专题5 第16讲 基因工程的基本工具和操作程序 （课件）-【步步高】2024年新高考生物考前三个月（粤渝闽鄂京津琼黑晋皖云新赣甘豫桂贵）

专题五　生物技术与工程 第16讲 基因工程的基本工具和操作程序 内容索引 基因工程的操作流程及应用 限制酶的选择和标记基因筛选原理 预测演练 考点1 考点2 1.(2022·河北，24改编)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPinlA)的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题： (1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是____________________________________ ______________________________。 典例示范 考点1　基因工程的操作流程及应用 调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不 能正常消化食物达到抗虫的目的 PART ONE (2)____________________是实施基因工程的核心，目的是____________ ________________________________________________________________________________。 (3)将抗虫基因转入植物体内时，除了采用我国科学家独创的__________ ______，还经常采用____________法，使用该方法时，必须将目的基因插入质粒的__________上，才能使目的基因转移到受体细胞并将其整合到该细胞的____________上，此方法的不足之处是___________________ ________。 (4)为了检测目的基因在受体细胞中是否稳定表达，在分子水平上的检测方法为____________________。 基因表达载体的构建 使目的基因 在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用 花粉管通 道法 农杆菌转化 T－DNA 染色体DNA 该方法不适用于单子 叶植物 抗原－抗体杂交技术 (5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的__________以鉴定其抗性程度。如图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析______________(填“NaPI”“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”)转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是__________ __________________________________________________。 接种实验 NaPI＋StPinlA 饲喂NaPI＋ StPinlA转基因棉花的虫体质量最小、且每株棉铃数最多 (6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生__________。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是_______________________________ _________________________________________________________________________________________________________________ _________(写出两点即可)。 (7)生产上常将获得的转基因抗虫棉与普通棉花混合播种，其目的是______________________________________。 定向改变 由于害虫发生基因突变后，在胰蛋 白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂 降低害虫种群中抗性基因频率的增长速率 应用提炼 1.基因工程中的4个“3” (1)基因工程的3种基本工具 ①限制性内切核酸酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。 ②DNA连接酶：E.coli DNA连接酶只能连接互补的黏性末端；T4 DNA连接酶能连接互补的黏性末端和平末端。 ③载体需具备的条件包括： a.能在宿主细胞内稳定存在并大量复制； b.有一个至多个限制酶切割位点； c.具有特殊的标记基因，以便对含目的基因的受体细胞进行筛选。 (2)获取目的基因的3条途径 ①从基因文库中获取； ②利用PCR技术扩增； ③用化学方法直接人工合成。 (3)将目的基因导入受体细胞的3种类型 ①植物：体细胞或受精卵——常用农杆菌转化法(双子叶植物和裸子植物)、花粉管通道法。 ②动物：受精卵——显微注射法。 ③微生物：细菌(常用大肠杆菌)——钙离子处理法。 (4)目的基因的检测与鉴定，分子水平检测的3个方面 ①检测目的基因是否插入到转基因生物的DNA上：PCR等技术。 ②检测目的基因是否转录出mRNA：PCR等技术。 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。 2.基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建 (1)启动子和终止子 启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。 终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。 (2)目的基因插入位置：启动子与终止子之间。 (3)启动子具有物种特异性和组织特异性，例如用乳腺生物反应器生产药用蛋白的时候，将药用蛋白基因连接在乳腺蛋白基因的启动子下游。 (4)为防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。 对点精练 1.(2021·河北，24节选)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。 回答下列问题： (1)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是________ ____________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是__________________________。 DNA连接酶 限制酶和 便于目的基因的检测和鉴定 (2)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是______________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______ ________________________。 农杆菌转化法 避免目 的基因在自然界中的扩散 (3)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型相比，转基因植株对Cd具有更强的______(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 耐性 茎、叶 (4)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________ ________________________________________________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________________________________________________________________________________________________________(写出两点即可)。 YCF1可通过主动运输 将镉离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用 2.(2023·梧州高三期末)基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失，从而使部分功能被屏蔽的技术。来源于λ噬菌体的Red同源重组系统由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM3种蛋白质，可用于大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30 ℃培养时可以正常复制，而高于37 ℃时会自动丢失；由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L－阿拉伯糖诱导表达。λ－Red系统介导的基因敲除过程如图所示。请回答下列问题： (1)EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，从5′端向3′端降解DNA单链，产生_____(填“3′”或“5′”)黏性末端；BET结合在EXO外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而_____ (填“抑制”或“促进”)受体细胞对外源DNA的降解。 3′ 抑制 (2)要将pKD46导入大肠杆菌，首先需用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是_________________ __________________________。为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必须满足的培养条件是_________________ ___________________________________。 过程Ⅰ是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，说明_________ _______________________________________________。 使其处于能吸收周 围环境中DNA分子的生理状态 培养温度为30 ℃ (或低于37 ℃)，培养基中含L－阿拉伯糖 大肠杆菌 不含青霉素抗性基因，pKD46中含青霉素抗性基因 用Ca2＋处理大肠杆菌，使大肠杆菌利于吸收外界环境中DNA分子，据题中信息知，为使pKD46在大肠杆菌内正常复制，培养温度应为30 ℃，为使Red重组酶正常合成，培养基中应含有L－阿拉伯糖。过程Ⅰ是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，这说明实验所用的大肠杆菌不含青霉素抗性基因(或在含青霉素的培养基中不能存活)且pKD46质粒含有青霉素抗性基因。 (3)用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因时，同时需考虑将大肠杆菌基因组DNA上特定靶基因敲除。图中含HA1的引物由两部分组成，其中HA1的碱基序列应该与_______ _____的碱基序列相同，另一部分应该与_________________________相应链上的碱基互补。 靶基因 外侧 卡那霉素抗性基因(NPT Ⅱ) 据图分析可知，将获得的线性DNA片段导入大肠杆菌，通过同源重组将大肠杆菌基因组DNA上的特定靶基因敲除，所以图中含HA1的引物由两部分组成，其中HA1的碱基序列应该与靶基因外侧的碱基序列相同，另一部分应该与卡那霉素抗性基因相应链上的碱基互补。 (4)为筛选出同源重组成功的大肠杆菌(靶基因被敲除)，过程Ⅱ使用的培养基必须含有__________，然后再通过在__________条件下培养，把质粒pKD46除去。 卡那霉素 高于37 ℃ 考点2　限制酶的选择和标记基因筛选原理 2.(2023·重庆高三月考)图1和图2是基因工程中用到的含目的基因的DNA和质粒及相关限制酶的酶切位点等，图1中“ ”表示目的基因转录的方向。已知限制酶BamHⅠ、BclⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓GATCC、T↓GATCA、A↓AGCTT、G↓AATTC、C↓AATTG。回答下列问题： 典例示范 PART TWO (1)基因工程的四步程序包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、________________________和目的基因的检测与鉴定。其中构建基因表达载体时，所用载体应具备的条件有：_________________________ _____________________________(答出两点即可)。常用的载体除了质粒以外，还有______________________(答出两点即可)。 将目的基因导入受体细胞 能自我复制，具有标记基因， 具有一个或多个限制酶切割位点 噬菌体、动植物病毒等 (2)图2中，启动子的作用：_______________________________________ __________。 是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录 出mRNA (3)将图1和图2中的DNA拼接成重组质粒时，若只选择一种限制酶，则应选用________来切割。有人将图2所示的质粒载体用该限制酶酶切后，与用该酶酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。 Hind Ⅲ 被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。如果用含有四环素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_____________________________ _____________________；并且_____________和_____________________ _________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________ _________________________。 二者均不含有四环素抗性基因， 在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的 重组质粒 二者均含有四环素抗性基 因，在该培养基上均能生长 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有________的固体培养基，在此培养基中________(填“能”或“不能”)生长的为目的菌落。 青霉素 不能 (4)为防止质粒和目的基因的自身环化、目的基因与载体的反向连接，以及提高实验的成功率，应选用限制酶________________切割质粒，选用限制酶________________切割含目的基因的DNA片段。 MfeⅠ和BamHⅠ EcoRⅠ和BclⅠ 应用提炼 1.图解限制酶的选择原则 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 2.标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 对点精练 3.幽门螺旋杆菌(Hp)是慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤的主要致病菌，该菌的Ipp20基因能合成其特有的蛋白质，据此，研究者利用基因工程制备Hp疫苗。已知Ipp20基因表达时，双链DNA的一条链是编码链，另一条链是模板链，如图1； 4种限制酶及其识别序列如图2；3种质粒如图3，箭头表示限制酶的切割位点；操作步骤如图4。 请回答下列问题： (1)Ipp20基因终止子序列位于图1中的___________区段，该基因转录时，编码起始密码子的序列位于图1中的________区段。 非编码区2 编码区 在真核细胞的基因结构中，包括编码区和非编码区，其中编码区又分为外显子和内含子，启动子和终止子都是一段特殊的DNA序列，属于基因的非编码区，分别位于编码区的上游和下游，所以终止子位于非编码区2，Ipp20基因转录时，起始密码子位于编码区内，紧接着5′端。 (2)转录产生的mRNA前8个碱基序列为______________(方向为5′→3′)。若通过PCR技术大量扩增Ipp20基因的编码区段，则需要设计一对引物，其中结合到编码链上的引物序列是______________(方向为5′→3′，写出5′端8个碱基序列)。 CUCGAGAU TCTAGAGG 根据碱基互补配对的原则，转录产生的mRNA与模板链互补，所以mRNA前8个碱基序列为5′CUCGAGAU3′，利用PCR技术扩增Ipp20基因的编码区段时，设计引物序列的主要依据是其基因编码区两端的部分核苷酸序列，按照碱基互补配对原则，与已知链对应的应为5′TCTAGAGG3′。 (3)据图1、2、3分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是_______ ______，利用所选限制酶进行操作的优势是_________________________ _______________________________________________。