专题5 第17讲 基因工程的基本工具和操作程序-【步步高】2024年新高考生物考前三个月（鲁湘辽吉）

考点1　基因工程的操作流程及应用 1.(2022·河北，24改编)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPinlA)的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题： (1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是______________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)________________________是实施基因工程的核心，目的是__________________ ________________________________________________________________________。 (3)将抗虫基因转入植物体内时，除了采用我国科学家独创的________________，还经常采用________________法，使用该方法时，必须将目的基因插入质粒的__________上，才能使目的基因转移到受体细胞并将其整合到该细胞的______________上，此方法的不足之处是________________________________________________________________________。 (4)为了检测目的基因在受体细胞中是否稳定表达，在分子水平上的检测方法为________________________________________________________________________。 (5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的____________以鉴定其抗性程度。如图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析________________(填“NaPI”“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”)转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是____________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生__________。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是________ ___________________________________________________________(写出两点即可)。 (7)生产上常将获得的转基因抗虫棉与普通棉花混合播种，其目的是______________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的　(2)基因表达载体的构建　使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用　(3)花粉管通道法　农杆菌转化　T－DNA　染色体DNA　该方法不适用于单子叶植物　(4)抗原－抗体杂交技术　(5)接种实验　NaPI＋StPinlA　饲喂NaPI＋StPinlA转基因棉花的虫体质量最小、且每株棉铃数最多　(6)定向改变　由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂　(7)降低害虫种群中抗性基因频率的增长速率 1．基因工程中的4个“3” (1)基因工程的3种基本工具 ①限制性内切核酸酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。 ②DNA连接酶：E.coli DNA连接酶只能连接互补的黏性末端；T4 DNA连接酶能连接互补的黏性末端和平末端。 ③载体需具备的条件包括： a．能在宿主细胞内稳定存在并大量复制； b．有一个至多个限制酶切割位点； c．具有特殊的标记基因，以便对含目的基因的受体细胞进行筛选。 (2)获取目的基因的3条途径 ①从基因文库中获取； ②利用PCR技术扩增； ③用化学方法直接人工合成。 (3)将目的基因导入受体细胞的3种类型 ①植物：体细胞或受精卵——常用农杆菌转化法(双子叶植物和裸子植物)、花粉管通道法。 ②动物：受精卵——显微注射法。 ③微生物：细菌(常用大肠杆菌)——钙离子处理法。 (4)目的基因的检测与鉴定，分子水平检测的3个方面 ①检测目的基因是否插入到转基因生物的DNA上：PCR等技术。 ②检测目的基因是否转录出mRNA：PCR等技术。 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。 2．基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建 (1)启动子和终止子 启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。 终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。 (2)目的基因插入位置：启动子与终止子之间。 (3)启动子具有物种特异性和组织特异性，例如用乳腺生物反应器生产药用蛋白的时候，将药用蛋白基因连接在乳腺蛋白基因的启动子下游。 (4)为防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。 1．(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 (1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是_____________________________________________________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。 (2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_______________________，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经____________过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出 Wx基因的cDNA，原因是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶　转化　(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　(3)逆转录　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 解析　(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录。3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录(或反转录)过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。 2．(2023·南通如皋高三期末)基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失，从而使部分功能被屏蔽的技术。来源于λ噬菌体的Red同源重组系统由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM 3种蛋白质，可用于大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30 ℃培养时可以正常复制，而高于37 ℃时会自动丢失；由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L－阿拉伯糖诱导表达。λ－Red系统介导的基因敲除过程如图所示。请回答下列问题： (1)EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，从5′端向3′端降解DNA单链，产生____________(填“3′”或“5′”)黏性末端；BET结合在EXO外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而__________(填“抑制”或“促进”)受体细胞对外源DNA的降解。 (2)要将pKD46导入大肠杆菌，首先需用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是________________________________。为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必须满足的培养条件是____________________________________________________。 过程Ⅰ是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，说明_______ ________________________________________________________________________。 (3)用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因时，同时需考虑将大肠杆菌基因组DNA上特定靶基因敲除。图中含HA1的引物由两部分组成，其中HA1的碱基序列应该与______________的碱基序列相同，另一部分应该与________________相应链上的碱基互补。 (4)为筛选出同源重组成功的大肠杆菌(靶基因被敲除)，过程Ⅱ使用的培养基必须含有____________，然后再通过在__________条件下培养，把质粒pKD46除去。 答案　(1)3′　抑制　(2)使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　培养温度为30 ℃(或低于37 ℃)，培养基中含L－阿拉伯糖　大肠杆菌不含青霉素抗性基因，pKD46中含青霉素抗性基因　(3)靶基因外侧　卡那霉素抗性基因(NPT Ⅱ)　(4)卡那霉素　高于37 ℃ 解析　(2)用Ca2＋处理大肠杆菌，使大肠杆菌利于吸收外界环境中DNA分子，据题中信息知，为使pKD46在大肠杆菌内正常复制，培养温度应为30 ℃，为使Red重组酶正常合成，培养基中应含有L－阿拉伯糖。过程Ⅰ是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，这说明实验所用的大肠杆菌不含青霉素抗性基因(或在含青霉素的培养基中不能存活)且pKD46质粒含有青霉素抗性基因。(3)据图分析可知，将获得的线性DNA片段导入大肠杆菌，通过同源重组将大肠杆菌基因组DNA上的特定靶基因敲除，所以图中含HA1的引物由两部分组成，其中HA1的碱基序列应该与靶基因外侧的碱基序列相同，另一部分应该与卡那霉素抗性基因相应链上的碱基互补。 考点2　限制酶的选择和标记基因筛选原理 2.(2023·宿迁高三月考)图1和图2是基因工程中用到的含目的基因的DNA和质粒及相关限制酶的酶切位点等，图1中“”表示目的基因转录的方向。已知限制酶BamHⅠ、BclⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓GATCC、T↓GATCA、A↓AGCTT、G↓AATTC、C↓AATTG。回答下列问题： (1)基因工程的四步程序包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、__________________________和目的基因的检测与鉴定。其中构建基因表达载体时，所用载体应具备的条件有：__________________________________(答出两点即可)。