题型05 生物技术与功能类(3大模板）-2025年高考生物答题技巧与模板构建

题型05 生物技术与功能类 模板01 利用PCR技术获取目的基因 模板02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 模板03 利用PCR技术引导基因定点突变 识·命题特点 明命题特点、窥命题预测 明·答题模板 答题要点+答题技巧+模板运用 练·高分突破 模板综合演练，快速技巧突破 本节导航 命题点 真题在线 常见设问/关键词 微生物的基本培养技术 2023·全国乙·T37 2022·天津·T3　2021·天津·T1 设问关键词：常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR 发酵工程的原理及应用 2023·山东·T20　2022·湖北·T13　2022·山东·T20 基因工程的基本工具 2023·新课标·T6　2021·全国乙·T38　2021·湖北·T7 基因工程的应用 2022·河北·T24　2022·广东·T22　2022·全国乙·T38　2021·河北·T24 动物细胞融合和单克隆抗体的制备 2023·北京·T1 2023·湖北·T22　2022·山东·T15　2022·福建·T13 2021·山东·T15　2021·江苏·T11　2020·全国Ⅰ·T38 植物细胞工程的应用 2023·山东·T14 几种不同PCR的应用 2023·江苏·T22　2023·山东·T25　2022·江苏·T24　2022·山东·T25 2021·全国甲·T38　2021·山东·T25　2020·北京·T12　2020·江苏·T33 命题预测 PCR技术是近年高考热点，常涉及对PCR基本过程、引物的选择、多种PCR的应用 关键技巧 掌握PCR过程的基本原理 模板01 利用PCR技术获取目的基因 获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。 技巧01 利用PCR技术获取目的基因 1．（2024·河南·模拟预测）数字PCR技术被称为第三代PCR,在核酸定量检测中具有突出优势。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。据此分析，下列说法正确的是（　　） A．数字PCR技术仅适用于样本中目标分子含量较高的材料 B．数字PCR技术遵循的基本原理是DNA的边解旋边复制 C．每个单元中加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 D．每个单元中目标分子的两条子链合成都是从5'端向3'端延伸 【答案】D 【思路详解】A、数字PCR技术把检测样本稀释后分配到不同的反应单元，在每个单元进行一个或多个目标分子扩增，再对每个单元的扩增结果综合分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。该技术对高、中、低水平的目标分子含量的材料均可实现正确、精密的测定，A错误； B、数字PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制，B错误； CD、每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，需要加入4种脱氧核苷酸的等量混合液、与目标分子特异性结合的两种引物和TaqDNA聚合酶等，两条子链合成是从两种引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误、D正确。 （2024·安徽芜湖·二模）不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列有关叙述错误的是（    ） A．限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合 B．不对称PCR循环6次需要消耗（26-1）a个限制性引物 C．最后获得的ssDNA中不含非限制性引物 D．子链的延伸都是从两种引物的3'端开始的 模板02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 【补充】利用PCR技术快速检测病原体 病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。 技巧02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 （2024·广西·模拟预测）现将XplA和XplB两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场的柳枝稷草中。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（    ） A．引物1+引物3 B．引物1+引物2 C．引物2+引物3 D．引物3+引物4 【答案】A 【思路详解】根据启动子的位置，若正确插入，模板链应为题甲图中下链，则引物1应与下链的3'端结合，引物3可以结合题甲图上链的3'端，若XplA和XplB基因正确插入，则使用引物1+引物3可通过PCR扩增出XplA和XplB基因融合片段，若Xp1A和XplB基因其中一个基因反接或者两个都基因反接，通过PCR均无法扩增出Xp1A和XplB基因融合片段，因此，使用引物1+引物3通过PCR可检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的Xp1A和XplB基因，A正确；BCD错误。 （2024·浙江绍兴·一模）免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述错误的是（　　） A．