1.2 微生物的培养技术及应用（第2课时）-【堂堂清】2024-2025学年高二生物下学期同步精品课件（2019人教版选择性必修3）

1.2.2 微生物的选择培养和计数 本节聚焦： 1.怎样运用生物与环境相适应的观点 来理解选择培养的原理？ 2.如何通过调整培养基的配方来有目 的地培养某种微生物？ 3.测定微生物数量的常用方法有哪些？ 情境导入 某研究小组想在土壤样品中分离得到能分解尿素的细菌，但是土壤中还有许多其他微生物，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现，该怎么办呢？ 稀释涂布平板法呈现的杂菌群 选择培养基 1.概念：在微生物学中，将 特定种类的微生物生长， 同时 其他种类的微生物生长的培养基。 2.原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度和pH等)， 同时 其他微生物的生长。 允许 抑制或阻止 目的菌 抑制或阻止 科学家们应用选择培养基解决了这一难题。 选择培养基·自然界中目的菌的筛选 01 【资料1】聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外进行DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 【资料2】美国黄石国家公园的热泉中有一种水生栖热菌，能在70～80℃的高温条件下生存。 水生栖热菌 如果让你寻找一种耐高温的DNA聚合酶，该如何寻找？ 思考 提示：从热泉中筛选出的 中提取出来。 水生栖热菌 思路：耐高温的酶←耐高温生物体←高温环境； 选择培养基·实验室中目的菌的筛选 01 【资料】尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 尿素分子模型 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 思考 提示：设计一种 的选择培养基， 可以将分解尿素的细菌分离出来。 尿素为唯一氮源 选择培养基·实验室中目的菌的筛选 01 尿素分子模型 怎么证明一个选择培养基具有筛选作用呢？ 思考 选择培养基 基础培养基 应设置 培养基(基础培养基)作为对照， 若基础培养基中生长的菌落数菌 该选择培养基，则该选择培养基具有筛选作用。 牛肉膏蛋白胨 多于 选择培养基·随堂小练 01 判断以下条件，可以筛选出什么微生物？ ①不加氮源,筛选出 ； ②不加碳源,筛选出 ； ③加青霉素,筛选出 ； ④加高浓度食盐,筛选出 ； ⑤高pH的生存环境,筛选出 ； ⑥70~80℃的培养温度,筛选出 ； ⑦不提供氧气的生存环境,筛选出 ； ⑧只提供石油为唯一碳源,筛选出 ； ⑨只提供纤维素为唯一碳源,筛选出 ； 水生栖热菌 石油降解菌 纤维素分解菌 耐高pH的细菌 厌氧微生物 自养型微生物 固氮菌 真菌 金黄色葡萄球菌 水生栖热菌 石油降解菌 纤维素分解菌 耐高pH的细菌 厌氧微生物 自养型微生物 固氮菌 真菌（注：抗生素能杀死细菌） 金黄色葡萄球菌 大本P12 微生物的选择培养 02 1g土壤中含有多少能分解尿素的细菌？ 选择培养基 以尿素为唯一氮源 选择培养基 稀释涂布平板法 + 对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 微生物的选择培养·稀释涂布平板法 02 具体操作：（一）系列稀释操作 90mL无菌水 ①铲取土样， 将样品装入纸袋中。 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。 铲取土样的铁铲和纸袋是否也需要灭菌？为什么？ 思考 需要；因为也会造成杂菌污染，影响实验结果。 将10g土样加入盛有90mL无菌水，代表稀释多少倍？ 思考 10倍。 微生物的选择培养·稀释涂布平板法 02 ②取1mL上清液加入盛有9mL 的试管中，依次 稀释。 90mL无菌水 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 具体操作：（一）系列稀释操作 无菌水 等比 表述： ①稀释 倍的稀释液；②稀释 的稀释液； 10n 10-n 微生物的选择培养·稀释涂布平板法 02 具体操作：（二）涂布平板操作 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在 表面。涂布时可转动培养皿,使涂布均匀。 ④将涂布器放在盛有 的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待 、涂布器 后，再进行涂布。 0.1 酒精 酒精燃尽 冷却 培养基 ③取 mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液器 注：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 →灼烧灭菌 视频·稀释涂布平板法 02 恒温培养箱 微生物的选择培养·稀释涂布平板法 02 【培养】待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ， 放入30～37 ℃的 中培养1～2 d。 在涂布有合适浓度菌液的培养基上就可以观察到分离的单菌落。 倒置 恒温培养箱 分离纯化方法：平板划线法和稀释涂布平板法 02 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化 原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面 操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 将菌液进行一系列的 , 稀释度足够高时,聚集在一起的微 生物将被分散成单个细胞。 主要 步骤 接种 工具 连续划线 梯度稀释 平板划线操作 梯度稀释和涂布平板操作 接种环 涂布器 接种环灭菌时，应将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。 涂布器灭菌时，应先将涂布器浸在酒精中，再放在火焰上灼烧，直到酒精燃尽。 分离纯化方法：平板划线法和稀释涂布平板法 02 请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 思考 不能。 请结合图片分析，稀释涂布平板法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 思考 原因：①最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数。 ②灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 原因：在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触， 可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原液中的活细菌数。 能。 微生物的数量测定·稀释涂布平板法 03 1.原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个 。 注：通过统计平板上的 ， 就能推测出样品中大约含有多少活菌。 活菌 菌落数 2.计数原则： ①一般选择菌落数为 的平板进行计数 ②在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。 30～300 3 平均值 →重复实验的目的：减小实验误差，增强实验的说服力和准确性。 107 108 √ 微生物的数量测定·稀释涂布平板法 03 【思考】 4号试管的结果表明 每克土壤中的活菌数 约为 个。 每克样品中的菌株数= 某稀释度下平板上生长的平均菌落数 涂布平板时所用的稀释液的体积 ×稀释倍数 1.1×108 101倍 102倍 103倍 104倍 105倍 平均数：110个 微生物的数量测定·稀释涂布平板法 03 通过稀释涂布平板法统计的菌落的数目 就是活菌实际数目吗？是否存在误差？ 