最适合用作载体的质粒是_______。 XbaⅠ、 XhoⅠ 防止酶切后的质粒自身环 化，保证酶切后的质粒和Ipp20基因按正确方向连接 质粒Z 基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等，选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，且不破坏目的基因和标记基因，图3中质粒X上Xho Ⅰ的酶切位点会破坏终止子，质粒Y上XhoⅠ和XbaⅠ的酶切位点会破坏两个抗性基因，质粒Z 上XhoⅠ和XbaⅠ酶切后会保留一个标记基因，且黏性末端不同，可避免质粒的自身环化和随意连接，故适合作载体。 (4)图4中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法(使用无菌的线毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如图所示)。培养基A、B中应分别添加________________，符合实验要求的菌落是______(填写数字)，判断依据是_____________________ _______________________________________________________________________________________________ ________________________________ ________________________________ _______。 氯霉素、潮霉素 3、5 用两种限制酶对质粒Z 进行切割时，因插入目的基因而丢失了潮霉素抗性基因，但不会破坏氯霉素抗性基因，因此导入重组质粒的 大肠杆菌能在含有氯霉素的培养基上 生长，但不能在含有潮霉素的培养基 上生长 为筛选出含有目的基因的大肠杆 菌，培养基A、B中应分别添加氯 霉素和潮霉素，符合要求的菌落 应该能在含有氯霉素的培养基上 生长，但不能在含有潮霉素的培养基上生长，故符合要求的菌落是3、5，判断依据是用XhoⅠ和XbaⅠ两种限制酶对质粒Z进行切割时，因插入目的基因而丢失了潮霉素抗性基因，但不会破坏氯霉素抗性基因，因此导入重组质粒的大肠杆菌能在含有氯霉素的培养基上生长，但不能在含有潮霉素的培养基上生长。 4.(2023·郑州高三期末)人血清白蛋白(HSA)主要在肝脏中合成，具有重要的医用价值。为制备大量的HSA，以基因工程技术获取重组HSA的两条途径如图1所示； 图2中的甲为获取的含有目的基因(HSA基因)的DNA片段，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的酶切位点；乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；丙是Ti质粒结构示意图。回答下列问题： (1)从人体细胞中直接提取的HSA基因，导入到大肠杆菌细胞中不能表达，原因可能是_____________________________________________________ ___________________________________________________________________________。为了获得能在大肠杆菌细胞中表达的HSA基因，可从人体的______细胞中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA(双链)，再利用PCR进行扩增，该过程需向反应体系中加入___________、____________ ____________、4种脱氧核苷酸、引物和Mg2＋，若扩增后得到了32个HSA基因，则该过程共需要________个引物。 真核基因启动子不能被原核RNA聚合酶识别，不能正确起始转录，且从真核基因组克隆的基因含有内含子，大肠杆菌中没有转录后剪接系统 肝脏 模板DNA 耐高温的 DNA聚合酶 62 人体细胞为真核细胞，大肠杆菌为原核细胞，由于真核基因启动子不能被原核RNA聚合酶识别，转录不能正确起始，且从真核基因组克隆的基因含有内含子，大肠杆菌中没有转录后剪接系统，故从人体细胞中直接提取的HSA基因，导入到大肠杆菌细胞中不能表达。 人血清白蛋白(HSA)主要在肝脏中合成，为了获得能在大肠杆菌中表达的HSA基因，可从人体的肝脏细胞中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA(双链)，PCR反应体系的主要成分应该包含：4种脱氧核苷酸、引物、Mg2＋、模板DNA、耐高温的DNA聚合酶。 若扩增后得到了32个HSA基因，则该过程共需要32×2－2＝62(个)引物。 (2)构建基因表达载体时，不能选择限制酶Sau3AⅠ切割目的基因，原因是_________________________________，为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应选择限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ切割质粒，选择限制酶_________________充分切割目的基因，质粒上抗生素抗性基因的作用是____________________________。 限制酶Sau3AⅠ切割会破坏目的基因 BamHⅠ、EcoRⅠ 对目的基因是否导入进行检测 限制酶Sau3AⅠ切割会破坏目的基因，故不能选择限制酶Sau3AⅠ切割目的基因。为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应该选择Sau3AⅠ、EcoRⅠ切割质粒。Sau3AⅠ和BamHⅠ的黏性末端相同，故采用BamHⅠ、EcoRⅠ充 分切割目的基因。质粒上抗 生素抗性基因的主要作用是 对目的基因是否导入进行检测。 (3)将目的基因导入大肠杆菌时，常用______处理细胞。