PCR扩增中延伸时间取决于引物的长度 B．引物浓度大小会影响PCR扩增获得产物的数量 C．图示过程中三次冲洗的目的均不同 D．图示抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合 模板03 利用PCR技术引导基因定点突变 重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。 【补充】利用PCR技术扩增未知基因序列 利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 技巧03 利用PCR技术引导基因定点突变 反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的有（    ）    A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B．设计的引物中GC碱基含量越高，退火温度越低 C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 D．在环化阶段，可选E.coliDNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶 【答案】A 【思路详解】A、DNA子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A正确； B、GC碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，退火的温度越高，B错误； C、PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，C错误； D、在环化阶段，因为图示的末端为黏性末端，因此，既可选E.coliDNA连接酶也可选T4 DNA连接酶，D错。 （2024·广西·模拟预测）基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术，图示为利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是（    ）    注：引物1和引物3的突起处代表与模板不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 A．酶①应为耐高温DNA聚合酶，引物X和Y为引物2和4 B．将四种引物置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应 C．第一阶段PCR过程中需要进行两次循环才能得到两种所需的DNA片段 D．通过该技术获得的突变基因可以表达出原来自然界不存在的蛋白质 1．发酵工程在食品、医药、农牧业等方面有着广泛地应用，下列有关说法正确的是（    ） A．发酵工程的中心环节是灭菌，防止杂菌污染 B．pH能影响发酵产物，谷氨酸的发酵生产过程中，碱性条件下易产生谷氨酰胺 C．啤酒生产中的焙烤、蒸煮环节既可以杀菌，又可以使所有酶失活 D．微生物饲料中的单细胞蛋白除蛋白质外还含有糖类、脂质、维生素等 2．“细菌喜荤，霉菌喜素”，一般来说，在培养细菌时，需添加动物性营养物质，如蛋白胨等；而在培养霉菌时，一般需要添加植物性营养成分，如豆芽汁。下列相关叙述不正确的是（    ） A．蛋白胨为细菌提供碳源、氮源和特殊营养物质 B．细菌和霉菌体内的酶存在差异，导致二者偏好的营养成分不同 C．分别培养细菌和霉菌时，需将培养基调节至相同的pH D．若需要比较细菌和霉菌形成的菌落差异，培养基中还需添加琼脂 3．如图是老陈醋的生产流程，下列相关叙述正确的是（　　） A．蒸熟的高粱米应先加入大曲再冷却 B．“糖化”是将高粱中的淀粉等大分子氧化分解为小分子，为酒精发酵提供原料 C．“醋醅”中含有的醋酸菌，是一种异养的单细胞真核生物 D．“醋酸发酵”步骤中每天翻料两次，可为醋酸菌提供更多氧气 4．下列关于细胞工程的说法正确的是（　　） A．体外培养的动物细胞形态相比体内正常细胞可能会发生改变 B．作物脱毒苗培养时先诱导愈伤组织生根，再诱导生芽 C．iPS细胞都是通过将外源基因导入体细胞获得的 D．离心法收集细胞只能用于传代培养细胞的收集 5．肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变会导致酪氨酸血症。下图是研究人员利用基因编辑技术纠正病人来源肝细胞，成功治疗酪氨酸血症小鼠的过程，为治疗人类酪氨酸血症奠定理论基础。相关叙述准确的是（　　） A．酪氨酸血症的发生说明基因能通过控制蛋白质的结构控制生物性状 B．过程②需在培养液中添加琼脂、葡萄糖、干扰素动物血清等物质 C．过程③需敲入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，并敲除相关抗原基因 D．基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠分化为完整肝脏，是治疗小鼠酪氨酸血症的关键 6．碱性磷酸酶是抗肿瘤药物多柔比星前体的专一性活化酶，将碱性磷酸酶与单克隆抗体制成“生物导弹”，使多柔比星前体在肿瘤细胞处被活化，对其DNA造成损伤，抑制以DNA为模板进行的生理活动，达到治疗肿瘤的目的。下列叙述正确的是（    ） A．给小鼠注射多柔比星前体后，可从脾脏中得到能产生肿瘤抗体的B细胞 B．制备单克隆抗体的过程中需用特定的选择培养基和抗体检测进行筛选 C．“生物导弹”利用了碱性磷酸酶的定向制导作用和单克隆抗体的特异性杀伤能力 D．多柔比星前体活化后可直接抑制肿瘤细胞的DNA复制和翻译，而抑制其无限增殖 7．下列关于动物细胞融合和单克隆抗体制备的叙述，错误的是（　　） A．灭活的病毒可与细胞质膜发生作用，从而诱导细胞融合 B．