思考 提示：统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。 原因： . 。 少 两个或多个细胞连在一起， 平板上观察到的只是一个菌落 注：统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 微生物的数量测定·显微镜直接计数法 03 1.原理： 利用特定的 板或 板， 在显微镜下观察、计数， 然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 注：统计的结果一般是 的总和。 2.特点： ，能观察微生物的形态特征。 细菌计数 血细胞计数 活菌数和死菌数 【相关信息】细菌计数板和血细胞计数板的计数原理相同。①血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 ②细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 有什么方法可以帮助我们通过 显微镜直接计数法统计活菌？ 思考 加入台盼蓝染液(活菌-无色)； 快速、直观 显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 微生物的数量测定·稀释涂布平板法和显微镜直接计数法 03 项目 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 主要用具 培养基等 显微镜、 血细胞计数板或细菌计数板等 计数依据 培养基上 的 数 . 优点 计数方便、操作简单 缺点 操作复杂、有一定误差 结果 比实际值偏 . 比实际值偏 . 菌落 计数的都是活菌 菌株本身 死菌、活菌都计数在内 小 大 微生物的选择培养与计数·判断正误P12 (1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基(　　) (2)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源(　　) (3)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量(　　) √ × NH3,NH3可作为细菌生长的氮源。 × 死菌和活菌的总数。 微生物的选择培养与计数·落实思维方法P12 1.研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　) A．a点时取样、尿素氮源培养基 B．b点时取样、角蛋白氮源培养基 C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基 D．c点时取样、角蛋白氮源培养基 D 2．如图是纯化微生物时采用的两种 接种方法接种后培养的效果图， 下列相关叙述正确的是(　　) A．图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同 B．图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数 C．图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器 D．图乙每次划线应从同一起点开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落 微生物的选择培养与计数·落实思维方法P12 B 菌落密度不同，稀释倍数应该不同，×； 稀释涂布平板法 平板划线法 图甲-涂布器，图乙-接种环，×； 图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，×； 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 提出问题 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ ①绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成 的微生物才能分解尿素。 ②利用 的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 实验原理 脲酶 尿素作为唯一氮源 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 实验设计 (1)土壤取样： ①土壤要求：酸碱度接近 且潮湿。 ②取样部位：距地表约 的土壤层。 中性 3～8cm 取样时一般要 铲去表层土 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 实验设计 (2)样品的稀释： 测定土壤中细菌的数量，一般选用 倍稀释的稀释液进行平板培养。 1×104、1×105、1×106 测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？ 思考 提示： ； 因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要 。 不相同 少 注：第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。 如：将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养， 以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 实验设计 (3)微生物的培养与观察： ①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在 ℃的温度下培养 d。 ②观察：每隔 h统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果，这样可以防止 。 另外，还需要记录菌落的特征： 包括菌落的 、 和 等。 30～37 1～2 24 菌落数目稳定 因培养时间不足而遗漏部分菌落 形状 大小 颜色 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 实验结果 未接种 以尿素为唯一氮源的选择 培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 1×104 1×105 1×106 牛肉膏蛋白胨培养基中的菌落数大于选择培养基中的菌落数，说明 . ； 该选择培养基 有筛选作用 未接种的培养基上无菌落的生长，说明： ； ； 培养基没有被杂菌污染 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 数据分析 甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 (1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果 (填“可靠”或“不可靠”)。若不可靠，应如何改进？ 。 (2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理 (填 “合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果 差别很大的情况，应 . 。 不可靠 没有重复实验（至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值） 不合理 分析实验过程中可能的影响因素， 从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？并说明理由。 思考 不一定； 因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的 代谢物进行生长繁殖。 扩展应用 04 依据以上资料，思考如何对分离得到的微生物是否是分解 尿素的细菌作进一步鉴定？ 思考 【资料1】细菌合成的脲酶将尿素分解为氨， 氨会使培养基的碱性增强，pH升高。 