专题5 第16讲 细胞工程与胚胎工程-【步步高】2024年新高考生物考前三个月（鲁湘辽吉）

考点1　动物细胞工程和胚胎工程 1.自1996年世界上第一只体细胞克隆羊多莉诞生以来，人类已经成功克隆了马、牛和猪等大型家畜，但体细胞克隆灵长类动物一直没有取得进展，究其原因，主要是灵长类动物的卵细胞极为敏感，极轻微挤压都可能导致异常分裂，且细胞核移植到去核卵细胞后不能完全恢复到分化前的功能状态，导致胚胎发育率低。2017年，我国科学家利用“聪明的化学方法和操作技巧”成功培育出了体细胞克隆猴“中中”和“华华”， 该成果一经公布轰动了全世界。如图为克隆猴的培育过程。 注：Kdm4d为组蛋白去甲基化酶；TSA为组蛋白脱乙酰酶抑制剂。 (1)取供体的体细胞进行培养时，选择猕猴胚胎而非成年期的成纤维细胞进行培养，其原因是__________________________________。在进行细胞原代培养时会出现____________和细胞接触抑制现象。传代培养时，常利用____________酶等处理，制成细胞悬液后转入新的培养瓶中。 (2)为获得数量较多的卵母细胞，采集前应先用________激素处理母猴，从卵巢采集到的卵母细胞经成熟培养后进行“去核”处理，这里的“核”是指______________________，去掉卵母细胞细胞核的目的是____________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)研究人员在将胎猴的体细胞注入去核卵母细胞前，用灭活的病毒进行了短暂处理。在此过程中，灭活的病毒所起的作用是__________________________________。将体细胞注入去核卵母细胞比早期核移植中将核注入去核卵母细胞更有进步意义，原因是__________ ________________________________________________________________________。 (4)上述过程还利用了胚胎工程中的__________技术，其实质是早期胚胎在相同____________下空间位置的转移。 (5)移植前进行性别鉴定、遗传筛查等，宜取____________细胞进行DNA分析。假如用胚胎分割移植的方式来克隆猴，胚胎分割时应注意的事项是________________________。 (6)研究人员将Kdm4d的mRNA注入了重构胚，同时用TSA处理。这两种物质都是通过改变组蛋白的表观遗传修饰来调控基因表达，即Kdm4d 的 mRNA 的作用是_________ ________________________________________________________________________； TSA的作用是________________________________________________，最终调节相关基因的表达，提高胚胎的发育率和妊娠率。 答案　(1)胚胎比成纤维细胞分化程度低，更易于培养　细胞贴壁　胰蛋白　(2)(外源)促性腺　纺锤体－染色体复合物　使克隆动物个体细胞核内的遗传物质几乎全部来自供体细胞　(3)诱导胎猴体细胞与去核卵母细胞融合　操作简便，对卵母细胞损伤小　(4)胚胎移植　生理条件　(5)滋养层　要将内细胞团均等分割　(6)可以表达组蛋白去甲基化酶，该酶能降低组蛋白的甲基化水平　抑制组蛋白脱乙酰酶的作用，提高组蛋白的乙酰化水平 1．动物细胞培养 (1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同： 第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞； 第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。 (2)区分原代培养和传代培养的关键是：是否分瓶培养。 2．克隆动物培育的流程 3．胚胎早期发育过程 4．胚胎工程的操作流程 (1)受精的标志是卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体，受精完成的标志是雌、雄原核融合完成。 (2)用非激素处理法采集的卵母细胞需要在体外人工培养到MⅡ期才能与获能的精子受精。 (3)胚胎移植仅属于一种技术，移植的是通过有性生殖或无性生殖产生的胚胎，其本身并不是一种生殖方式。 (4)胚胎移植过程中两次使用激素：第一次是对供受体母畜进行同期发情处理；第二次对供体母畜进行超数排卵处理。 (5)胚胎移植过程中两次检查：第一次对收集的胚胎进行质量检查；第二次对受体母畜进行是否妊娠的检查。 5．胚胎移植的生理学基础 1．(2019·江苏，29节选)利用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。如图为基因编辑猪培育流程，请回答下列问题： (1)对1号猪使用______________处理，使其超数排卵，收集并选取处在__________________(时期)的卵母细胞用于核移植。 (2)采集2号猪的组织块，用________________处理获得分散的成纤维细胞，放置于37 ℃的CO2培养箱中培养，其中CO2的作用是_______________________________________。 (3)为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行________。产出的基因编辑猪的性染色体来自______号猪。 答案　(1)促性腺激素　减数分裂 Ⅱ 中期(MⅡ期) (2)胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)　维持培养液的pH　(3)分割　2 解析　(1)为获取更多的卵(母)细胞，要对供体母猪注射促性腺激素，使其超数排卵。用于核移植的卵母细胞通常处于减数分裂 Ⅱ 中期。(2)常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物组织块，使其分散成单个细胞。动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所必需的，CO2的作用是维持培养液的pH。(3)若要获得更多基因编辑猪，可采用胚胎分割技术对移植前的胚胎进行分割。子代猪的性别取决于核供体亲本，即2号猪。 2．(2023·石家庄高三模拟)血友病主要是由人体缺乏一种合成凝血因子的基因导致的。血友病发病时间和程度与患者血浆中凝血因子Ⅷ的活性水平有关。目前常采用基因疗法治疗血友病，方法如图所示。回答下列有关问题： (1)血友病的出现是因为X染色体上发生了____________。 (2)凝血因子Ⅷ主要存在于人体的________中。通过上述基因治疗，治愈的女性患者的生殖细胞中________(填“含有”或“不含”)致病基因。 (3)有一对正常的夫妇生了一个患血友病的儿子，他们希望通过设计试管婴儿的方法生一个健康的孩子。设计试管婴儿的基本程序：首先为女性注射____________，实现控制性排卵，然后从卵巢中吸取卵母细胞，培养至减数分裂Ⅱ中期；再让成熟的卵子与获能的精子经受精作用形成受精卵，然后将受精卵移入发育培养液中继续培养以获得早期胚胎；最后从早期胚胎取出一个细胞进行____________，选择无致病基因的胚胎进行移植。 (4)将选择好的早期胚胎移植到母体，它能够在母体中正常发育的生理基础是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 若要在早期胚胎时就知道胎儿性别，可通过__________________________________ ________________________________________________________________________实现。 答案　(1)基因突变　(2)血浆　含有　(3)促性腺激素　遗传学诊断　(4)母体对移入的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应；供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，且供体胚胎的遗传特性不受任何影响　取滋养层细胞做DNA分析进行性别鉴定 解析　(2)血友病发病时间和程度与患者血浆中凝血因子Ⅷ的活性水平有关，即凝血因子Ⅷ主要存在于人体的血浆中。据图分析可知，通过上述的基因治疗，治愈的女性患者的生殖细胞中仍然含有致病基因。 考点2　单克隆抗体和双抗体夹心法 2.(2023·连云港高三期中)人心肌细胞中的肌钙蛋白由三种结构不同的亚基组成，即肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)和肌钙蛋白C(cTnC)，其中cTnI在血液中含量上升是心肌损伤的特异性指标。为制备抗cTnI的单克隆抗体，科研人员完成了以下过程。请回答相关问题： (1)单克隆抗体技术的基础是__________技术。 (2)动物细胞培养时，培养基除了添加葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等必要的营养成分外，往往还需加入一定量的__________，以满足动物细胞培养的营养需要。动物细胞培养应在含有________________的混合气体的CO2培养箱中进行。为了防止有害代谢物的积累，可采用____________________的方法，以便清除代谢物。 (3)每隔2周用________作为抗原注射小鼠1次，共注射3次，其目的是_______________。最后一次免疫后第3天，取脾脏内部分组织制成细胞悬液与骨髓瘤细胞诱导融合，常用的化学诱导剂是__________。与植物原生质体融合方法不同的是还可以用________________。如果只考虑细胞两两融合，甲中存在未融合的亲本细胞、__________________细胞和融合的杂交瘤细胞，存在上述多种细胞的原因是____________________________________________。 (4)甲、乙、丙中，只含杂交瘤细胞的是________，过程①表示将甲放在__________培养基上进行培养。过程②表示将乙细胞接种到多孔培养板上，进行多次___________________和________________，其目的是筛选获得足够数量的能分泌抗cTnI抗体的杂交瘤细胞。通过该技术获得的单克隆抗体的优点是____________________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)酶联免疫吸附双抗体夹心法是医学上常用的定量检测抗原的方法，具体原理如图： 据图分析，固相抗体和酶标抗体均能与抗原结合，这是由于不同抗体与同一抗原表面的____________结合。