用特定抗原免疫小鼠后；可从其骨髓中分离出浆细胞，用于细胞融合 C．产生特定抗体的杂交瘤细胞可在小鼠体内培养，从腹水中提取抗体 D．单克隆抗体可高度特异性地识别抗原，从而辅助肿瘤诊断 8．黑曲霉多不耐高温，发酵获得柠檬酸的过程需大量冷却水控制温度，生产成本高。现利用原生质体融合技术获得耐高温高产黑曲霉，过程如图所示。下列叙述正确的是（    ）    A．处理①培养基中黄色圈大的菌落不一定为高产菌株 B．处理②、③用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 C．处理④升高温度即可筛选出耐高温高产黑曲霉 D．发酵结束后通过适当的过滤、沉淀等方法获得柠檬酸 9．抗体一药物偶联物，也就是ADC，又被称为“生物导弹”，由单克隆抗体、细胞毒性药物以及两者之间的连接物共3个部分组成。下列叙述正确的是（　　） A．该抗体一药物偶联物能识别肿瘤细胞上的各种膜蛋白性. B．经步骤①筛选得到的杂交瘤细胞具有的特点是能准确识别抗原的细微差异并能大量制备 C．ADC起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被分解后释放药物 D．诱导骨髓瘤细胞与脾脏中的细胞融合，可用的诱导因素只有灭活的病毒 10．如图是我国科学家培育克隆猴“中中”“华华”的过程，Kdm4d为组蛋白去甲基化酶基因、TSA为组蛋白脱乙酰酶抑制剂。下列说法错误的是（　　） A．各种动物胚胎移植的最佳时期不尽相同，一般是在原肠胚期前 B．灭活的仙台病毒可诱导体细胞和去核卵母细胞融合 C．Kdm4d的mRNA和TSA的作用是对组蛋白进行表观遗传修饰来调控相关基因表达 D．克隆猴和核供体所具有的微小差异来自基因突变或者染色体变异 11．某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段与质粒连接成功构建了基因表达载体。下列叙述正确的是（    ） A．其中一个引物序列为3'-TGCGCAGT-5' B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对质粒进行酶切，至少获得2个片段 D．构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA聚合酶 12．紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤易出现炎症，进而发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（　　）    A．图中切口的产生应是限制酶的作用 B．填补缺口时，新链合成以5'到3'的方向进行 C．在DNA复制时可以进行缺口修复 D．XP患者年龄增长，发生皮肤癌的可能性会下降 13．科学家常利用λ-Red同源重组酶系统进行基因敲除。图为科学家运用A-Red同源重组酶系统到大肠杆菌（E．coli）内进行靶基因敲除的过程，其中重组质粒pKD46在30℃时正常复制，而37℃时自动丢失。下列说法正确的是（　　） A．HA1和HA2分别添加在两种引物的5'和3'端 B．过程I和Ⅱ的培养温度分别是30℃、37℃ C．靶基因敲除过程，只发生磷酸二酯键的断裂及合成 D．若过程I是使用含青霉素的培养基成功筛选出含质粒pKD46的大肠杆菌，则说明该大肠杆菌自身含有青霉素抗性基因 14．双脱氧测序法（Sangtr法）是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸 A．5'-TAGTGCCCATC-3'为对照个体的一段序列 B．PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要DNA解旋酶和DNA连接酶 C．上述PCR反应体系中模板链需要足够多 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T 15．抗虫和耐除草剂玉米“双抗12-5”是我国自主研发的转基因品种。在转基因产品的研发、生产、销售等环节，可采用PCR技术进行基因监测，为转基因生物安全监管提供依据。下列叙述错误的是（    ） A．PCR开始阶段的预变性可使模板DNA变性更充分 B．PCR循环过程中，复性的目的是使DNA聚合酶与模板相结合 C．进行PCR基因监测时，应使用待检目的基因的特征序列作为引物 D．安全监管中，应阻止检测出转基因扩增产物的非转基因标识农产品上市 16．基因工程技术给人类生产生活和医疗带来巨大的影响，下面有关说法正确的是（    ） A．限制酶具有专一性，因此不同的限制酶不能产生相同的黏性末端 B．在自然条件下，农杆菌转化法不适用于将目的基因导入大多数的单子叶植物细胞 C．只要有证据证明转基因产品不安全，就应禁止转基因技术的研究 D．将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的调控元件重组在一起，导入哺乳动物的乳腺细胞，可获得乳腺生物反应器 17．随着转基因技术的发展，其安全性问题引发了极大的关注，下列叙述错误的是（    ） A．转基因农产品可能会引发过敏反应 B．转基因农作物中都含有会危害健康的毒性蛋白 C．转基因农作物可通过传粉将转入的基因扩散到其近缘物种中 D．对转基因安全性的争议源于对基因结构、功能及调控机制了解有限 18．CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞，包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，技术原理如图甲所示。回答下列问题： I.