1.2 微生物的培养和应用（第3课时）（情境教学课件）-【大单元教学】高二生物同步备课系列（人教版2019选择性必修3）

nullnull第2节 微生物的培养技术和应用 第3课时 微生物的选择培养 和计数 高中生物学 | 人教版（2019）| 选择性必修3·生物技术与工程 【生活情境】变质食物的微生物 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。 如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？ 选择培养 情境导入 2 【科学实例】水生栖热菌的发现 【资料】1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌（Thermus Aquaticus），进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？ 筛选思路： 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境 （热泉、火山口） 寻找 寻找 课程标准内容要求· 素养目标 1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 2.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 1.通过实例，理解各类微生物都能适应其生活环境。（生命观念） 2.通过对土壤中分解尿素的细菌进行分离和计数，理解并掌握微生物计数的方法。（科学探究） 3.根据微生物的代谢类型，配制选择培养基，总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。（科学思维） 教学目标 课程标准内容、素养目标 选择培养基 1 微生物的选择培养 2 目录 CONTENTS 微生物的数量测定 3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 4 目录页 5 一、选择培养基 自然界筛选微生物的原理 实验室筛选微生物的原理 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 ——利用选择培养基分离 热泉 冰川 石油污染的土壤 耐寒微生物 耐热微生物 石油分解菌 利用改变培养条件进行选择培养 利用添加某种特定化学物质进行选择培养 利用营养缺陷进行选择培养 一、选择培养基 1.选择培养基的概念 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 考虑某些微生物的特殊营养需求或它们对某些化学物质具有的抗性。 调节温度、pH等生长条件，只有适应的微生物可以生长 添加杀伤性物质，有抗性的微生物可以生长，无抗性的死亡 营养缺陷的微生物不能正常生长 2.设计选择培养基的思路 基础培养基生长的菌落 一、选择培养基 培养基中加入氨苄青霉素 具有氨苄青霉素抗性的菌落 没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰 思考 1.怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌？ 一、选择培养基 3.选择培养基的实例 目的 原理 配制选择培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长 分离固氮菌 分离自养型微生物 分离耐酸菌 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用 固氮微生物能利用空气中的氮气 自养型微生物能利用无机碳源 耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长 使用加入青霉素的培养基 使用不加氮源（以N2为氮源）的培养基 使用不加有机碳源（以CO2为碳源）的培养基 使用将pH调至酸性的培养基 一、选择培养基 思考 2.怎么证明一个选择培养基有选择性？ 设计思路：设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照组；选择培养基作为实验组。 对照组：基础培养基 实验组：加入氨苄青霉素的培养基 结果分析：若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基的菌落数，则该选择培养基具有选择性。 一、选择培养基 思考讨论 选择培养基的配方设计 【资料】尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3－、NH4＋等才能被植物吸收。土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 一、选择培养基 思考讨论 选择培养基的配方设计 讨论： 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。 这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 一、选择培养基 【对点练习】请结合表两种培养基的配方，思考问题： 1.从物理性质来讲，两者属于_______培养基，判断 依据是_________________________________________； 该类培养基的主要用途为_____________________； 2.从用途上来讲，培养基二属于_______培养基， 目的是为了获得_______________________。 3.两种培养基共有的培养基成分有：_____________________________； 培养基一的碳源为__________，氮源为__________； 培养基二的碳源为__________，氮源为__________。 固体 添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%-2% 分离、鉴定、计数 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 选择 能分解尿素的微生物 知识拓展 选择培养基与鉴别培养基的比较 项目 选择培养基 鉴别培养基 原理 用途 举例 图示 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色) 目录 CONTENTS 选择培养基 1 微生物的选择培养 2 微生物的数量测定 3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 4 目录页 15 二、微生物的选择培养 土壤中的微生物数量庞大，如何获得土壤中特定微生物的纯培养物呢？仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？ 如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需要对土样进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。 分离:获得分解尿素的细菌的纯培养物 方法：稀释涂布平板法 基本操作：（1）梯度稀释； （2）涂布平板。 将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 方法步骤： 梯度稀释 菌液 涂布平板 培养与观察 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。 （1）土壤取样 [注意]取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 方法步骤： 梯度稀释 菌液 涂布平板 培养与观察 在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 （2）样品稀释 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 1×10 90mL无菌水 10g ＋ 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL [注意] 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 测放线菌：一般用103、104、105稀释液。 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 方法步骤： 梯度稀释 菌液 涂布平板 培养与观察 浸 滴 灼 涂 1×107 ①取0.1mL 菌液滴加到培养基表面 ②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 ③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 方法步骤： 梯度稀释 菌液 涂布平板 培养与观察 注意事项： ①10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略； ②由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证； ③过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行； ④将涂布器从酒精中取出时，要让多于的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 方法步骤： 梯度稀释 菌液 涂布平板 培养与观察 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d（同时放一个未接种的培养基），在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。 培养未接种的培养基：作为对照，判断有无杂菌污染。 二、微生物的选择培养 思考 与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？ 平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 平板划线法 稀释涂布平板法 接种方法 稀释涂布平板法 平板划线法 主要步骤 接种工具 菌体获取 能否用于计数 共同点 稀释涂布平板法和平板划线法的比较 拓展 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。 通过接种环在琼脂固体培养基的表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 涂布器 接种环 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落 二、微生物的选择培养 二、微生物的选择培养 【对点练习】某同学用下表所示的培养基培养纤维素分解菌。下列叙述正确的是（　　） 成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4 葡萄糖 H2O 青霉素 含量 3g 1g 0.5g 0.5g 0.01g 30g 1L 0.1万单位 注：青霉素会抑制细菌生长 A．根据物理性质，该培养基属于固体培养基 B．该培养基可用来筛选抗青霉素的微生物 C．