1.2 微生物的培养技术及应用-【生物好课】2024-2025学年高二生物同步教学课件（人教版2019选择性必修3）

疑难破112页 课堂总结 果 酒 果 醋 腐 乳 泡 菜 微生物 原理 发酵条件 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌 酵母菌的无氧呼吸产生酒精 醋酸菌的有氧呼吸产生醋酸 毛霉等产生蛋白酶和脂肪酶 乳酸菌无氧呼吸产生乳酸 18~30 ℃ 前期有氧， 后期无氧 30~35℃ 通入氧气 15～18℃ 常温 无氧条件 课堂总结 第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用 本节聚焦 1.什么是培养基？如何配制？ 2.什么是无菌技术？ 3.怎样进行酵母菌的纯培养？ 问题：在传统食品的制作过程中，我们没有接种菌种，而是利用了天然存在的菌种。菌种差异，杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品品质不一。 如何获得纯净的微生物培养物，防止杂菌污染是研究和应用微生物的前提。 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。 实验室培养微生物关键: (1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件 (2）确保其它微生物无法混入 (3)并将需要的微生物分离出来 培养基 无菌技术 纯化培养 一、培养基的配制 【自主探究】请结合教材9-10页，思考以下问题： １.什么是培养基？ ２.培养基的用途有哪些？ ３.培养基的种类有哪些？ ４.培养基的必备营养成分有哪些？ ５.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。 1.定义： 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖 的营养基质。 2.作用： 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 一、培养基的配制 3.分类----按物理性质 培养基种类 特点 应用 液体培养基 不含凝固剂，呈液体状态 扩大培养、工业生产等 固体培养基 含凝固剂(如琼脂)，呈固体状态 微生物分离、鉴定、 计数、保藏菌种等 3.分类----按功能 一、培养基的配制 ①选择培养基 ②鉴别培养基 在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长的培养基。 用于培养、分离出特定微生物。 在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用以鉴别不同种类的微生物的培养基。 用于鉴别不同种类的微生物。 具体处理 原理 目的 选择培养基 鉴别培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌 分离固氮菌 分离自养微生物 鉴别分解尿素的细菌 加入青霉素 不加氮源 不加有机碳源 加入酚红培养基 加入刚果红 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用 固氮微生物能利用空气中的氮气 自养型微生物能利用无机碳源 尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。 刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。 加入伊红-亚甲蓝琼脂培养基 鉴别纤维素分解菌 鉴别大肠杆菌 菌落呈现深紫色 4.基本成分： 一、培养基的配制 水、碳源、氮源、无机盐 碳源 无机碳源： CO2、CO32-、HCO3- 有机碳源： 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等 自养微生物 异养微生物 功能：构成细胞的物质又是能源 氮源 无机氮源： 氮气、NH4＋、NO3-、硝酸盐等 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。 有机氮源： 功能：合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物 Na+、K+ 、Mg2+、Cl- 、H2PO4- HPO42-等 无机盐 功能：细胞内的组成成分；维持渗透压等 一、培养基的配制 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等 蛋白胨 10g 氮源、碳源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000mL 水 1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等 营养物质。 5.特殊需求---- 一、培养基的配制 满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求 ④培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。 ①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素； ②培养霉菌时，需要将培养基调至酸性（4.0-5.8）； ③培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性（7.0-8.0）； 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。 实验室培养微生物关键: (1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件 (2）确保其它微生物无法混入 (3)并将需要的微生物分离出来 培养基 无菌技术 纯化培养 二、无菌技术 1.无菌操作的对象是什么？ 2.获得纯净培养物的关键是什么？ 3.常见的消毒和灭菌的方法有哪些？ 请同学们自主学习教材P10-11页，小组合作思考讨论完成问题。 类型 适用范围 操作方法 消 毒 灭 菌 二、无菌技术 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。 无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 为了避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台 并在酒精灯火焰附近进行。 注意 对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌 范围 使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部 一部分微生物。 1.消毒 ①概念： 二、无菌技术 类型 操作方法 适用范围 煮沸消毒 100 ℃煮沸5~6 min 家庭餐具等生活用品 63~65 ℃消毒30 min； 72~76 ℃处理15 s； 80~85 ℃处理10~15 s 巴氏消毒 不耐高温的液体，如牛奶 化学药物 酒精擦拭双手、氯气消毒水 紫外线照射30 min 紫外线 接种室、接种箱、超净工作台 水源等 生物消毒法 利用生物或其代谢物除去 环境中的部分微生物 净化污水、污泥 ②常用方法： 在照射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂 溶液等消毒液，可以加强消毒效果。 