某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-CAS9-sgRNA质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，以研究该基因在细胞中的作用，为乳腺癌的治疗提供理论支持。 (1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙，故只需要根据 基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。 (2)构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙，需要通过 扩增，为了确保酶切后能正确连接到质粒上（相应酶切序列如图丙），需在引物1的5'端加上碱基序列 ，引物2的5'端加上碱基序列 。 (3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。感染后用 筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是 。 (4)检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是 。 Ⅱ、其他应用 (5)敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与 相同的序列。 (6)对基因或染色体定位跟踪。将Cas9基因改造成Cas9i基因（表达的Cas9i蛋白丧失切割功能），并与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i基因—GFP基因—终止子—，最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9基因的技术属于 （填“基因工程”“蛋白质工程”“酶工程”）。 (7)调控基因表达。转录因子M如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因转录。要通过sgRNA/Cas9i工具促进乳腺癌细胞中的X基因表达，表达载体构建关键部分为： 。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 学科网（北京）股份有限公司 $$ 题型05 生物技术与功能类 模板01 利用PCR技术获取目的基因 模板02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 模板03 利用PCR技术引导基因定点突变 识·命题特点 明命题特点、窥命题预测 明·答题模板 答题要点+答题技巧+模板运用 练·高分突破 模板综合演练，快速技巧突破 本节导航 命题点 真题在线 常见设问/关键词 微生物的基本培养技术 2023·全国乙·T37 2022·天津·T3　2021·天津·T1 设问关键词：常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR 发酵工程的原理及应用 2023·山东·T20　2022·湖北·T13　2022·山东·T20 基因工程的基本工具 2023·新课标·T6　2021·全国乙·T38　2021·湖北·T7 基因工程的应用 2022·河北·T24　2022·广东·T22　2022·全国乙·T38　2021·河北·T24 动物细胞融合和单克隆抗体的制备 2023·北京·T1 2023·湖北·T22　2022·山东·T15　2022·福建·T13 2021·山东·T15　2021·江苏·T11　2020·全国Ⅰ·T38 植物细胞工程的应用 2023·山东·T14 几种不同PCR的应用 2023·江苏·T22　2023·山东·T25　2022·江苏·T24　2022·山东·T25 2021·全国甲·T38　2021·山东·T25　2020·北京·T12　2020·江苏·T33 命题预测 PCR技术是近年高考热点，常涉及对PCR基本过程、引物的选择、多种PCR的应用 关键技巧 掌握PCR过程的基本原理 模板01 利用PCR技术获取目的基因 获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。 技巧01 利用PCR技术获取目的基因 1．（2024·河南·模拟预测）数字PCR技术被称为第三代PCR,在核酸定量检测中具有突出优势。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。据此分析，下列说法正确的是（　　） A．数字PCR技术仅适用于样本中目标分子含量较高的材料 B．数字PCR技术遵循的基本原理是DNA的边解旋边复制 C．每个单元中加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 D．每个单元中目标分子的两条子链合成都是从5'端向3'端延伸 【答案】D 【思路详解】A、数字PCR技术把检测样本稀释后分配到不同的反应单元，在每个单元进行一个或多个目标分子扩增，再对每个单元的扩增结果综合分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。该技术对高、中、低水平的目标分子含量的材料均可实现正确、精密的测定，A错误； B、数字PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制，B错误； CD、每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，需要加入4种脱氧核苷酸的等量混合液、与目标分子特异性结合的两种引物和TaqDNA聚合酶等，两条子链合成是从两种引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误、D正确。 （2024·安徽芜湖·二模）不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列有关叙述错误的是（    ） A．限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合 B．不对称PCR循环6次需要消耗（26-1）a个限制性引物 C．最后获得的ssDNA中不含非限制性引物 D．子链的延伸都是从两种引物的3'端开始的 【答案】C 【详解】A、据图可知，限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合，A正确； B、PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要（26-1）·a个限制性引物，B正确； C、据图可知，除模板链外，最终获得的ssDNA都是以乙链为模板合成的，因此，除模板链外，最终获得的ssDNA中都有非限制性引物，C错误； D、PCR技术的原理是DNA的半保留复制，DNA复制过程中，子链的延伸都是从引物的3'端开始的，D正确。 模板02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 【补充】利用PCR技术快速检测病原体 病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。 技巧02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 （2024·广西·模拟预测）现将XplA和XplB两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场的柳枝稷草中。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（    ） A．引物1+引物3 B．引物1+引物2 C．引物2+引物3 D．引物3+引物4 【答案】A 【思路详解】根据启动子的位置，若正确插入，模板链应为题甲图中下链，则引物1应与下链的3'端结合，引物3可以结合题甲图上链的3'端，若XplA和XplB基因正确插入，则使用引物1+引物3可通过PCR扩增出XplA和XplB基因融合片段，若Xp1A和XplB基因其中一个基因反接或者两个都基因反接，通过PCR均无法扩增出Xp1A和XplB基因融合片段，因此，使用引物1+引物3通过PCR可检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的Xp1A和XplB基因，A正确；BCD错误。 （2024·浙江绍兴·一模）免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述错误的是（　　） A．PCR扩增中延伸时间取决于引物的长度 B．引物浓度大小会影响PCR扩增获得产物的数量 C．图示过程中三次冲洗的目的均不同 D．图示抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合 【答案】A 【详解】A、PCR延伸时间取决于引物与模板结合的温度，A错误； B、复制需要引物与模板结合，每条DNA链复制都需要消耗一个引物，故引物浓度大小会影响PCR扩增获得产物的数量，B正确； C、图示过程，第一次冲洗是为了去除未结合的抗体1，第二次冲洗是为了去除未结合的抗生素和牛奶成分，第三次冲洗是为了去除未结合的抗体2，三次冲洗的目的均不同，C正确； D、据图可知，图示抗原检测过程分别与抗体1和抗体2结合了一次，共发生两次抗原与抗体的结合，D对。 模板03 利用PCR技术引导基因定点突变 重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。 【补充】利用PCR技术扩增未知基因序列 利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 技巧03 利用PCR技术引导基因定点突变 反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的有（    ）    A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B．设计的引物中GC碱基含量越高，退火温度越低 C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 D．在环化阶段，可选E.coliDNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶 【答案】A 【思路详解】A、DNA子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A正确； B、GC碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，退火的温度越高，B错误； C、PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，C错误； D、在环化阶段，因为图示的末端为黏性末端，因此，既可选E.coliDNA连接酶也可选T4 DNA连接酶，D错。 （2024·广西·模拟预测）基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术，图示为利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是（    ）    注：引物1和引物3的突起处代表与模板不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 A．