为了检测水稻胚乳细胞中是否合成了HSA蛋白，可用_______________方法；若胚乳细胞中含有HSA基因，但是检测不到HSA蛋白，原因可能是_______________ ____________________________________________________。 Ca2＋ 抗原—抗体杂交 目的基因前后的 启动子和终止子设计不理想，导致目的基因不能正常表达 将目的基因导入大肠杆菌时，常用Ca2＋处理细胞；为了检测水稻胚乳细胞中是否合成了HSA蛋白，可采用抗原—抗体杂交的方法，若胚乳细胞中含有HSA基因，但是检测不到HSA蛋白，这是由于HSA基因不能正常表达，可能的原因是目的基因前后的启动子和终止子设计不理想，导致目的基因不能正常表达。 1.(2023·黄冈高三期末)甜玉米与普通玉米相比，甜玉米中可溶性糖向淀粉的转化较慢，含可溶性糖量高，汁多质脆，富含多种维生素。为了使甜玉米更富有生产应用价值，科研人员通过转基因技术培育出了超量表达P蛋白转基因甜玉米。 1 2 3 4 5 预测演练 PART THREE 在超量表达P基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示，P蛋白在玉米株系的表达量如图2所示。请回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)组成强启动子的基本单位是____________，它驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用_______________酶组合，将DNA片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。 1 2 3 4 5 脱氧核苷酸 BamHⅠ和SacⅠ 1 2 3 4 5 启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，因此，组成强启动子的基本单位是脱氧核苷酸。为使P基因在玉米植株中超量表达，同时要确保强启动子和P基因不被破坏，由图1可知，应优先选用BamHⅠ和SacⅠ酶组合，将DNA片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。 (2)将外植体经__________后形成的玉米愈伤组织放入农杆菌液浸泡后进行植物组织培养，培养基中需加入__________进行筛选，最终获得多个玉米株系a1、a2、a3、a4。对a1、a2、a3、a4四株甜玉米株系的蛋白质表达量进行测定，结果如图2，______(填“能”或“不能”)说明a4株系未导入重组质粒，原因是_____________________________________________ _________________________________________。 1 2 3 4 5 脱分化 潮霉素 不能 a4株系玉米中P蛋白相对表达量与野生型玉米的相 同，可能导入的目的基因未表达(转录或翻译) 1 2 3 4 5 外植体经脱分化形成愈伤组织。由图1可知，潮霉素抗性基因属于基因工程中的标记基因，且位于质粒的T－DNA上，随T－DNA整合到玉米细胞的染色体上，因此将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选。 (3)真核基因的编码区含有内含子和外显子，如图3为淀粉酶合成基因片段，其转录后形成的前体RNA需通过剪接(切去内含子对应序列)和加工后方能用于翻译。 1 2 3 4 5 科研人员通过降低调控淀粉酶合成基因的表达实现提高甜玉米中可溶性糖的含量，吗啉反义寡核苷是RNA剪接抑制剂，注入植物细胞内会使基因表达受阻。 为验证吗啉反义寡核苷能阻止前体RNA上内含子1的对应序列被剪切，科研人员将吗啉反义寡核苷导入玉米的受精卵作为实验组，设计相关实验，请完成下列表格： 1 2 3 4 5 操作流程 操作方法或操作要点 获取cDNA 从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA，①________形成cDNA 扩增cDNA 以获得的cDNA为模板进行PCR时需加入的引物是②_____ _________ 逆转录 引物2 和引物4 1 2 3 4 5 操作流程 操作方法或操作要点 产物鉴定 用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定PCR扩增后获得的产物 分析结果， 得出结论 实验组有目的条带，对照组无目的条带，说明③________ _______________________________________________ 寡核苷能阻止前体RNA上内含子1的对应序列被剪切 吗啉反义 1 2 3 4 5 为验证吗啉反义寡核苷能阻止前体RNA上内含子1的对应序列被剪切，可以从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA，逆转录形成cDNA， 若吗啉反义寡核苷能阻止前体RNA上内含子1的对应序列被剪切，则实验组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去， 1 2 3 4 5 对照组RNA前体上内含子的对应序列能被剪切下去，使用图3所示引物2和引物4进行PCR扩增并对扩增后的产物用电泳技术进行鉴定，其结果为实验组有目的条带，对照组无目的条带，说明吗啉反义寡核苷能阻止前体RNA上内含子1的对应序列被剪切。 (4)某次实验结果电泳发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR操作过程角度解释可能的原因有______________________________(至少答出两点)。 1 2 3 4 5 复性温度太高、引物自连或互连 PCR是通过调节温度来控制DNA双链的解聚的。