该微生物的培养基适合新冠病毒的培养 D．该培养基用于培养纤维素分解菌，应除去葡萄糖，添加纤维素 B 目录 CONTENTS 选择培养基 1 微生物的选择培养 2 微生物的数量测定 3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 4 目录页 25 三、微生物的数量测定 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 1.间接计数——稀释涂布平板法 样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。 计数原则 ①一般选择菌落数为30～300的平板计数； ②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值； ③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 三、微生物的数量测定 1.间接计数——稀释涂布平板法 结果分析 ①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。 ②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M M代表稀释倍数。 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； 计算公式 三、微生物的数量测定 1.间接计数——稀释涂布平板法 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 三、微生物的数量测定 1.间接计数——稀释涂布平板法 【例2】某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）（ ） A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 【例1】甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 三、微生物的数量测定 2.直接计数——显微镜直接计数 原理 注意： ①细菌计数板适用于对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 ②血细胞计数板适用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的观察和计数。 ③细菌计数板或血细胞计数板的计数原理相同，区别在于计数室的高度不同，前者计数室的高度是0.02mm，后者计数室的高度是0.1mm。 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 计算公式 三、微生物的数量测定 2.直接计数——显微镜直接计数 缺点 ①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和， 不能区分死菌与活菌（数值偏大）。 ②需要相对高的细菌浓度。 ③不适于对运动细菌的计数 快速、直观，能观察微生物的形态特征。 特点 目录 CONTENTS 选择培养基 1 微生物的选择培养 2 微生物的数量测定 3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 4 目录页 32 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 实验目的 （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 培养基组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。 方法步骤： 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤，细菌适宜在该环境中生长。 ②取样过程：铲去表层土，一般3cm左右（细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层）。 注意： ①取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 ②应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 土壤取样 制备培养基 样品稀释与涂布平板 样品稀释与涂布平板 ①选择培养基：以尿素为唯一氮源 ②牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用 方法步骤： 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 制备培养基 样品稀释与涂布平板 样品稀释与涂布平板 选择培养基 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL ①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）； ②不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 测放线菌：一般用103、104、105稀释液。 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。 方法步骤： 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 制备培养基 样品稀释与涂布平板 样品稀释与涂布平板 土壤取样 思考 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30~300的平板进行计数？ 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养。 例可以将1×103至1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30~300的平板进行计算。 ①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 ②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 ③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 方法步骤： 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 制备培养基 样品稀释与涂布平板 样品稀释与涂布平板 土壤取样 【思考】在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？ 不一定。 因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 结果分析与评价 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板?在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近? 如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。 如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 3.在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落，分析其原因，如何验证。 原因：①土样不同；②培养基污染或操作失误。 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误，结果差异是因为土样不同；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 结果分析与评价 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 分解尿素细菌的进一步鉴定 活动 1.原理 细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。 2.方法 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。 （1）液体培养基可以直接看液体的变色情况； （2）固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 分解尿素细菌的进一步鉴定 活动 3.结果及结论 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 微 生 物 的 选 择 培 养 微生物的选择培养 选择培养基 微生物的数量测定 实例 筛选原理、思路、启示 选择培养基的原理、概念及类型 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法 稀释涂布平板法的操作过程及注意事项 课堂总结 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 随堂检测 1．“筛选”是分离和培养生物新类型常用的手段，下列有关技术中不能筛选成功的是（　　） A.在牛肉膏蛋白胨培养基中，筛选大肠杆菌 B.在以尿素为唯一氮源的固体培养基中，筛选能够分解尿素的微生物 C.用纤维素为唯一碳源的培养基，筛选能分解纤维素的微生物 D.在培养基中加入不同浓度的氯化钠，筛选抗盐突变体植物 A 随堂检测 2．下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中错误的是（　　） A.甲涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液 B.甲、乙操作中只有甲可以用于微生物的计数 C.乙中接种环需要灼烧5次 D.乙中连续划线的起点是上一次划线的末端 C 随堂检测 3．营养缺陷型菌株是指缺乏合成某些营养物质（如氨基酸、维生素）的能力，必须在基本培养基中补充特殊营养物质才能正常生长的一类菌株，可自然产生或人工诱导获得。用一定方法诱变大肠杆菌并将其接种到甲培养皿上，一段时间后将菌落影印接种 （不改变菌落在培养基中相应位置）到 乙、丙两培养皿中，进一步培养一段时 间可筛选出营养缺陷型菌株，结果如图 所示。下列说法正确的是（　　） A.将大肠杆菌接种到甲培养皿的方法为平板划线法 B.甲、丙两培养皿中培养基均添加了特殊营养物质 C.乙培养皿中能生长的为所需的营养缺陷型菌株 D.甲中部分大肠杆菌发生了基因突变或染色体变异 B 5.如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，图丙是接种后培养的效果图解。下列相关叙述不正确的是（　　） 随堂检测 B A.图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法 B.这两种方法所用的接种工具分别是接种针和接种环 C.图丙是采用图乙所示方法得到的结果 D.两种方法的接种操作都一定要在火焰附近进行，因为火焰附近存在着无菌区域 感谢聆听！ 高中生物学 | 人教版（2019）| 选择性必修3·生物技术与工程 49 Lavf58.46.101 Tencent CAPD MTS $$