酶①应为耐高温DNA聚合酶，引物X和Y为引物2和4 B．将四种引物置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应 C．第一阶段PCR过程中需要进行两次循环才能得到两种所需的DNA片段 D．通过该技术获得的突变基因可以表达出原来自然界不存在的蛋白质 【答案】B 【详解】A、酶①要在高温条件下延伸DNA，所以酶①为耐高温的DNA聚合酶，由图可知，要得到两条链一样长的DNA单链，应选择引物2和引物4，所以引物X和Y应该为引物2和4，A正确； B、引物3和引物1是完全互补的，不能放入同一个体系，B错误； C、第一阶段要获得的DNA是目的DNA的一段，且不是中间的一段，故需要两次循环可以获得，C正确； D、通过该技术可获得突变的基因，该基因的产物可能是自然界原来不存在的，D正确。 1．发酵工程在食品、医药、农牧业等方面有着广泛地应用，下列有关说法正确的是（    ） A．发酵工程的中心环节是灭菌，防止杂菌污染 B．pH能影响发酵产物，谷氨酸的发酵生产过程中，碱性条件下易产生谷氨酰胺 C．啤酒生产中的焙烤、蒸煮环节既可以杀菌，又可以使所有酶失活 D．微生物饲料中的单细胞蛋白除蛋白质外还含有糖类、脂质、维生素等 【答案】D 【详解】A、发酵工程的中心环节主发酵，获取发酵产物，A错误； B、pH能影响发酵产物，利用液体深层培养进行谷氨酸发酵生产应在中性或弱碱性条件下进行，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺，B错误； C、焙烤是为了去除大麦种子中的水分，可以杀死大麦种子胚，但没有起到灭菌作用，也不能使淀粉酶失活，C错误； D、以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发醛能获得单细胞蛋白，单细胞蛋白含有丰富的蛋白质、糖类、脂质和维生素等物质，可以用作食品添加剂，D正确。 2．“细菌喜荤，霉菌喜素”，一般来说，在培养细菌时，需添加动物性营养物质，如蛋白胨等；而在培养霉菌时，一般需要添加植物性营养成分，如豆芽汁。下列相关叙述不正确的是（    ） A．蛋白胨为细菌提供碳源、氮源和特殊营养物质 B．细菌和霉菌体内的酶存在差异，导致二者偏好的营养成分不同 C．分别培养细菌和霉菌时，需将培养基调节至相同的pH D．若需要比较细菌和霉菌形成的菌落差异，培养基中还需添加琼脂 【答案】C 【详解】A、蛋白胨富含营养物质，为细菌提供碳源、氮源和特殊营养物质，A正确； B、酶具有专一性，细菌和霉菌体内的酶存在差异，导致二者偏好的营养成分不同，B正确； C、培养细菌时需将培养基的pH调至中性或弱碱性，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，C错误； D、在固体培养基上能形成菌落，若需要比较细菌和霉菌形成的菌落差异，培养基中还需添加琼脂，D正确。 3．如图是老陈醋的生产流程，下列相关叙述正确的是（　　） A．蒸熟的高粱米应先加入大曲再冷却 B．“糖化”是将高粱中的淀粉等大分子氧化分解为小分子，为酒精发酵提供原料 C．“醋醅”中含有的醋酸菌，是一种异养的单细胞真核生物 D．“醋酸发酵”步骤中每天翻料两次，可为醋酸菌提供更多氧气 【答案】D 【详解】A、高粱蒸熟后温度较高，不冷却直接投入发酵菌种会造成菌种大量死亡，影响发酵效率，应先冷却再加入大曲，A错误； B、糖化是将淀粉等大分子物质通过水解酶的作用转化为可发酵的小分子糖（如葡萄糖），而不是氧化分解，B错误； C、醋酸菌是细菌，是一种异养的单细胞原核生物，C错误； D、醋酸发酵需要氧气，所以每天翻料两次，可为醋酸菌提供更多氧气，D正确。 4．下列关于细胞工程的说法正确的是（　　） A．体外培养的动物细胞形态相比体内正常细胞可能会发生改变 B．作物脱毒苗培养时先诱导愈伤组织生根，再诱导生芽 C．iPS细胞都是通过将外源基因导入体细胞获得的 D．离心法收集细胞只能用于传代培养细胞的收集 【答案】A 【详解】A、体外培养的动物细胞由于缺少体内环境稳定的生理和生化条件，可能形态、功能发生改变，如变扁平或失去特异性等，比体内正常细胞可能会发生改变，A正确； B、作物脱毒苗培养过程中，通常是先诱导愈伤组织形成芽，然后再诱导生根。这是因为在植物组织培养过程中，愈伤组织的再分化通常是先进行芽的诱导，再进行生根的诱导，两者的顺序不能颠倒。因此，题干中的说法是错误的，B错误； C、iPS细胞（诱导多能干细胞）并不一定都需要通过外源基因导入体细胞获得。除了通过引入特定外源基因来诱导体细胞去分化外，还有一些非基因导入的方法，如使用小分子化合物或通过蛋白质转染等手段，同样可以将体细胞诱导为多能干细胞，C错误； D、在传代培养时可用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离，悬浮培养的细胞也可直接用离心法收集，离心法收集细胞不是只能用于传代培养细胞的收集，也可用于收集药物处理过的细胞等，D错误； 5．肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变会导致酪氨酸血症。下图是研究人员利用基因编辑技术纠正病人来源肝细胞，成功治疗酪氨酸血症小鼠的过程，为治疗人类酪氨酸血症奠定理论基础。相关叙述准确的是（　　） A．酪氨酸血症的发生说明基因能通过控制蛋白质的结构控制生物性状 B．过程②需在培养液中添加琼脂、葡萄糖、干扰素动物血清等物质 C．过程③需敲入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，并敲除相关抗原基因 D．