【资料2】酸碱指示剂 酚酞变色反应区段：8.2-10.0，无色→红色； 酚红变色反应区段：6.8-8.0 ，黄色→红色； 提示：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 ， 若菌落周围出现 ，则可说明该菌种能够分解尿素。 酚红指示剂(更灵敏) 红色环带 补充：红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越 。 强 扩展应用 04 培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应，从而达到鉴定的作用。 鉴别 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 【资料】在含有纤维素的培养基中加入刚果红,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。 原理①：刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。 原理②：地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨,其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶，分解纤维素。 扩展应用 04 培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应，从而达到鉴定的作用。 鉴别 伊红亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌 【资料】可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌。若有，菌落呈深紫色，并有金属光泽。 原理①：伊红是一种酸性染料，亚甲蓝是一种碱性染料。在酸性环境下，伊红和亚甲蓝会结合形成复合物。 原理②：大肠杆菌能分解伊红亚甲蓝培养基中的乳糖产生有机酸，使培养基的pH值降低。 根据用途划分：选择培养基和鉴别培养基 04 【旧知识回顾】培养基的作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 项目 培养基 培养基 特殊成分 加入某种化学物质 加入某种指示剂或化学药品 目的 抑制或阻止其他微生物生长， 促进目的微生物生长 与微生物的代谢物或培养基中的成分发生特定反应 用途 、 出特定微生物 不同的微生物 举例 ①培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；②用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌； ①可用伊红亚甲蓝琼脂培养基 鉴定大肠杆菌。 ②可用刚果红培养基鉴定纤维素分解菌。 选择 培养 分离 鉴别 鉴定 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数·判断正误P13 04 (1)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同(　　) (2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数 (　　) (3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据(　　) × × √ 土壤中各种微生物的数量不同，因此分离不同的微生物要采用不同的稀释度； 当两个或多个菌落连在一起时，只能观察计为一个菌落， 因此利用稀释涂布平板法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少。 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数·落实思维方法P14 04 3．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述， 不正确的是(　　) A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度 B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照 C．该实验应采用稀释涂布平板法 D．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌 后不会使酚红指示剂变红 B 接种，×； 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数·落实思维方法P14 04 4．在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是(　　) A．甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题 B．将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照， 可以证明培养基是否受到污染 C．让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致， 则可以证明甲同学无误 D．B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则 D 遵循了实验的对照原则，√； 遵循了实验的重复原则，D×； 练习与应用·书本P20 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了 一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 (1)这种培养基是一种选择培养基。 (2)利用这种石油降解菌可以降解石油,修复土壤。 (3)相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ） A.菌落中的细菌数目是固定的 B.平板上的一个菌落就是一个细菌 C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 √ √ √ D 练习与应用·书本P20 3.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官—瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。 由于瘤胃中的微生物多为 微生物，接触空气后会死亡，因此从中分离能分解尿素的微生物除了需要准备 培养基外，还应参照 的培养方法进行实验设计。 厌氧 选择 厌氧菌 练习与应用·书本P20 4.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨,其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用,使人们能够利用秸秆等生产酒精,用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时,刚果红与纤维素形成红色复合物;而当纤维素被纤维素分解菌分解后,复合物就无法形成,培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 练习与应用·书本P20 (2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌?为什么? (3)有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 提示：纤维素分解菌大多分布在 的环境中,采集土样时,可以选择纤维素丰富的环境,如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 富含纤维素 同意，这是人工创建适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 Lavf58.51.100 $$