1.2.1 微生物的培养技术及应用-2024-2025学年高二生物同步备课课件（人教版2019选择性必修3）

1.2.1微生物的培养技术及应用 向经过杀菌处理的牛奶中添加对人体有益的乳酸菌，再经过发酵就可以制成酸奶，在家里自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。 怎样才能保证无处不在的 杂菌 不混入发酵物中呢？ 讨论： （微生物） 应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。 从生活中来 1.什么是微生物？ 难以用肉眼观察的微小生物的统称。 无细胞结构的病毒 原核细胞 真核细胞 真菌、原生生物等 微生物的类群 新冠病毒、噬菌体等 细菌、放线菌等 本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。 一、微生物的培养技术 3.实验室培养微生物基本要求： 2.研究和应用微生物的前提（发酵工程的重要基础）是： 、 。 防止杂菌污染 获得纯净的微生物培养物 (1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件 (2）确保其它微生物无法混入 (3)并将需要的微生物分离出来 培养基 无菌技术 纯化培养 被污染的培养基 高压蒸汽灭菌锅 （一）培养基的配制 1.什么是培养基？ 2.培养基的用途有哪些？培养基的种类有哪些？ 3.培养基的必备营养成分有哪些？ 4.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。 【自主探究】请同学们阅读教材P9-10完成以下问题： 人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其___________的营养基质。 固体培养基 营养物质 生长繁殖 培养、分离、鉴定、保存 积累其代谢物 （1）按物理性质分为： 液体培养基、固体培养基 微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落 （扩大培养、工业生产） （分离、计数、鉴定、菌种保存等） 加入凝固剂(如琼脂) 是一种从红藻中提取的多糖。在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常规培养条件下呈固态。 注意：凝固剂（如琼脂），不能给微生物提供能量，只起到凝固作用。 1.概念： 2.作用： 用以 微生物或 。 3.类型： （一）培养基的配制 液体培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用以鉴别不同种类的微生物。 （2）按功能/用途分为： 3.类型： 选择培养基、鉴别培养基 ①选择培养基 在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。 ②鉴别培养基 （3）按化学成分分为： 天然培养基、合成培养基 ①天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 ②合成培养基 培养基化学成分明确 各种培养基的配方不同，但一般都含有水、 无机盐、碳源和氮源等营养物质。 ①概念： （1）碳源 ②种类： 凡是能提供碳元素的物质，统称为碳源 无机碳源 有机碳源 CO2、CO32-、HCO3-等含碳无机物 牛肉膏、蛋白胨、糖类、脂质、蛋白质、石油等含碳有机物 ③功能： 主要用于构成细胞物质和一些代谢产物 4.培养基的营养构成: 自养微生物 异养微生物 【注意】含有C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。 ①概念： （2）氮源 ②种类： ③功能： 凡是能提供氮元素的物质，统称为氮源 无机氮源 有机氮源 主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等 NH4＋、NO3-、NH3等 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。 （3）水 （4）无机盐 ①良好的溶剂； ②维持生物大分子结构的稳定。 ①提供无机营养； ②调节pH； ③维持渗透压。 ④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。 ①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ； ②培养霉菌时，需要将培养基调至 ； ③培养细菌时，需要将培养基调至 ； 维生素 酸性 中性或弱碱性 无氧 （5）特殊条件： pH、O2和特殊营养物质 主要指生长因子，例：维生素、碱基、嘌呤、嘧啶、胺类等。 培养基的配制原则 目的要明确；营养要协调；pH要适宜。 思考：所有微生物是否都可以用培养基进行培养? 否。病毒是没有细胞结构的微生物，必须在活细胞内寄生并以复制的方式增殖，因此不能用培养基进行培养。 培养基组分及含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g 琼脂 20g NaCl 5g H2O 定容至1000ml 某种常见的细菌培养基——1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等 碳源、氮源和维生素等 无机盐 水 又称肉汤培养基，用于培养细菌 凝固剂 几种微生物的营养和能量来源分析 微生物 碳源 氮源 能源 蓝细菌 CO2 NH4＋、NO3-等 光能 硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化 根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物 大肠杆菌 糖类、蛋白质 等有机物 蛋白质等 有机物 用无碳培养基可以筛选培养什么微生物？ 用无氮培养基可以筛选培养什么微生物？ 自养微生物 固氮微生物 1.下列有关培养基的叙述，正确的是（ ） A.微生物的培养都需要提供水、碳源、氮源、无机盐，缺一不可 B.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌 C.培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性 D.培养基只能培养细菌 C 如:固氮菌，其能够利用空气中的氮气，作为氮源 形成肉眼可见的菌落 还能培养真菌 【现学现用】 2.关于微生物的营养，下列说法正确的是（ ） A.同一种物质不可能既作碳源又作氮源 B.凡是碳源都能提供能量 C.除水以外的无机物仅提供无机盐 D.无机氮源也可能提供能量 D 牛肉膏和蛋白胨既既作碳源又作氮源 CO2、CO32-、HCO3-等无机碳源 CO2可以为自养微生物提供碳源 （二）无 菌 技 术 无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括： 消毒 灭菌 获得纯净的微生物培养物的关键是： 防止杂菌污染。 使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 ①煮沸消毒法 ②巴氏消毒法 1. 