常用的载体除了质粒以外，还有__________________________(答出两点即可)。 (2)图2中，启动子的作用：________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)将图1和图2中的DNA拼接成重组质粒时，若只选择一种限制酶，则应选用________来切割。有人将图2所示的质粒载体用该限制酶酶切后，与用该酶酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。如果用含有四环素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________； 并且____________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有________的固体培养基，在此培养基中________(填“能”或“不能”)生长的为目的菌落。 (4)为防止质粒和目的基因的自身环化、目的基因与载体的反向连接，以及提高实验的成功率，应选用限制酶________________切割质粒，选用限制酶____________________切割含目的基因的DNA片段。 答案　(1)将目的基因导入受体细胞　能自我复制，具有标记基因，具有一个或多个限制酶切割位点　噬菌体、动植物病毒等　(2)是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录出mRNA　(3)Hind Ⅲ　二者均不含有四环素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒　二者均含有四环素抗性基因，在该培养基上均能生长　青霉素　不能　(4)MfeⅠ和BamHⅠ　EcoRⅠ和BclⅠ 1．图解限制酶的选择原则 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 2．标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 3．(2023·宿迁高三联考)幽门螺旋杆菌(Hp)是慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤的主要致病菌，该菌的Ipp20基因能合成其特有的蛋白质，据此，研究者利用基因工程制备Hp疫苗。已知Ipp20基因表达时，双链DNA的一条链是编码链，另一条链是模板链，如图1；4种限制酶及其识别序列如图2；3种质粒如图3，箭头表示限制酶的切割位点；操作步骤如图4。 请回答下列问题： (1)Ipp20基因终止子序列位于图1中的________________区段，该基因转录时，编码起始密码子的序列位于图1中的________区段。 (2)转录产生的mRNA前8个碱基序列为________________(方向为5′→3′)。若通过PCR技术大量扩增Ipp20基因的编码区段，则需要设计一对引物，其中结合到编码链上的引物序列是____________________(方向为5′→3′，写出5′端8个碱基序列)。 (3)据图1、2、3分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是________________，利用所选限制酶进行操作的优势是________________________________________________ ________________________________________________________________________。最适合用作载体的质粒是__________。 (4)图4中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法(使用无菌的线毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如图所示)。培养基A、B中应分别添加________________，符合实验要求的菌落是______(填写数字)，判断依据是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)非编码区2　编码区　(2)CUCGAGAU　TCTAGAGG　(3)XbaⅠ、XhoⅠ　防止酶切后的质粒自身环化，保证酶切后的质粒和Ipp20基因按正确方向连接　质粒Z　(4)氯霉素、潮霉素　3、5　用两种限制酶对质粒Z进行切割时，因插入目的基因而丢失了潮霉素抗性基因，但不会破坏氯霉素抗性基因，因此导入重组质粒的大肠杆菌能在含有氯霉素的培养基上生长，但不能在含有潮霉素的培养基上生长 解析　(1)在真核细胞的基因结构中，包括编码区和非编码区，其中编码区又分为外显子和内含子，启动子和终止子都是一段特殊的DNA序列，属于基因的非编码区，分别位于编码区的上游和下游，所以终止子位于非编码区2，Ipp20基因转录时，起始密码子位于编码区内，紧接着5′端。(2)根据碱基互补配对的原则，转录产生的mRNA与模板链互补，所以mRNA前8个碱基序列为5′CUCGAGAU3′，利用PCR技术扩增Ipp20基因的编码区段时，设计引物序列的主要依据是其基因编码区两端的部分核苷酸序列，按照碱基互补配对原则，与已知链对应的应为5′TCTAGAGG3′。(3)基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等，选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，且不破坏目的基因和标记基因，图3中质粒X上Xho Ⅰ的酶切位点会破坏终止子，质粒Y上XhoⅠ和XbaⅠ的酶切位点会破坏两个抗性基因，质粒Z上XhoⅠ和XbaⅠ酶切后会保留一个标记基因，且黏性末端不同，可避免质粒的自身环化和随意连接，故适合作载体。