基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠分化为完整肝脏，是治疗小鼠酪氨酸血症的关键 【答案】C 【详解】A、酪氨酸血症是由于肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变，导致酶不能正常合成，进而影响代谢过程，这说明基因能通过控制酶的合成来控制代谢，进而控制生物性状，而不是控制蛋白质的结构，A错误； B、动物细胞培养过程中，培养液中需要添加葡萄糖、动物血清等物质，但不需要添加琼脂，琼脂是用于植物组织培养的凝固剂，B错误； C、过程③基因编辑是为了纠正病人来源肝细胞，所以需要敲入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，同时敲除相关抗原基因，以避免免疫排斥反应，C正确； D、基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠后，是通过肝细胞发挥正常功能来治疗小鼠酪氨酸血症，而不是分化为完整肝脏，D错误。 6．碱性磷酸酶是抗肿瘤药物多柔比星前体的专一性活化酶，将碱性磷酸酶与单克隆抗体制成“生物导弹”，使多柔比星前体在肿瘤细胞处被活化，对其DNA造成损伤，抑制以DNA为模板进行的生理活动，达到治疗肿瘤的目的。下列叙述正确的是（    ） A．给小鼠注射多柔比星前体后，可从脾脏中得到能产生肿瘤抗体的B细胞 B．制备单克隆抗体的过程中需用特定的选择培养基和抗体检测进行筛选 C．“生物导弹”利用了碱性磷酸酶的定向制导作用和单克隆抗体的特异性杀伤能力 D．多柔比星前体活化后可直接抑制肿瘤细胞的DNA复制和翻译，而抑制其无限增殖 【答案】B 【详解】A、给小鼠注射多柔比星前体后，可从脾脏中得到能产生抗多柔比星前体抗体的B细胞，A错误； B、制备单克隆抗体过程中需用特定的选择培养基（获取B-瘤杂交瘤细胞）和抗体检测进行筛选，B对；                 C、“生物导弹”利用了碱性磷酸酶的特异性杀伤能力和单克隆抗体的定向制导作用，C错误； D、依据题干信息，多柔比星前体在肿瘤细胞处被活化，对其DNA造成损伤，抑制以DNA为模板进行的生理活动，达到治疗肿瘤的目的，所以多柔比星前体活化后可直接抑制肿瘤细胞的DNA复制和转录，间接抑制翻译过程，进而抑制其无限增殖，D错误。 7．下列关于动物细胞融合和单克隆抗体制备的叙述，错误的是（　　） A．灭活的病毒可与细胞质膜发生作用，从而诱导细胞融合 B．用特定抗原免疫小鼠后；可从其骨髓中分离出浆细胞，用于细胞融合 C．产生特定抗体的杂交瘤细胞可在小鼠体内培养，从腹水中提取抗体 D．单克隆抗体可高度特异性地识别抗原，从而辅助肿瘤诊断 【答案】B 【详解】A、某些灭活病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，A正确； B、用特定抗原免疫小鼠后；可从其脾脏中分离出B细胞，用于细胞融合，B错误； C、产生特定抗体的杂交瘤细胞可在小鼠体内培养，在小鼠的腹水中获取单克隆抗体，C正确； D、根据抗原抗体特异性结合的原理，单克隆抗体可高度特异性地识别抗原，从而辅助肿瘤诊断，D正确。 8．黑曲霉多不耐高温，发酵获得柠檬酸的过程需大量冷却水控制温度，生产成本高。现利用原生质体融合技术获得耐高温高产黑曲霉，过程如图所示。下列叙述正确的是（    ）    A．处理①培养基中黄色圈大的菌落不一定为高产菌株 B．处理②、③用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 C．处理④升高温度即可筛选出耐高温高产黑曲霉 D．发酵结束后通过适当的过滤、沉淀等方法获得柠檬酸 【答案】A 【详解】A、诱变的原理是基因突变，而基因突变具有不定向性，故处理①培养基中黄色圈大的菌落不一定为高产菌株，A正确； B、黑曲霉的细胞壁成分不是纤维素和果胶，故处理②、③不可以用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，B错； C、处理④升高温度后海需要进一步验证才能筛选出耐高温高产黑曲霉，C错误； D、发酵工程生产的产品有两类：一类是代谢产物，另一类是菌体本身。如果产品是菌体，可采用过滤，沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；如果产品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取，可见题图发酵结束后不能通过适当的过滤、沉淀等方法获得柠檬酸，D错误。 9．抗体一药物偶联物，也就是ADC，又被称为“生物导弹”，由单克隆抗体、细胞毒性药物以及两者之间的连接物共3个部分组成。下列叙述正确的是（　　） A．该抗体一药物偶联物能识别肿瘤细胞上的各种膜蛋白性. B．经步骤①筛选得到的杂交瘤细胞具有的特点是能准确识别抗原的细微差异并能大量制备 C．ADC起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被分解后释放药物 D．诱导骨髓瘤细胞与脾脏中的细胞融合，可用的诱导因素只有灭活的病毒 【答案】C 【详解】A、抗体具有特异性，即只能识别并结合特定的抗原。因此，该抗体-药物偶联物（ADC）只能识别肿瘤细胞上特定的膜蛋白抗原，而不是各种膜蛋白，A错误； B、经步骤①筛选得到的杂交瘤细胞不一定能准确识别抗原的细微差异，B错误； C、抗体一药物偶联物(ADC)通常由负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子三个部分组成，ADC起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被分解后释放药物，C正确； D、在诱导骨髓瘤细胞与脾脏中的细胞融合时，可用的诱导因素有PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法，D错误。 