消毒： 100℃煮沸5~6min，可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。 62~65℃煮30min或72~76℃下处理15S或80~85℃处理10~15S，适合不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。 操作的空间、操作者的衣着和手 ③化学药物消毒法 ④紫外线消毒 用70-75%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。 对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。 在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。 生物消毒法：指利用微生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。 例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。 用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。 某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的抗逆性强的休眠体。芽孢萌发可形成细菌体。 芽 孢 孢子 2. 灭菌: 细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的生殖细胞，能直接发育成新个体。 芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。 用于培养微生物的器皿、接种用具和培养基 实验室：高压蒸汽灭菌锅，100kPa、121℃条件下维持15～30min。 ①湿热灭菌法 【原理】： 高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。 【优点】： 操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的微生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。 基本保持培养基的营养成分不被破坏。 【对象】： 培养基等 注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。 （利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌） 2. 灭菌: 干热灭菌箱内160～170 ℃下加热2～3h。 ②干热灭菌法 【原理】： 使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等。 【对象】： 耐高温，需保持干燥的物品，如： 玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器) 金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等) 2. 灭菌: 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 ③灼烧灭菌法 【效果】： 迅速、彻底 【对象】： 接种的金属工具如涂布器、接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。 【原理】： 使微生物燃烧 2. 灭菌: 不耐高温的液体（牛奶） 接种室、超净工作台 培养皿、吸管等玻璃器皿耐高温、需保持干燥的物品 接种环等金属工具 实验操作者的双手 培养基 家庭餐具等生活用品消毒 a.煮沸消毒法 b.巴氏消毒法 c.化学药剂消毒 d.紫外线消毒 e.灼烧灭菌 f.干热灭菌 g.高压蒸汽灭菌 1.将以下器具、物品或对象与所采用的消毒或灭菌方法连线 【现学现用】 3. 下列操作能达到灭菌目的的是(　　) A.用免洗酒精凝胶擦手 B.制作泡菜前用开水烫洗容器 C.在火焰上灼烧接种环 D.防疫期间用石炭酸喷洒教室 2. 下列有关无菌技术的说法，正确的是(　　) A．无菌技术的关键是杀灭实验室中的所有的微生物 B．培养微生物的试剂和器具都要进行湿热灭菌 C．经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，不能常温长期保存 D．无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌 C C 概念 1.培养物： 3.纯培养： 2.纯培养物： 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 获得纯培养物的过程就是纯培养。 纯培养步骤： （1）配制培养基 （2）灭菌(培养基和器具） （3）倒平板 （4）接种和分离 （5）恒温箱中培养 （三）微生物的纯培养 【探究 实践】 酵母菌的纯培养 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。 (1)菌落： 1. 原理： 微生物群 分散或稀释 单个细胞 单个菌落 繁殖 念珠菌显色培养基 大肠杆菌培养基 酵母菌培养基 金黄色葡萄球菌和 枯草杆菌培养基 (2)单菌落： 一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 鉴别菌种：菌落的大小、形状、颜色、透明度、光泽度等是鉴定菌种的重要依据。 【探究 实践】 酵母菌的纯培养 1. 原理： 微生物群 分散或稀释 单个细胞 单个菌落 繁殖 (3)获得单菌落的方法： 稀释涂布平板法 平板划线法 平板划线法和稀释涂布平板法 2. 实验目的 ① 学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板 ② 学会进行无菌操作 ③ 尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落 3. 材料用具 ①酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水 ②天平，小刀，纱布，烧杯，锥形瓶，棉塞、牛皮纸（或报纸） ③皮筋，培养皿，接种环，酒精灯，超净工作台 ④高压蒸汽灭菌锅，干热灭菌箱和恒温培养箱等 称取去皮的马铃薯200g 切成小块 加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂。 用纱布过滤 得到滤液 滤液中加入20g葡萄糖，15~20g琼脂。 用蒸馏水定容至1000mL 4.实验方法步骤： 配制培养基 4.实验方法步骤： 配制培养基 灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞。 包上牛皮纸， 并用皮筋勒紧。 压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15 ~ 30min。 取5 ~ 8套培养皿 培养皿叠成一束 用几层牛皮纸包紧 放入干热灭菌箱内，160 ~ 170℃灭菌2h。 