2.灭菌 　　 ①概念： 指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物， 包括芽孢和孢子。 二、无菌技术 芽孢 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的 休眠体，叫做芽孢。 芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的 抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。 孢子 细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。 疑难破115页 ②方法： 2.灭菌 二、无菌技术 湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。 其中高压蒸汽灭菌的效果最好。 以水蒸气为介质，压力100 kPa、温度121 ℃，15-30 min 原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性 优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些 微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。 对象：培养基、无菌水等 高压蒸汽灭菌锅的使用 原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性等 对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于玻璃器皿 (如试管、培养皿、 吸管)，金属器具 (如镊子、剪刀等)的灭菌 干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h 　　 灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧P13页 原理：使微生物燃烧 对象：接种工具如涂布器、接种环、接种针，以及接种过程中的 试管口或瓶口等易被污染部位 ②方法： 2.灭菌 二、无菌技术 二、无菌技术 疑难破P115 请回答下列问题： （1）培养基用什么方法灭菌？ （2）双手用什么方法消毒？ （3）接种环用什么方法灭菌？ （4）涂布器用什么方法灭菌？ （5）为保证无杂菌，实验操作都要在哪里进行？ 高压蒸汽灭菌法 灼烧灭菌法 浸泡在75%酒精中，使用前灼烧 超净工作台并在酒精灯火焰旁 75%酒精擦拭 现学现用： 二、无菌技术 疑难破P115 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。 实验室培养微生物关键: (1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件 (2）确保其它微生物无法混入 (3)并将需要的微生物分离出来 培养基 无菌技术 纯化培养 三、微生物的纯培养 1.培养物、纯培养物、纯培养概念辨析 ①培养物： 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含 特定种类微生物的群体。 ②纯培养物： 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 ③纯培养： 获得纯培养物的过程就是纯培养。 酵母菌的纯培养 探究•实验 1.菌落 ①概念： ③功能： 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部繁殖形成的 肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。 颜色、形状、大小等。 鉴定菌种的重要依据。 ②特征： 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 2.纯培养 原 理： 采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。 酵母菌的纯培养 探究•实验 微生物群 划线或稀释 单个细胞 单个菌落 繁殖 3.材料用具： 酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂、蒸馏水、天平、 小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸（或报纸）、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。 4.纯培养的步骤： 配置培养基 灭菌 倒平板 接种和分离 培养 制备（固体）培养基 制备培养基 接种酵母菌 分离酵母菌 培养酵母菌 分析与评价 1.配制培养基： 称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热 煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡 萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。 2.灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸， 并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100 kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min; 将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入 干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h. （有时需调pH） 酵母菌的纯培养 探究•实验 马铃薯琼脂培养基 先调pH后灭菌，防止杂菌污染 3.倒平板 待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 制备培养基 接种酵母菌 分离酵母菌 培养酵母菌 分析与评价 酵母菌的纯培养 探究•实验 过高：烫手；过低：琼脂会凝固 a.避免培养基中的水分过快蒸发； b.防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可 以分离得到单菌落。 单个细胞 微生物群 单个菌落 划线 生长繁殖 制备培养基 接种酵母菌 分离酵母菌 培养酵母菌 分析与评价 酵母菌的纯培养 探究•实验 平板划线法 ①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。 ②在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养 液的试管的棉塞。 ③将试管口通过火焰。 ④在火焰附近用接种 环蘸取一环菌液。 ⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞。 ⑥在火焰附近将培养皿打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。 接种和分离酵母菌 蘸取菌液前灼烧接种环： 杀死接种环上原有微生物，防止外来杂菌污染培养基。 冷却后再接种： 防止高温杀死微生物。 每次划线前灼烧接种环： 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞 下一次划线总是从上一次划线的末端开始划线：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 最后一次的划线与第一次的划线不能相连：最后一次划线已将微生物稀释成单个细胞，如果与第一次的划线相连，则会增加微生物的数目，达不到纯化的效果。 最后一次划线后灼烧接种环： 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者 ①灼烧接种环的时间和目的 疑难破P116 ②总是从上一次划线的末端开始划线的原因:线条末端微生物的数目比起始处要少,从上一次划线的末端开始划线,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。 ③最后一次的划线与第一次的划线不能相连的原因:最后一次划线已将微生物稀释成单个细胞,如果与第一次的划线相连,则会增加微生物的数目,达不到纯化的效果。 疑难破P116 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板都倒置，放入28 ℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48 h。 制备培养基 接种酵母菌 分离酵母菌 培养酵母菌 分析与评价 酵母菌的纯培养 探究•实验 未接种的培养基：检验灭菌是否合格 a.避免培养基中的水分过快蒸发； b.防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。 （空白培养基） 1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明 了什么？ 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长， 如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。 制备培养基 接种酵母菌 分离酵母菌 培养酵母菌 分析与评价 探究•实验 2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？ 这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了 不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？ 在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致， 并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功； 如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或 者无菌操作不规范等原因引起的。 酵母菌的纯培养 课堂小结 酵母菌的纯培养 课堂总结 微生物的基本培养技术 湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌 配制培养基→灭菌→倒平板→接种和分离→培养 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒、紫外线消毒、生物消毒法 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 基础成分：水、碳源、氮源、无机盐 特殊条件：pH、特殊营养物质及O2的需求 消毒 灭菌 评估论点的可信程度 有人说：吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。这一论点是否可信？ 所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。 因此，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力的论点是值得怀疑的。 思维训练 一、概念检测 1. （1）× （2）√ ）（3）× 2. 日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温储存通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。 二、拓展应用 1. （1）培养皿和培养基。 （2）接种。 （3）通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。 2. （1）意味着培养液中 O2 含量不同。 （2）培养液中 O2 含量越高，酵母菌种群密度越大。 （3）这时候已经达到了环境容纳量。 练习与应用 课堂总结 微生物的基本培养技术 湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌 配制培养基→灭菌→倒平板→接种和分离→培养 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒、紫外线消毒、生物消毒法 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 基础成分：水、碳源、氮源、无机盐 特殊条件：pH、特殊营养物质及O2的需求 消毒 灭菌 【本节聚焦】 怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养基的原理 如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物 测定微生物数量的常用方法有哪些？ 1.2 微生物的培养技术及应用 二 微生物的选择培养和计数 提出问题 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要向从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其是当要分离的微生物在混合的菌种中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。 一、选择培养基 ①水生栖热菌的应用 水生 栖热菌 耐高温 DNA聚合酶 提取 用于 体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR） ②筛选原理 水生栖热菌能在70~80℃高温条件下生存， 绝大多数微生物在此条件下不能生存。 1.筛选微生物的实例 水生栖热菌的筛选 美国黄石国家公园的热泉 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 2.实验室微生物的筛选原理 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 3.