2.2.2 动物细胞融合技术与单克隆抗体-2024-2025学年高二生物同步高效教学课件（人教版2019选择性必修3）

二、 动物细胞融合技术与单克隆抗体 1.你从视频中了解到单克隆抗体具有哪些特点？ 2.请你尝试解释一下“单克隆抗体”一词的含义。 能准确识别抗原的特点。 3. 要制备单克隆抗体，就需要找到一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞。 什么细胞能产生抗体？什么细胞具有无限增殖的能力？ （已免疫）B淋巴细胞 能产生抗体 肿瘤细胞 能无限增殖 时间 成果 19世纪30年代 观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织有多核细胞 1858年 观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 1875年 第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 1876年 在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。 1962年 日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1965年 英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合 1974年 华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年 Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代 发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合) 动物细胞融合技术的发展历史 动物细胞融合 动物细胞培养 一. 动物细胞融合技术 1.概念： 使两个或多个动物细胞结合形成 一个细胞的技术。 2.结果： 形成的 具有原来两个或多个细胞的 。 3.原理： 4.诱导融合方法： 杂交细胞 遗传信息 细胞膜具有一定的流动性 物理法：离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇（PEG) 生物法：灭活病毒诱导法 与植物原生质体融合的方法相同 ——动物细胞融合特有 思考.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？ 用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 动物细胞融合 动物细胞培养 6.意义： 突破了 的局限， 使 成为可能。 有性杂交 远缘杂交 5.动物细胞融合的过程： 细胞膜融合 细胞核融合 细胞质融合 细胞融合的实质（标志） 7.应用： 成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，为制造单克隆抗体开辟了新途径。 一. 动物细胞融合技术 诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？为什么？ 不一定，诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。 比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 基本原理 融合前处理 诱导方法 用 途 意 义 细胞膜的流动性、 植物细胞的全能性 细胞膜的流动性 用纤维素酶、果胶酶去壁 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散 培育新品种 制备单克隆抗体 物理法：电融合法、离心法 化学法：PEG融合法， 高Ca2+ -高PH融合法 电融合法，PEG融合法，灭活的病毒 植物体细胞杂交和动物细胞融合比较 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种 突破有性杂交的局限， 使远缘杂交成为可能 (1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(　　) (2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构(　　) (3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(　　) × √ × 1.右图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是( ) A．若a细胞和b细胞是植物细胞，需先去分化再诱导融合 B．a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现 C．c细胞的形成与a、b细胞膜的选择透过性都有关 D．c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因 B 2.如图表示仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列正确的是（ ） A. 细胞A和细胞B必须为同种细胞才能融合 B. 细胞C同时有细胞A和细胞B的遗传物质 C. 该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性 D. 此过程的原理是动物细胞具有全能性 B 3.对比动物细胞融合和植物体细胞杂交技术，下列论述合理的是（ ） A. 均可使用PEG、电融合或灭活病毒诱导细胞融合 B. 两者都可以跨越种属间的生殖隔离 C. 两者都可以体现细胞的全能性 D. 在适宜的条件下，均可产生完整个体 B 缺陷：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。 不能无限增殖产生大量抗体 动物体内 抗原 刺激 浆细胞 抗体 筛选单一B细胞 增殖分化 所处环境抗原不纯 体内产生的特异性抗体多达百万种 如何解决这个问题呢？ 二. 单克隆抗体 1.早期获得抗体的方法： 12 （1）基本原理 动物细胞融合 杂交细胞 动物细胞培养 单克隆抗体 骨髓瘤细胞 （能无限增殖） 一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体） 杂交瘤细胞 既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体 单 克 隆 抗 体 一个B淋巴细胞 细胞群 抗体 克隆 2.单克隆抗体制备 自主复习（教材P48-49），解决以下问题： 1.制备单克隆抗体的第一步是什么？ 2.制备单克隆抗体过程中进行了几次筛选？ 每次筛选目的？方法（了解）？ 二. 单克隆抗体 （2）制备过程 注射特定抗原 从脾脏中获取B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 培养骨髓瘤细胞 目的是获得产生特定抗体的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 与B淋巴细胞融合 诱导融合 多种杂交细胞 选择培养基培养 只有杂交瘤细胞能生长 杂交瘤细胞 既能迅速大量增殖 又能产生抗体 特点 第一次筛选 B-B细胞 B-瘤细胞 瘤-瘤细胞 知识拓展：第一次筛选 ①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。 ②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。 ③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。 不能无限增殖，死亡 该杂交瘤细胞仍然不符合要求 在培养基中加入氨基蝶呤 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞（A） 合成DNA D途径 S途径 D途径 A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3 资料： 杂交瘤细胞 第二次筛选 96孔板培养和筛选 克隆化培养和抗体检测 经多次筛选 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 能产生所需抗体的杂交瘤细胞 检测原理： 抗原和抗体特异性结合 AB1、AB2、AB3 …… 第二次筛选 【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）。 阳性孔 有限稀释法、抗原 — 抗体杂交法 阳性克隆的筛选和克隆化培养 在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。 第1次筛选 选择性培养基——选出杂交瘤细胞 两次筛选的目的和手段分别是什么？抄在课本上，填空 第2次筛选 选能产特定抗体的杂交瘤细胞 体外培养 体内培养 注射到小鼠腹腔内 从细胞培养液中提取 从小鼠腹水中提取 单克隆抗体 17 【关键点】单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较 项目 第一次筛选 第二次筛选 筛选 原因 诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 筛选 目的 筛选出？ 