在PCR操作过程中，如果复性温度太高、引物自连或互连，均会导致电泳后的实验组和对照组没有任何条带出现。 1 2 3 4 5 2.炎症性肠病(IBD)是一种易导致结肠癌的慢性疾病，患者肠道内会产生硫代硫酸盐。科研人员以小鼠为研究对象，建立了如图所示的炎症性肠病检测模型，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。 1 2 3 4 5 (1)据图分析，可以通过检测荧光强弱来判定小鼠肠道内硫代硫酸盐的浓度，其原因是___________________________________________________ ____________________________。 硫代硫酸盐能够解除R蛋白对启动子B的抑制作用，使 GFP基因表达，发出绿色荧光 1 2 3 4 5 硫代硫酸盐能够解除R蛋白对启动子B的抑制作用，使GFP基因表达，发出绿色荧光，所以可以通过检测荧光强弱来判定小鼠肠道内硫代硫酸盐的浓度。 1 2 3 4 5 (2)研究者利用基因工程技术构建含硫代硫酸盐检测传感器的大肠杆菌工程菌，通过PCR扩增R基因时应该选择的引物是______________，在A、B两端引物的5′端需添加的限制酶识别序列为__________和__________。 限制酶识别序列和酶切位点如表： 限制酶 Hind Ⅲ BamH Ⅰ Past Ⅰ EcoR Ⅰ Bgl Ⅱ 识别序列 (5′→3′) A↓AGCTT G↓GATCC C↓TGCAG G↓AATTC A↓GATCT 引物1和引物4 GGATCC CTGCAG 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 获得的目的基因必须包括完整的启动子和终止子，则需要用到引物1和引物4进行PCR扩增。由限制酶识别序列和题图分析可知，构建基因表达载体时，用BamHⅠ和PastⅠ切割含目的基因的DNA片段，用BglⅡ和PastⅠ切割质粒，所以在A、B两端引物的5′端需添加BamHⅠ和PastⅠ的酶切位点，其识别序列分别为GGATCC和CTGCAG。 1 2 3 4 5 (3)研究发现患者肠道内硫代硫酸盐的生成量与疾病严重程度呈正相关。为简化疾病诊断和精确用药，科研人员开发了智能工程菌。科研人员将抗炎蛋白基因与硫代硫酸盐特异性诱导激活的启动子P连接，构建出如图所示表达载体(部分片段)，导入用________处理的大肠杆菌细胞内，选用启动子P的优点是____________________________________________。 Ca2＋ 仅在IBD发生时才表达抗炎蛋白且能精准治疗IBD 1 2 3 4 5 利用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，可以使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，从而将重组的基因表达载体导入其中。启动子P仅在IBD发生时才表达抗炎蛋白且能精准治疗IBD，所以构建表达载体时选用启动子P。 3.(2023·南平高三质检)科研人员培育了一种能够降解餐厨废弃物并生成乳酸的转基因毕赤酵母。基本思路是在乳酸脱氢酶基因(LDH)的单基因表达载体中逐个接入糖化酶基因(Ga)表达盒与α－淀粉酶基因(Amy)表达盒，构建出AGL－三基因表达载体，如图1所示。 1 2 3 4 5 (1)快速获得大量目的基因的技术是______________________，获得的产物通常采用________________技术来鉴定。 1 2 3 4 5 PCR(聚合酶链式反应) 琼脂糖凝胶电泳 1 2 3 4 5 PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用PCR技术可以大量扩增目的基因。不同的DNA片段在电泳时移动的速率不同，可以将PCR产物的电泳结果与标准DNA样品的电泳结果进行比对，从而鉴定PCR的产物，常采用琼脂糖凝胶电泳。 (2)培育转基因毕赤酵母的关键步骤是____________________，将图1所示结构“导入”毕赤酵母后，将毕赤酵母转移至含__________的培养基中进行培养，筛选出能够生存的菌落。 1 2 3 4 5 基因表达载体的构建 博来霉素 1 2 3 4 5 基因工程的核心是基因表达载体的构建，因此，培育转基因毕赤酵母的关键步骤是基因表达载体的构建，AGL－三基因表达载体中含有标记基因(博来霉素抗性基因)，筛选出含有三基因表达载体的毕赤酵母的操作思路是将毕赤酵母 转移至含博来霉素的培养基中 进行培养，筛选出能够生存的 菌落即为含有三基因表达载体 的毕赤酵母。 (3)构建三基因表达载体的难点在于构建目的基因的表达盒，图2为Amy表达盒的构建过程(pro为启动子；AOXTT为终止子；Bsp119Ⅰ、XbaⅠ、BglⅡ、BamHⅠ为不同限制酶，①②为操作过程)。 1 2 3 4 5 操作①的处理是：将质粒1与α－淀粉酶基因均用Bsp119Ⅰ与XbaⅠ两种不同的限制酶处理，然后拼接。与用一种限制酶处理相比，优点是______________________________________________________________________________(答出两点)；操作②中必须用________________酶对质粒2处理，才能获得能正常表达的α－淀粉酶基因表达盒。 1 2 3 4 5 防止目的基因、质粒1发生自身环化，使质粒1与α－淀粉酶基因以正确的方向进行拼接 BglⅡ、BamHⅠ 1 2 3 4 5 将质粒1与α－淀粉酶基因用两种不同的限制酶处理，然后拼接，用两种限制酶切割与用一种限制酶切割相比，优点是防止目的基因、质粒1发生自身环化，使质粒1与α－淀粉酶基因以正确的方向进行拼接。为获得能正常表达的α－淀粉酶基因(Amy)表达盒，需要含有启动子(pro)、终止子(AOXTT)，因此 操作②中必须用BglⅡ、BamHⅠ酶 对质粒2进行处理。 4.