选择培养基的概念 一、选择培养基 尿素[CO(NH2)2]含氮量高，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-，NH4+等被植物吸收。这些细菌能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。 思考·讨论 选择培养基配方的设计 讨论： 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中 能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方 该如何设计？ 设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。 这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分（碳源、水、无机盐）基本相同。 3.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 2.从物理性质来分，该培养基属于什么培养基？ 固体培养基，因为添加了凝固剂琼脂 培养基条件 筛选的微生物 设计原理 高温 尿素作为唯一碳源 不加氮源 不加有机碳源 加入青霉素 高pH 固氮微生物 自养型微生物 酵母菌等真菌 耐高pH的微生物 耐高温的微生物 固氮微生物能利用空气中的氮气 自养型微生物能利用无机碳源 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用 微生物的生长需要适宜的pH 微生物的生长需要适宜的温度 一、选择培养基 4.选择培养基的实例 分解尿素的细菌 分解尿素的细菌利用尿素作为碳源 疑难破P119 问题：由于土壤细菌的数量庞大，那么怎么获得能分解尿素的 细菌的纯培养物呢？ 要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，一个活菌能在培养基表面形成单个菌落。 1. 稀释涂布平板法原理 2.稀释涂布平板步骤 取样→等比稀释→涂布→培养 二、微生物的选择培养 10g 铲取土样，将样品装入纸袋中。 1 土壤取样 2.稀释涂布平板步骤 90mL无菌水 2 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。 1×10 1×101 90mL无菌水 2 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1×107 1×106 1×105 1×104 1×103 1×102 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 9mL无菌水 2.稀释涂布平板步骤 二、微生物的选择培养 3 取0.1mL菌液，滴加到 选择培养基表面 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 6 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 4 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 5 2.稀释涂布平板步骤 二、微生物的选择培养 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温 培养箱中培养1~2d。 在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 二、微生物的选择培养 2.稀释涂布平板步骤 定点 1 比较稀释涂布平板法和平板划线法  主要步骤 接种工具 获取菌体 能否用 于计数 培养 效果图 共同点 疑难破P118 稀释涂 布平板法 系列梯度 稀释、涂 布平板 涂布器 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 能   都能获得细胞菌落,达到分离纯化微生物的目的,也可以观察菌落特征; 平板 划线法 接种环在固体培养基表面连续划线 接种环 在具有显著的单菌落特征的区域挑取菌体 不能   １.稀释涂布平板法进行计数的原理是什么？为什么可以用于细菌的计数？ ２.稀释涂布平板法进行计数有什么注意事项？ ３.通过稀释涂布平板法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗 ？ ４.用显微镜进行直接计数方法统计的细菌的数目与它的实的际数目相同吗? 学习任务：阅读P18，思考一下问题 三、微生物的数量测定 三、微生物的数量测定 1.活菌计数法：稀释涂布平板法 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 （1）原理： 三、微生物的数量测定 1.间接计数法：稀释涂布平板计数法 （2）计算公式 每克土样中分解尿素的细菌数= C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时吸取的稀释液体积 M：稀释倍数 C÷VxM ①一般选择菌落数在30-300的平板进行计数。 ②同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。 （3）计算原则 平行重复原则 【练习】 小张同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。用稀释倍数为106的培养基，涂布了三个平板，测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）? 注意：稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这三位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有做重复实验（至少涂布3个平板），结果不具有说服力。 乙：其中1个平板的计数结果与另外2个相差悬殊，说明操作有误， 结果重复性差，需重做实验。 因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。 【实例分析】 2.显微镜直接计数： （1）原理： 不能区分死菌和活菌，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，统计结果会偏大。 为了避免上述缺点，可以染色后进行显微镜计数。 三、微生物的数量测定 利用特定的细菌计数板（细菌等较小细胞）或血细胞计数板（酵母菌、霉菌孢子等较大细胞），在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 （2）缺点： 台盼蓝染色法 学习任务：结合课本P17全部内容，P18~19，思考回答下列问题； 1.选择培养能分解尿素的细菌的实验原理是什么？ 2.微生物选择培养的实验步骤是什么？ 3.每个步骤如何避免杂菌污染？ 4.梯度稀释的操作是怎样的？ 5.稀释涂布平板法是如何操作的？ 6.实验过程中如何体现平行重复原则和对照原则？ 三、微生物的数量测定 城市：公园里、街道旁、花盆中 农村：农田里、菜园里 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长， 绝大多数分布在距地表3--8cm的土壤层。 