1.2.2 微生物的选择培养和计数-2024-2025学年高二生物同步备课课件（人教版2019选择性必修3）

1.2.2微生物的选择技术与培养 【从社会中来】 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。 如何从自然界中分离出需要的特定微生物？ 1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 耐高温的酶？ 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 美国黄石公园 1973年，科学家在美国黄石国家公园的热泉中筛选出耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。 (1)筛选原因： 水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 (2)启示： 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 一、选择培养基 实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理：即人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 2.实验室中微生物的筛选原理： 耐热微生物 耐寒微生物 石油分解菌 被石油污染的土壤 冰川冻土层 温泉 3.选择培养基： 选择培养基类型 （1）改变培养条件。 70～80℃的高温 分离耐高温的水生栖热菌 使用将pH调至酸性的培养基 分离耐酸菌 （2）改变培养基中的营养成分。 不加碳源（含碳有机物）的培养基 不加氮源的培养基 分离出固氮菌 分离出自养型微生物 （3）添加某种化学物质。 加入青霉素 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基 分离得到金黄色葡萄球菌（耐盐） 培养基中加氨苄青霉素 具有抗氨苄青霉素能力的菌落 长出各种各样的细菌 选 择 培 养 基 培养基+氨苄青霉素 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 培养基 选择培养基配方的设计 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。 讨论1：如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 在选择培养基中，用尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 【思考·讨论】 CO(NH2)2 ＋H20 脲酶 + CO2 2NH3 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 培养基二 讨论2：该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ ①从物理性质来讲，两者属于 培养基； ②从用途上来讲，培养基二属于 培养基， 目的是为了获得 ； ③两种培养基共有的培养基成分 有： ； 培养基一的碳源主要为 ， 氮源主要为 ； 培养基二的碳源主要为 ， 氮源为 。 固体 选择 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 如何证明一个选择培养基具有选择性？ 设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 那么1g土壤中有多少能分解尿素的细菌呢？ 研究课题：1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得能分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 通过对土样进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。 二、微生物的选择培养 方法: 稀释涂布平板法 原理: 主要过程: ①梯度稀释菌液 ②涂布平板 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 （1）梯度稀释菌液 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g 微量 移液器 （2）涂布平板 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 稀释涂布平板操作后分离得到单菌落 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 恒温培养箱 （3）培养与观察 （1）计数原理 当样品的稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约含有多少活菌。 （三）微生物的数量测定 1.间接计数法——稀释涂布平板法 （2）计数原则 2.同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，求平均值（要分析3个重复值得差值大小） 1.选择30-300个菌落的平板进行计数。 3.统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。 4.统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键 1.间接计数法——稀释涂布平板法 （2）计数原则 重复实验，减少误差 4.计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) M：代表稀释倍数 每克样品中的菌株数＝ ×稀释倍数 例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ 1.间接计数法——稀释涂布平板法 （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 1.某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 请评价这两位同学的实验结果的有效性： 1.甲同学____________________________________； 原因是_______________________________________。 2.乙同学____________________________________； 原因是________________________________________________________________。 实验操作不合理 没有设置重复组，结果不具有说服力 结果计算不合理 第1个平板的计数结果与另外两个相差太远，因此不能对这三个平板的计数值求取平取值 【现学现用】 利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数然后再计算一定容积里样品中微生物的数量。 血细胞计数板常用于 等的计数； 细菌计数板可对 进行观察和计数。 相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子 细菌等较小的细胞 2.优点： 1.原理： 快速直观 3.缺点： ①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 2.直接计数法——显微镜直接计数法 ②不适于对运动细菌的计数。 用台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较 项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、 等 培养基等 计数依据 培养基上的 数 优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌 缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差 血细胞计数板 细菌计数板 菌落 菌株本身 主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法 主要步骤 接种工具 能否用 于计数 计数 计数，但是操作 复杂，需涂布多个平板 共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征。 不能 可以 接种环 涂布器 接种环在固体培养基 表面连续划线 系列梯度稀释操作 和涂布平板操作 稀释涂布平板法和平板划线法的比较 【探究 实践】 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 1.实验目的： 2.实验原理： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能 合成 的微生物才能分解尿素。 利用以尿素作 的选择培养基，可以从土壤中分离出 的细菌。 脲酶 唯一氮源 分解尿素 ①提供无机盐； ②调节pH。 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的取样袋中。 3.操作步骤: （1）土壤取样 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 注意 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 （2）样品的稀释与涂布平板 思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 ①每个浓度至少设置4个平板 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 设置2个平板作为对照： 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 如何验证培养基中是否含有杂菌？ 每个倍数稀释液设置涂布几个平板? ①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 ②观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。 ③结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 因培养时间不足而导致菌落数目遗漏 24h 菌落数目稳定 注意事项： 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等； （3）微生物的培养与观察 目的 现象 结论 是否有杂菌污染的判断 未被杂菌污染 培养物中混入其他杂菌 选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目______选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 对照组的培养基中无菌落生长 大于 思考：得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。 （4）结果分析与评价 对照组的培养基中有菌落生长 1.下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的描述,不正确的是( ) A.利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法,其缺点是不能区分死菌与活菌 B.两种计数方法,其统计值与实际值相比,均有差异,但差异原因不同 C.两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征 D.当菌落数目稳定时,一般选取菌落数在30~300的平板进行计数 C 【现学现用】 2. 图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是 ( ) A.图甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂布菌液 B.对于浓度较高的菌液，若图甲中的最高稀释倍数仅为102，则所得到的菌落不一定是由单一的细胞繁殖而成的 C.图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落 D.图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端(除第一次划线外) C 3．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数” 实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是( 　　) A．3号试管的稀释倍数为103倍 B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍 C．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多 D．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个 D 土壤中分解尿素的细菌的鉴定 CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 1.原理： 2.方法： 呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。 可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况； 固体培养基： ——鉴别培养基 鉴定培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 伊红-美蓝培养基鉴别大肠杆菌 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） 2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ） A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 √ √ √ D 【练习与应用】 一、概念检测 二、拓展应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 （1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌，请你给出详细的实验方案。 用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 富含纤维素的环境 如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等 （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的适宜环境，纤维素分解菌会在滤纸上聚集。就可以从腐烂的滤纸上筛选出纤维素分解菌。 透明圈直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 $$