单宁酶可水解单宁酸为没食子酸，降低茶汤中单宁酸含量，解决茶饮料“冷后浑”问题和果汁类饮料除涩问题。我国科学家在土壤中筛选出分泌单宁酶的黑曲霉Lys117，利用基因工程对其进行改造，提取单宁酶基因与强表达组件(强表达启动子和信号肽)结合，最终实现单宁酶的高产。回答下列问题： (1)黑曲霉Lys117的分离筛选：将土样稀释适量倍数后，采用涂布平板法接种于含有溴酚蓝(溴酚蓝在单宁酸环境中为蓝紫色，在没食子酸环境中为黄色)的选择培养基上。该选择培养基按物理性质属于______培养基。根据选择培养基的_________________________(填现象)作为挑取单宁酶产生菌的标志。 1 2 3 4 5 固体 黄色圈(变色圈)直径的大小 1 2 3 4 5 根据题干可知：若培养基上有单宁酶产生菌的存在，因其会分泌单宁酶，可以水解单宁酸为没食子酸，含有溴酚蓝的培养基上会出现以该菌为中心的黄色圈，黄色圈越大，则该处单宁酶产生量越多或活性高。 (2)单宁酶基因扩增及组装如图所示：P1左侧有RNA聚合酶识别和结合的位点，为实现单宁酶基因与强表达组件定向连接，PCR扩增设计引物时需对引物添加相应的限制酶识别序列。则PCR应选择的引物对为________，在各引物前添加的识别序列对应的限制酶分别是___________ _______。 1 2 3 4 5 P2与P3 EcoRⅠ、 BglⅠ 1 2 3 4 5 PCR技术的原理为DNA半保留复 制，子链延伸方向为5′端→3′ 端，结合图示，可知应选择引物 P2与P3； 分析题图，BamHⅠ能识别目的基因中的核苷酸序列，破坏目的基因的完整性，不能选择该酶； 而在载体上存在EcoRⅠ、Sau3AⅠ、EcoRⅤ三种酶的切割位点，为了保证信号肽的正常存在，考虑选择EcoRⅠ、Sau3AⅠ， 1 2 3 4 5 而根据图中所给各种限制酶识别序 列及切割位点可知：Sau3AⅠ限制 酶也能将BamHⅠ识别的序列切割， 故不可选用，只能用BglⅠ来取代 Sau3AⅠ， 它与Sau3AⅠ能切割出相同末端，故应选用BglⅠ与EcoRⅠ这两种限制酶进行切割。 (3)与强表达组件结合后的基因与Ti质粒重组；该过程为基因工程的核心步骤，即____________________。利用农杆菌的Ti质粒作为载体的原理是_____________________________________________________________ ______________________________，与目的基因导入植物细胞类似。已知信号肽负责把蛋白质引导到不同的具膜细胞器内，本实验中信号肽存在的意义为____________________________________________。 1 2 3 4 5 基因表达载体的构建 农杆菌的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上 信号肽会引导肽链转移到内质网继续合成与加工 1 2 3 4 5 基因工程基本操作包括四步：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤； 利用农杆菌的Ti质粒作为载体的原理是：农杆菌的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上； 根据题干“已知信号肽负责把蛋白质引导到不同的具膜细胞器内”，可推测本实验中信号肽存在的意义为信号肽会引导肽链转移到内质网继续合成与加工，利于单宁酶的正常合成与分泌。 (4)重组Ti质粒导入目的菌并检测：将重组Ti质粒用特定方法导入黑霉菌Lys117，记为Lys117＋，可依据______________________________，最终鉴定出高产单宁酶的黑霉菌。 1 2 3 4 5 Lys117＋中单宁酶表达量的高低 本实验的目的是筛选出高产单宁酶的黑霉菌，因此可以依据Lys117＋中单宁酶表达量的高低来筛选出高产菌株。 1 2 3 4 5 5.(2023·九江高三联考)如图表示某生物DNA结构的一部分及限制酶的识别序列和酶切位点，请回答以下问题： 限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ Sac Ⅰ 识别序列和 切割位点 G↓AATTC G↓GATCC A↓AGCTT GAGCT↓C 1 2 3 4 5 (1)若目的基因为抗虫基因，需要在连接Ti质粒前进行PCR扩增，需要在样本中再加入__________________________________________________，一般要经历多次循环，每次循环可以分为__________________三步。扩增后切割目的基因，应使用表中限制酶_________________，这样做的原因是___________________________________________________________ ________。 引物、原料(或脱氧核苷酸或dNTP)、酶(Taq DNA聚合酶) 变性、复性、延伸 EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ 可以防止目的基因和Ti质粒自身环化(或保证Ti质粒与目的基因的正 确连接) 1 2 3 4 5 (2)若目的基因为胰岛素基因，科研人员构建了如图所示的重组载体，tetr为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。 构建重组载体需要的酶有____________________。在重组质粒上插入大肠杆菌复制原点的目的是__________________________________。图中的启动子上有____________的识别和结合位点，从而驱动基因的转录。将重组载体导入大肠杆菌体内后，将其涂布于含___________的选择培养基上。 DNA连接酶和限制酶 使重组载体能在大肠杆菌中复制扩增 RNA聚合酶 氨苄青霉素 $$