该检测方法中，酶标抗体的作用是_____________和_____________，可通过测定________来判断待测抗原量。 答案　(1)动物细胞培养　(2)血清　95%空气和5%CO2　定期更换培养液　(3)cTnI　刺激小鼠机体产生更多的能分泌抗cTnI抗体的B淋巴细胞　聚乙二醇　灭活的病毒　融合的具有同种核的　细胞融合是随机的，且融合率达不到100%　(4)乙和丙　选择　克隆化培养　抗体检测　能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备　(5)不同部位　与待测抗原结合　催化底物水解　产物量 1．单克隆抗体制备的过程 2．抗原检测的双抗体夹心法 抗原检测常用的胶体金检测法是一种定性检测方法，涉及了抗原抗体的特异性反应。但抗原抗体的结合肉眼并不可见，因此将抗体与胶体金进行偶联。胶体金是金盐被还原成金单质后形成的金颗粒悬浮液，通常为红色，在碱性条件下表面带负电，可以与带正电的物质结合，这两个特性使肉眼无法看见的抗体可以通过胶体金的颜色进行呈现。 抗原检测板上面分为四个部分。第一部分是样品孔，第二部分是胶体金与抗体1(一抗)的偶联物，第三部分是检测线，标记为T，即Test是固定有抗体2(也是一抗，但没有标记，结构有别于前面的一抗)的条带，第四部分是质控线，标记为C，即Control，固定的是能特异性结合抗体的另一种抗体(二抗)。 C线显色的原理：样品向前流动带动胶体金颗粒向前移动，过量的胶体金颗粒到达C线后，其偶联的抗体1与C线的抗体结合，大量积聚后显示红色。若C线处无红色条带，说明抗原检测板质量出现问题，检测结果不可信。 T线显色的原理：加样后，样品向前流动至第二部分时，若样品中含有抗原，与胶体金偶联的抗体1会与之识别并结合，样品继续向前流动至T线时，T线的抗体2也会结合抗原，即形成“T线抗体2—待测抗原—胶体金偶联抗体1”的三元复合物，大量的胶体金在此处固定，显示出红色条带，判断为阳性。如果样品中没有抗原时，T线的抗体则无法抓住胶体金偶联抗体，T线不显色，判断为阴性。 3．(2022·辽宁，24节选)某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。 Ⅰ.N蛋白胞外段抗原制备，过程略。 Ⅱ.N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图。 (1)用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用_________________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的______________中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。 (2)用选择培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行__________培养。用________________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集______________，提取单克隆抗体。 (3)利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成_________________________________ ________________________________________________________________________， 实现特异性治疗。 答案　(1)胰蛋白酶或胶原蛋白　CO2培养箱　(2)克隆化　抗原—抗体杂交　细胞培养液 (3)抗体—药物偶联物(或ADC) 4．(2023·沧州高三质检)人类乳头瘤病毒(HPV)有多种亚型，HPV45属于高危型，与宫颈癌的发生密切相关。L1蛋白是组成HPV病毒衣壳的主要结构蛋白，科研人员进行了抗L1单克隆抗体的制备及研究。 (1)提取HPV45型病毒的________，间隔多次注射到小鼠体内，目的是___________ ________________________________________________________________________。 (2)将得到的4种杂交瘤细胞分别进行动物细胞培养，分别取其上清液进行抗体阳性检测，从中选出能产生“最优抗体”的杂交瘤细胞。检测的流程如图1，检测的结果如图2。 ①在检测时需要将L1蛋白固定于固相载体表面制成固相抗原，并加入多孔板培养槽中的________(填“细胞”或“上清液”)，即待测样本。 ②加入酶标抗体一段时间后，需要用洗涤剂将未与____________结合的酶标抗体洗去。 ③加入相应酶促反应底物显色后，颜色的深浅可代表________________。 ④底物显色越深吸光值越大，据图2结果分析，研究人员认为杂交瘤细胞________(填序号)产生的抗体为“最优抗体”，依据是________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)研究人员将选出的“最优抗体”用于制备成HPV45型病毒抗原检测试剂盒，利用该试剂盒可以快速初筛是否感染HPV45型病毒，反映出单克隆抗体最广泛的用途是____________。 