(4)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，培养基A、B中应分别添加氯霉素和潮霉素，符合要求的菌落应该能在含有氯霉素的培养基上生长，但不能在含有潮霉素的培养基上生长，故符合要求的菌落是3、5，判断依据是用XhoⅠ和XbaⅠ两种限制酶对质粒Z进行切割时，因插入目的基因而丢失了潮霉素抗性基因，但不会破坏氯霉素抗性基因，因此导入重组质粒的大肠杆菌能在含有氯霉素的培养基上生长，但不能在含有潮霉素的培养基上生长。 4．(2021·辽宁，24)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1 000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经____________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 (2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入________和_________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用________________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 Hind Ⅲ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoR Ⅰ G↓AATTC CTTAA↑G Pvit Ⅱ CAG↓CTG GTC↑GAC Pst Ⅰ CTGC↓AG GA↑CGTC Kpn Ⅰ G↓GTACC CCATG↑G BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G 注：箭头表示切割位点。 (3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于_______的生理状态，以提高转化效率。 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，________________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。 注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中。 (5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期(示意图见图3)不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的____________(填“G1”“S”或“G2/M”)期。 答案　(1)逆转录　(2)EcoR Ⅰ　Pvit Ⅱ　T4 DNA连接酶　(3)能吸收周围环境中DNA分子　(4)3　(5)G2/M 解析　(2)根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。从图1可看出，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于Kpn Ⅰ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoR Ⅰ和Pvit Ⅱ两种不同限制酶的识别序列；根据Pvit Ⅱ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。(4)由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoR Ⅰ和Pvit Ⅱ两种酶切割重组质粒，电泳后将获得含有质粒和目的基因的两条条带，由于phb2基因大小为0.9 kb，所以对应电泳图是菌落3。(5)比较图4中G1期和S期细胞减少，而G2/M期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。 1．(2023·烟台高三二模)近年来，基因工程、蛋白质工程等的广泛应用给发酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。人们可以采用基因工程的方法，将药物蛋白基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物。科研人员尝试构建SHG融合蛋白表达载体，并导入受体细胞表达和分泌。H为目的基因编码的蛋白质，蛋白质分泌依赖于信号肽的引导，用信号肽S代替H自身信号肽有利于蛋白质的分泌，G基因片段(长度为717 bp)编码的一段小肽常作为融合蛋白标签。请回答下列问题： (1)在基因工程中作为载体的质粒应具备的基本条件有________________________(至少答出2点)。为了使目的基因________________需要构建基因表达载体，构建基因表达载体时，为了满足需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时可以激活或抑制________________。 (2)利用PCR扩增目的基因时，应选择图中的引物________；若目的基因经过PCR扩增n次，需要的引物数量是________。PCR的产物常采用__________________法鉴定。 (3)要构建SHG融合蛋白表达载体，应选择图中限制酶________来切割质粒。若目的基因与质粒按图示方向正向连接，用限制酶BamHⅠ和SacⅠ切割重组后的基因表达载体，完全酶切后的产物的长度约为______________bp。 (4)该基因工程中的受体细胞无任何抗生素抗性，某同学用只含有氨苄青霉素的培养基筛选导入重组质粒的受体细胞，这样处理不能成功的原因是__________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)能在受体细胞中复制(或能整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制)、具有标记基因、有一个或多个限制酶切割位点　表达和发挥作用　目的基因的表达　(2)b、c　2n＋1－2　琼脂糖凝胶电泳　(3)EcoRⅤ　5 480、1 061　(4)导入质粒或重组质粒的受体细胞都具有氨苄青霉素抗性，都能正常生长 解析　(2)引物与模板的3′端结合，利用PCR扩增目的基因时，应将一对引物加在目的基因的两侧，故选择题图中的引物b和引物c；引物参与子链DNA的合成，即新合成的DNA单链数＝所需引物数量，扩增n次，新合成的DNA单链数为2n＋1－2，即所需引物数为2n＋1－2个；PCR的产物常采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定。