1.土壤取样 取样时一般要铲去表层土。 取样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要 ，操作完成后，一定要洗手。 灭菌 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 实验步骤 土壤 取样 梯度 稀释 涂布 接种 培养 观察 制备 培养基 菌落 计数 2.样品的稀释 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 作为对照，用来验证选择培养基的选择作用 ②牛肉膏蛋白胨培养基 3.制备培养基 将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目。 多于 ①尿素为唯一氮源的选择培养基 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 4.涂布平板 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度， 以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。 3个选择培养基平板 1个牛肉膏蛋白胨 培养基平板 测细菌数：一般用104、105、106 稀释液 可将稀释的范围放宽一点，如103- 107，保证平板上的菌落数在30-300之间。 5.培养与观察 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1个未接种的 选择培养基平板 1个未接种的 牛肉膏蛋白胨培养基平板 接种后的平板 3个选择培养基平板 1个牛肉膏蛋白胨 培养基平板 将上述平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d； 稀释104倍 稀释105倍 稀释106倍 5.培养与观察 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果 （防止因培养时间不足而导致菌落数目遗漏）； 结果分析与评价 1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出 一些菌落？（提示本实验有两组对照） 没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 一组对照：未接种的牛肉膏蛋白质培养基平板 未接种的选择培养基平板 结果分析与评价 1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选 出一些菌落？（提示本实验有两组对照） 另一组对照：已接种的牛肉膏蛋白质培养基平板 105对照 105下涂布的3个选择培养基 如果接种后的牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落明显多于选择培养基的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌，即选择培养基具有选择作用 对分离的菌种进行鉴定 1.菌落特征鉴别法 A：支原体的菌落 B：酵母菌的菌落 C：细菌的菌落 D：细菌和霉菌混杂的菌落 E：放线菌的菌落 F：霉菌的菌落 以微生物在固体培养基表面形成的菌落形状、大小、颜色、 光泽度、透明度等特征进行鉴定。 疑难破P119 2.指示剂鉴别法 对分离的菌种进行鉴定 疑难破P119 细菌合成的脲酶可将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强， pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，菌落周围变红，说明该微生物能够分解尿素。 3.染色鉴别法 纤维素（多糖）能与刚果红形成红色复合物，但其水解产物纤维二糖和葡萄糖不能与刚果红形成红色复合物。 在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，接种土壤微生物培养，菌落周围出现透明圈，可初步鉴定该微生物为纤维素分解菌。 几种纤维素分解菌 在刚果红培养基上形成的透明圈 P20课后习题 培养基分类----按功能 ②选择培养基 将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 用于培养、分离出特定微生物。 ①鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用以鉴别不同种类的微生物的培养基。 用于鉴别不同种类的微生物。 疑难破P114 教材P9(整理笔记） 具体处理 原理 目的 选择培养基 鉴别培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌 分离固氮菌 分离自养微生物 鉴别分解尿素的细菌 加入青霉素 不加氮源 不加有机碳源 加入酚红 加入刚果红 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用 固氮微生物能利用空气中的氮气 自养型微生物能利用无机碳源 尿素被分解产生氨，培养基呈 碱性，酚红指示剂变红。 刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。 加入伊红-亚甲蓝 鉴别纤维素分解菌 鉴别大肠杆菌 菌落呈现深紫色，并带有金属光泽 教材P30 一、概念检测 1. （1）√ （2）√ （3）√ 2. D 二、拓展应用 1. 反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此从中分离能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 练习与应用 P20拓展应用2．地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%〜60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。 已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。 当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物； 而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。 几种纤维素分解菌 在刚果红培养基上形成的透明圈 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 (2)纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 2. (1) ①土壤取样： ②制备培养基 ③样品梯度稀释 ④涂布平板 ⑤微生物的培养与观察 ⑥挑选产生透明圈的菌落 几种纤维素分解菌 在刚果红培养基上形成的透明圈 可选纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土 （以纤维素为唯一碳源，并加入刚果红） (3)这是人工创建适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 $$