培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。 倒平板： 1 拔出锥形瓶的棉塞。 3 用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿（10～20mL），立即盖上皿盖。 4 等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。 2 将瓶口迅速通过火焰。 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基 不能完全打开，以免杂菌污染培养基 防止皿盖上冷凝水落入培养基造成污染。 4.实验方法步骤： 配制培养基 灭菌 倒平板 4.实验方法步骤： 配制培养基 灭菌 倒平板 如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成后，灭菌之前进行操作。 1. 培养基pH要适宜，调pH是在灭菌前还是灭菌后？ 问题思考与分析： 2. 怎么确定所倒平板未被杂菌污染？ 将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。 3. 在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 【例】倒平板是制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的重要环节，如图为倒平板的操作示意图。 （1）请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程： 。 （2）甲、乙、丙中的灭菌方法是 。 （3）丁中的操作需要等待 才能进行。 丙→乙→甲→丁 灼烧灭菌 平板冷却凝固 4.实验方法步骤： 接种和分离酵母菌 ——平板划线法 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 连续划线法 分区划线法 ①灼烧接种环，直至金属丝烧红 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞。 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ③试管口通过火焰 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 ⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。 防止温度太高杀死菌种 接种和分离酵母菌 4.实验方法步骤： ——平板划线法 4.实验方法步骤： 接种和分离酵母菌 ——平板划线法 第1次划线 灼烧接种环灭菌 第2次划线 灼烧接种环灭菌 第3次划线 灼烧接种环灭菌 灼烧接种环灭菌 1 2 3 4 5 ①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次； ②划线首尾不能相接； ③每次划线前灼烧接种环进行灭菌； ④划线操作结束后，仍需灼烧接种环，培养皿倒置培养。 分区划线法 【平板划线法注意事项】 灼烧时期 目的 取菌种前 每次划线前 接种结束后 【问题探究1】为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞 杀死接种环上原有微生物 接种环共需灼烧几次？ 6次 【问题探究2】在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是？ 能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单 细胞繁殖而来的菌落。 【问题探究3】为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？ 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，达不到纯化的效果。 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）左右的恒温培养箱中培养24-28h。 划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照） 若该培养皿无菌落说明培养基没有污染；若有菌落生长，则说明培养基被污染或者灭菌不彻底。 4.实验方法步骤： 培养酵母菌 在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 警示 酵母菌的纯培养 2.接种和分离酵母菌 1.制备培养基 3.培养酵母菌 ①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水） ②灭菌 ③倒平板（在酒精灯火焰附近操作） 培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅） 培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅） 用接种环在固体培养基上用平板划线法接种 平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养 酵母菌纯培养小结 （1）倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置 （　 　） （2）倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 （　 　） （3）若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用 （ 　　） （4）为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 （ 　 ） （5）平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧 （　 　） （6）培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异 （　 　） 1.易错辨析 【现学现用】 2.下列关于平板划线的操作，正确的是（ ） A. 每次划线前都要蘸取菌液 B. 灼烧接种环后，要立即用接种环接种 C. 平板划线操作时划出了五个区域菌落数逐渐增多 D. 接种前，要将菌种试管口通过火焰 D 3. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为210 r/min、 230 r/min和 250r/min，培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。 (1) 摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？ 意味着培养液中O2含量不同。 (2) 从图中数据你可以得出什么结论？其原因是什么？ 培养液中O2含量越高，酵母菌种群密度越大。 (3) 为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定？ 这时候已经达到了环境容纳量。 $$