选出 的杂交瘤细胞 筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞 能分泌所需抗体 死亡 抗体检测 生长 （1）作为诊断试剂——最广泛的应用 P50最后一段 抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体 比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。 艾滋病检测试剂 3.单克隆抗体的应用 甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用AFP作为______免疫小鼠，制备__________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。 抗原 抗AFP单克隆抗体 AFP 肿瘤 结合同位素的单抗 (主要用于癌症治疗)如：单克隆抗体+药物 =“生物导弹” 优点：位置准确、效果高、副作用小 （2）用于运载药物 实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤 1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 2. 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？ 3. 单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？ 抗体主要发挥靶向运输作用，药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。 放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高； ADC能够协同发挥抗体特异性识別的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 （3）作为药物治疗疾病 诱导其融合的方法有哪些？ 注射特定抗原的目的是什么？ 两次筛选的目的 获得能产生特定抗体的B淋巴细胞 物理：电融合法 第1次筛选：得到杂交瘤细胞（多种）。 多种B淋巴细胞 B淋巴细胞 注射特定抗原 骨髓瘤细胞 融合 B-B细胞 杂交瘤细胞 瘤-瘤细胞 多种杂交瘤细胞 符合要求的杂交瘤细胞 抗原—抗体杂交法 筛选2 克隆化培养 体外培养 小鼠腹腔内增殖 单克隆抗体 B细胞 瘤细胞 选择培养基 筛选1 化学：聚乙二醇 （PEG）融合法 生物：灭活病毒诱导法 第2次筛选：得到能产生特定抗体的杂交瘤细胞。 【小结】 单克隆抗体的优点 (1)能准确地识别抗原的细微差异。灵敏度高 (2)与特定抗原发生特异性结合。特异性强 (3)可以大量制备。 多种B淋巴细胞 B淋巴细胞 注射特定抗原 骨髓瘤细胞 融合 B-B细胞 杂交瘤细胞 瘤-瘤细胞 多种杂交瘤细胞 符合要求的杂交瘤细胞 抗原—抗体杂交法 筛选2 克隆化培养 体外培养 小鼠腹腔内增殖 单克隆抗体 B细胞 瘤细胞 选择培养基 筛选1 【小结】 单克隆抗体制备过程中应用到的细胞工程技术手段 杂交瘤细胞特点 原理 动物细胞融合、 动物细胞培养 细胞膜具有一定的流动性、 细胞增殖 既可以产生抗体，又可以大量增殖 1.抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列叙述不正确的是( ) A.抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡 B.ADC可通过胞吞方式进入肿瘤细胞 C.单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合 D.肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，会产生新的蛋白质 A 【习题检测】 2.(2023·梅州虎山中学高三质检)抗体药物偶联物(ADC)是采用特定技术将具有生物活性的小分子药物连接到单克隆抗体上，实现对肿瘤细胞精准的选择性杀伤。ADC的结构及其发挥作用的机理如下图，有关叙述不正确的是(　　) A．ADC实现精准杀伤肿瘤细胞的基础是抗体与抗原特异性结合 B．该肿瘤细胞死亡是在ADC诱导下细胞自动死亡的过程 C．将特定抗原注射到小鼠体内，可以从小鼠血清中获得单克隆抗体 D．对特定抗原筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养可获得单克隆抗体 C 3.(2022山东)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列错误的是（ ） A．双抗可同时与2种抗原结合 B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞 C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原 D．同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞 D 4.下图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程，有关叙述错误的是( ) A．图中实验小鼠注射的甲是能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原 B．利用PEG融合法、灭活病毒诱导法和电融合法等方法可诱导细胞融合获得乙 C．用特定的选择培养基对乙进行筛选，融合细胞均能生长，未融合细胞均不能 生长 D．丙需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选后可获得大量能分泌所需抗体 的丁 C (3)新冠抗体是人体产生的能直接攻击新冠病毒的蛋白质，直接给患者注射抗体能起到很好的治疗效果。一般可以通过______________、细胞培养和蛋白质提取技术制备单克隆抗体。若要制备针对新冠病毒的单克隆抗体，需要用________多次注射小鼠，之后再从小鼠脾脏中分离出__________________，与小鼠骨髓瘤细胞共同制备杂交瘤细胞。要得到满足生产需要的杂交瘤细胞至少需要筛选_____次。 (动物)细胞融合 S蛋白 已免疫的B淋巴细胞 2 5.(2023·中原名校联盟节选) 6.(2020·全国卷Ⅰ，38)为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。 回答下列问题： (1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是_______________________________________________。 诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞 (2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：___________________________________________________________________________________。 (3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于___________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_________________________。 图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是______________________________。 取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液　 选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的结合具有特异性 一、概念检测 1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ） A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性 B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合 C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞 D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株 2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ） A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒 B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体 C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞 D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体 C A 练习与应用（P51） 二、拓展应用 假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题?解决这些问题的大致思路是怎样的?这样做会有什么风险?请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。 可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。 练习与应用（P51） Lavf58.51.100 $$