(3)分析题意可知，本操作技术中需要用信号肽S代替H自身信号肽以有利于蛋白质的分泌，结合图示可知，S基因上的限制酶是EcoR Ⅴ，故可用图中限制酶EcoR Ⅴ进行切割；由图可知H基因片段长度为1 038－51＝987 (bp)，重组质粒长度为5 554＋1 038－51＝6 541 (bp)，由题意可知G基因片段长度为717 bp，二者正向相连时BamH Ⅰ酶作用于H中，Sac Ⅰ酶作用于G末端，完全酶切后的产物的长度约为717＋1 038－694＝1 061(bp)、5 554＋1 038－51－1 061＝5 480(bp)。 2．炎症性肠病(IBD)是一种易导致结肠癌的慢性疾病，患者肠道内会产生硫代硫酸盐。科研人员以小鼠为研究对象，建立了如图所示的炎症性肠病检测模型，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。 (1)据图分析，可以通过检测荧光强弱来判定小鼠肠道内硫代硫酸盐的浓度，其原因是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)研究者利用基因工程技术构建含硫代硫酸盐检测传感器的大肠杆菌工程菌，通过PCR扩增R基因时应该选择的引物是________________，在A、B两端引物的5′端需添加的限制酶识别序列为____________和______________。 限制酶识别序列和酶切位点如表： 限制酶 Hind Ⅲ BamH Ⅰ Past Ⅰ EcoR Ⅰ Bgl Ⅱ 识别序列 (5′→3′) A↓AGCTT G↓GATCC C↓TGCAG G↓AATTC A↓GATCT (3)研究发现患者肠道内硫代硫酸盐的生成量与疾病严重程度呈正相关。为简化疾病诊断和精确用药，科研人员开发了智能工程菌。科研人员将抗炎蛋白基因与硫代硫酸盐特异性诱导激活的启动子P连接，构建出如图所示表达载体(部分片段)，导入用________处理的大肠杆菌细胞内，选用启动子P的优点是________________________________________________。 答案　(1)硫代硫酸盐能够解除R蛋白对启动子B的抑制作用，使GFP基因表达，发出绿色荧光　(2)引物1和引物4　GGATCC　CTGCAG　(3)Ca2＋　仅在IBD发生时才表达抗炎蛋白且能精准治疗IBD 解析　(1)硫代硫酸盐能够解除R蛋白对启动子B的抑制作用，使GFP基因表达，发出绿色荧光，所以可以通过检测荧光强弱来判定小鼠肠道内硫代硫酸盐的浓度。(2)获得的目的基因必须包括完整的启动子和终止子，则需要用到引物1和引物4进行PCR扩增。由限制酶识别序列和题图分析可知，构建基因表达载体时，用BamHⅠ和PastⅠ切割含目的基因的DNA片段，用BglⅡ和PastⅠ切割质粒，所以在A、B两端引物的5′端需添加BamHⅠ和PastⅠ的酶切位点，其识别序列分别为GGATCC和CTGCAG。(3)利用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，可以使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，从而将重组的基因表达载体导入其中。启动子P仅在IBD发生时才表达抗炎蛋白且能精准治疗IBD，所以构建表达载体时选用启动子P。 3．(2023·唐山高三质检)科研人员培育了一种能够降解餐厨废弃物并生成乳酸的转基因毕赤酵母。基本思路是在乳酸脱氢酶基因(LDH)的单基因表达载体中逐个接入糖化酶基因(Ga)表达盒与α－淀粉酶基因(Amy)表达盒，构建出AGL－三基因表达载体，如图1所示。 (1)快速获得大量目的基因的技术是_______，获得的产物通常采用_______技术来鉴定。 (2)培育转基因毕赤酵母的关键步骤是____________________，将图1所示结构“导入”毕赤酵母后，将毕赤酵母转移至含____________的培养基中进行培养，筛选出能够生存的菌落。 (3)构建三基因表达载体的难点在于构建目的基因的表达盒，图2为Amy表达盒的构建过程(pro为启动子；AOXTT为终止子；Bsp119Ⅰ、XbaⅠ、BglⅡ、BamHⅠ为不同限制酶，①②为操作过程)。 操作①的处理是：将质粒1与α－淀粉酶基因均用Bsp119Ⅰ与XbaⅠ两种不同的限制酶处理，然后拼接。与用一种限制酶处理相比，优点是_______________________(答出两点)；操作②中必须用____________酶对质粒2处理，才能获得能正常表达的α－淀粉酶基因表达盒。 答案　(1)PCR(聚合酶链式反应)　琼脂糖凝胶电泳　(2)基因表达载体的构建　博来霉素 (3)防止目的基因、质粒1发生自身环化，使质粒1与α－淀粉酶基因以正确的方向进行拼接　BglⅡ、BamHⅠ 解析　(1)PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用PCR技术可以大量扩增目的基因。不同的DNA片段在电泳时移动的速率不同，可以将PCR产物的电泳结果与标准DNA样品的电泳结果进行比对，从而鉴定PCR的产物，常采用琼脂糖凝胶电泳。(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建，因此，培育转基因毕赤酵母的关键步骤是基因表达载体的构建，AGL－三基因表达载体中含有标记基因(博来霉素抗性基因)，筛选出含有三基因表达载体的毕赤酵母的操作思路是将毕赤酵母转移至含博来霉素的培养基中进行培养，筛选出能够生存的菌落即为含有三基因表达载体的毕赤酵母。