隆研究，以研究相关疾病的发生原因和治疗方法，C不符合题意； 生物武器具有致病性强、攻击范围广等特点，世界各国都应抵制，D不符合题意。 166 网络构建 THANKS 作业 完成小本，明天收 168 $$