答案　(1)L1蛋白　刺激小鼠产生更多能分泌抗L1抗体的B淋巴细胞　(2)①上清液　②抗L1抗体　③抗L1抗体的量　④1　不同稀释倍数下，1的吸光值最大，说明酶标抗体与1产生的抗体结合最多，1产生的抗体与抗原结合能力最强　(3)作为诊断试剂 1．如图表示畜牧业生产上培育某种优良种牛的两种方法，请分析回答下列有关问题： (1)方法Ⅰ和方法Ⅱ培育优良种牛的本质区别是方法Ⅰ涉及的生殖方式为______生殖，方法Ⅱ涉及的生殖方式为______生殖。 (2)过程①应用的技术是________________。克隆牛F的核基因来源于________(填“奶牛B”“奶牛C”或“奶牛D”)。 (3)公牛A的精子在体外完成获能，通常采用的获能液中常见的有效成分有_______ ______________________________________________________________(写出两种)等。 (4)胚胎移植前需对受体母牛C进行____________处理，为供体的胚胎提供相同的生理环境，以确保胚胎移植后能正常发育。移植后的胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)应用胚胎分割技术，应选择发育良好、形态正常的________________进行分割。如需对早期胚胎进行性别鉴定，宜取囊胚期的________细胞进行鉴定。 答案　(1)有性　无性　(2)体细胞核移植技术　奶牛C　(3)肝素、Ca2＋载体　(4)同期发情　受体子宫对外来胚胎基本上不发生排斥反应　(5)桑葚胚或囊胚　滋养层 2．(2023·湖北，22节选)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。 回答下列问题： (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对________________________和____________________生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是____________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)不需要　使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合　(2)未融合的亲本细胞　融合的具有同种核的细胞　(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞 解析　 (1)浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不能通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原－抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。 3．(2021·湖南，22改编)M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： (1)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是____________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是________ ________________________________________________________________________。 从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为______________________(答出两点即可)，功能上具有____________________。 (3)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的__________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活的实验思路：__________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养 (2)动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难　细胞体积小，细胞核大，核仁明显　发育的全能性　(3)B　取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交 解析　(3)先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路见答案。 4．(2023·盐城高三调研)目前市售的“早早孕试纸”是通过孕妇妊娠早期尿液检验HCG(人绒毛膜促性腺激素)，其原理如图： 注：胶体金可与蛋白质牢固结合，大量聚集时肉眼可见红色；样品垫是滴加样品的位置；结合垫含有可移动的胶体金标记的HCG抗体1、胶体金标记的鼠IgG；T线固定了HCG抗体2；C线固定了抗鼠IgG抗体。 (1)若“早早孕试纸”产品质量合格，使用时________(填“C”“T”或“C和T”)线一定会显色，若该线显色，则表明待测样品从样品垫顺利到达吸水垫。若使用该试纸检测时结果表明妊娠，则图中________(填“C”“T”或“C和T”)线显色，且发生了________种抗原—抗体杂交。 (2)试纸中用到的抗体一般采用单克隆抗体技术制备，如抗鼠IgG抗体的制备过程为：先将________注入到小鼠体内，从小鼠的________中获取B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，并筛选出杂交瘤细胞，再进行____________________________，即可获得足够数量的能产生特定抗体的杂交瘤细胞。 (3)如今，单克隆抗体被广泛应用于医学领域。人类常用鼠生产鼠源单克隆抗体，由于使用鼠源单克隆抗体时存在一定的免疫排斥反应，科学家发明了嵌合重组抗体技术，以减弱免疫排斥： ①据图分析，使用人鼠嵌合抗体治疗疾病可以降低免疫排斥反应的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 ②科学家在制备人鼠嵌合抗体时采用的方法为：将鼠抗体的可变区基因与人抗体的恒定区基因进行拼接后通过一定的手段导入生物体，让其正常表达。将鼠的基因与人的基因进行拼接应用了____________的原理。在该过程中，人抗体可变区基因________(填“需要”或“不需要”)与鼠抗体可变区基因相同。 答案　(1)C　C和T　3　(2)鼠IgG　脾　克隆化培养和抗体检测　(3)①人鼠嵌合抗体减少了鼠源性抗体成分　②基因重组　不需要 解析　(1)C线为质控线，若C线显色，则表明待测样品从样品垫顺利到达吸水垫，故C线一定要显色；若C线和T线均显色，说明试纸质量合格且已经妊娠，此时发生了HCG抗体1和HCG的结合、HCG和HCG抗体2的结合、鼠IgG和抗鼠IgG抗体的结合。(2)为了产生抗鼠IgG的单克隆抗体，应该向小鼠体内注射鼠IgG并从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞，用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，用选择培养基筛选出杂交瘤细胞后可进行克隆化培养和抗体检测来获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞。(3)鼠源性成分对于人类来说属于异源性成分，人鼠嵌合抗体减少了鼠源性抗体成分，因此减弱了免疫排斥反应。鼠的基因和人的基因进行拼接属于广义的基因重组。制备人鼠嵌合抗体的过程使用的是人抗体的恒定区和鼠抗体的可变区，因此人抗体可变区基因与鼠抗体可变区基因不需要相同。 5．(2023·邯郸高三期中)埃博拉病毒(EBOV)是一种能导致人类出血热的致死性病毒，对公共卫生具有较严重的危害。EBOV的NP蛋白在病毒复制中具有重要作用，也是检测EBOV的重要靶蛋白。实验人员用NP蛋白免疫小鼠来制备抗EBOV单克隆抗体，过程如图所示。回答下列问题： (1)选择骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合，原因是骨髓瘤细胞具有__________________的特征。体外培养骨髓瘤细胞时，应该在合成培养基的基础上添加________等天然成分。与植物细胞融合相比，诱导骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合特有的方法是___________________。 (2)获得的杂交瘤细胞还需要进行克隆化培养和抗体检测，原因是________________ ________________________________________________________________________。 (3)抗EBOV单克隆抗体可用于检测血浆中EBOV的含量，检测原理如图所示。 ①检测前，先将抗EBOV单克隆抗体固定在支持物上，然后向检测体系中加入一定量含有EBOV的血浆(其NP蛋白称为待测抗原)和等量酶标记的NP蛋白(酶标记抗原)，目的是让待测抗原、酶标记抗原与抗EBOV单克隆抗体________结合。 ②保温一段时间后洗涤，再向检测体系中加入一定量的白色底物，若检测体系蓝色越浅，则说明________________________________________________________________________。 答案　(1)能无限增殖　血清　灭活病毒诱导法　(2)与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞有多种，且杂交瘤细胞不一定能产生抗EBOV(NP蛋白)的抗体 (3)①竞争性　②血浆中NP蛋白(EBOV)含量越高 解析　(3)根据图示反应原理，待测抗原中的目标抗原和酶标记抗原竞争结合固相抗体。酶标记抗原的酶可催化白色底物变为蓝色产物，所以如果待测抗原中目标抗原越多，则酶标记抗原和抗体结合得越少，催化生成的蓝色产物就越少，检测体系蓝色就越浅。 学科网（北京）股份有限公司 $$