(3)将质粒1与α－淀粉酶基因用两种不同的限制酶处理，然后拼接，用两种限制酶切割与用一种限制酶切割相比，优点是防止目的基因、质粒1发生自身环化，使质粒1与α－淀粉酶基因以正确的方向进行拼接。为获得能正常表达的α－淀粉酶基因(Amy)表达盒，需要含有启动子(pro)、终止子(AOXTT)，因此操作②中必须用BglⅡ、BamHⅠ酶对质粒2进行处理。 4．(2023·石家庄高三质检)单宁酶可水解单宁酸为没食子酸，降低茶汤中单宁酸含量，解决茶饮料“冷后浑”问题和果汁类饮料除涩问题。我国科学家在土壤中筛选出分泌单宁酶的黑曲霉Lys117，利用基因工程对其进行改造，提取单宁酶基因与强表达组件(强表达启动子和信号肽)结合，最终实现单宁酶的高产。回答下列问题： (1)黑曲霉Lys117的分离筛选：将土样稀释适量倍数后，采用涂布平板法接种于含有溴酚蓝(溴酚蓝在单宁酸环境中为蓝紫色，在没食子酸环境中为黄色)的选择培养基上。该选择培养基按物理性质属于________培养基。根据选择培养基的______________________(填现象)作为挑取单宁酶产生菌的标志。 (2)单宁酶基因扩增及组装如图所示：P1左侧有RNA聚合酶识别和结合的位点，为实现单宁酶基因与强表达组件定向连接，PCR扩增设计引物时需对引物添加相应的限制酶识别序列。则PCR应选择的引物对为____________，在各引物前添加的识别序列对应的限制酶分别是________________。 (3)与强表达组件结合后的基因与Ti质粒重组；该过程为基因工程的核心步骤，即____________________________。利用农杆菌的Ti质粒作为载体的原理是_______ ________________________________________________________________________， 与目的基因导入植物细胞类似。已知信号肽负责把蛋白质引导到不同的具膜细胞器内，本实验中信号肽存在的意义为__________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)重组Ti质粒导入目的菌并检测：将重组Ti质粒用特定方法导入黑霉菌Lys117，记为Lys117＋，可依据___________________________，最终鉴定出高产单宁酶的黑霉菌。 答案　(1)固体　黄色圈(变色圈)直径的大小　(2)P2与P3　EcoRⅠ、BglⅠ　(3)基因表达载体的构建　农杆菌的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上　信号肽会引导肽链转移到内质网继续合成与加工　(4)Lys117＋中单宁酶表达量的高低 解析　(1)根据题干可知：若培养基上有单宁酶产生菌的存在，因其会分泌单宁酶，可以水解单宁酸为没食子酸，含有溴酚蓝的培养基上会出现以该菌为中心的黄色圈，黄色圈越大，则该处单宁酶产生量越多或活性高。(2)PCR技术的原理为DNA半保留复制，子链延伸方向为5′端→3′端，结合图示，可知应选择引物P2与P3；分析题图，BamHⅠ能识别目的基因中的核苷酸序列，破坏目的基因的完整性，不能选择该酶；而在载体上存在EcoRⅠ、Sau3AⅠ、EcoRⅤ三种酶的切割位点，为了保证信号肽的正常存在，考虑选择EcoRⅠ、Sau3AⅠ，而根据图中所给各种限制酶识别序列及切割位点可知：Sau3AⅠ限制酶也能将BamHⅠ识别的序列切割，故不可选用，只能用BglⅠ来取代Sau3AⅠ，它与Sau3AⅠ能切割出相同末端，故应选用BglⅠ与EcoRⅠ这两种限制酶进行切割。(3)基因工程基本操作包括四步：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤；利用农杆菌的Ti质粒作为载体的原理是：农杆菌的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上；根据题干“已知信号肽负责把蛋白质引导到不同的具膜细胞器内”，可推测本实验中信号肽存在的意义为信号肽会引导肽链转移到内质网继续合成与加工，利于单宁酶的正常合成与分泌。(4)本实验的目的是筛选出高产单宁酶的黑霉菌，因此可以依据Lys117＋中单宁酶表达量的高低来筛选出高产菌株。 5．(2023·河北重点中学高三联考)如图表示某生物DNA结构的一部分及限制酶的识别序列和酶切位点，请回答以下问题： 限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ Sac Ⅰ 识别序列和切割位点 G↓AATTC G↓GATCC A↓AGCTT GAGCT↓C (1)若目的基因为抗虫基因，需要在连接Ti质粒前进行PCR扩增，需要在样本中再加入__________________，一般要经历多次循环，每次循环可以分为__________________三步。扩增后切割目的基因，应使用表中限制酶____________________，这样做的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)若目的基因为胰岛素基因，科研人员构建了如图所示的重组载体，tetr为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。 构建重组载体需要的酶有____________________。在重组质粒上插入大肠杆菌复制原点的目的是______________________________________________________________。 图中的启动子上有______________的识别和结合位点，从而驱动基因的转录。将重组载体导入大肠杆菌体内后，将其涂布于含______________的选择培养基上。 答案　(1)引物、原料(或脱氧核苷酸或dNTP)、酶(Taq DNA聚合酶)　变性、复性、延伸　EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ　可以防止目的基因和Ti质粒自身环化(或保证Ti质粒与目的基因的正确连接)　(2)DNA连接酶和限制酶　使重组载体能在大肠杆菌中复制扩增　RNA聚合酶　氨苄青霉素 学科网（北京）股份有限公司 $$