10．如图是我国科学家培育克隆猴“中中”“华华”的过程，Kdm4d为组蛋白去甲基化酶基因、TSA为组蛋白脱乙酰酶抑制剂。下列说法错误的是（　　） A．各种动物胚胎移植的最佳时期不尽相同，一般是在原肠胚期前 B．灭活的仙台病毒可诱导体细胞和去核卵母细胞融合 C．Kdm4d的mRNA和TSA的作用是对组蛋白进行表观遗传修饰来调控相关基因表达 D．克隆猴和核供体所具有的微小差异来自基因突变或者染色体变异 【答案】D 【详解】A、不同的动物胚胎移植的时间不同，例如，牛、羊一般要培养到16细胞阶段 （桑葚 胚） 或囊胚阶段才能进行移植，小鼠和家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体 外受精胚胎即试管胚胎，可在4细胞阶段移植；可见各种动物胚胎移植的最佳时期不尽相同，一般是在原肠胚期前，A正确； B、灭活的仙台病毒可以诱导动物细胞融合，因此，将胎猴的体细胞注入去核的卵母细胞前，可以用灭活的仙台病毒处理的目的是诱导细胞融合，B正确； C、组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA可以表达组蛋白去甲基化酶，该酶能降低组蛋白的甲基化水平，组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA可以抑制组蛋白脱乙酰酶的作用，提高组蛋白的乙酰化水平，两种物质都可以通过改变组蛋白的表观遗传修饰来调控基因表达，C正确； D、克隆猴与核供体所具有的微小差异最可能来自卵母细胞的细胞质差异或是表观遗传，D错误。 11．某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段与质粒连接成功构建了基因表达载体。下列叙述正确的是（    ） A．其中一个引物序列为3'-TGCGCAGT-5' B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对质粒进行酶切，至少获得2个片段 D．构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA聚合酶 【答案】C 【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇，A错误； B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误； C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据其识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确； D、构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA连接酶，D错误。 12．紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤易出现炎症，进而发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（　　）    A．图中切口的产生应是限制酶的作用 B．填补缺口时，新链合成以5'到3'的方向进行 C．在DNA复制时可以进行缺口修复 D．XP患者年龄增长，发生皮肤癌的可能性会下降 【答案】D 【详解】A、由题图信息可知，紫外线引发的DNA损伤，使用限制酶将损伤的DNA序列切除，再通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，所以图中切口的产生应是限制酶的作用，A正确； B、DNA复制时新链合成是以5'到3'的方向进行，图中填补缺口属于DNA合成过程，所以新链合成以5'到3'的方向进行，B正确； C、DNA复制过程中可能会出现损伤，此时可以利用类似图中的机制进行缺口修复，C正确； D、XP患者的NER酶系统存在缺陷，随着年龄增长，受阳光照射积累的损伤增多，发生皮肤癌的可能性会增加，而不是下降，D错误。 13．科学家常利用λ-Red同源重组酶系统进行基因敲除。图为科学家运用A-Red同源重组酶系统到大肠杆菌（E．coli）内进行靶基因敲除的过程，其中重组质粒pKD46在30℃时正常复制，而37℃时自动丢失。下列说法正确的是（　　） A．HA1和HA2分别添加在两种引物的5'和3'端 B．过程I和Ⅱ的培养温度分别是30℃、37℃ C．靶基因敲除过程，只发生磷酸二酯键的断裂及合成 D．若过程I是使用含青霉素的培养基成功筛选出含质粒pKD46的大肠杆菌，则说明该大肠杆菌自身含有青霉素抗性基因 【答案】B 【详解】A、HA1和HA2分别添加在两种引物的5'端，A错误； B、过程Ⅰ是pKD46导入受体菌，并在受体菌内进行复制，因此所需温度为30℃，过程Ⅱ需除去重组质粒pKD46，所需温度为37℃，B正确； C、为通过同源重组将大肠杆菌基因组DNA上的特定靶基因敲除，除发生磷酸二酯键的断裂及合成，也发生氢键的断裂和形成，C错误； D、若过程I是使用含青霉素的培养基成功筛选出含质粒pKD46的大肠杆菌，导入的pKD46中含有青霉素抗性基因，并在大肠杆菌细胞中正常表达，因而能用含有青霉素的培养基将成功导入该质粒的大肠杆菌筛选出来，说明该大肠杆菌自身不含有青霉素抗性基因，D错误。 14．双脱氧测序法（Sangtr法）是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸 A．5'-TAGTGCCCATC-3'为对照个体的一段序列 B．PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要DNA解旋酶和DNA连接酶 C．上述PCR反应体系中模板链需要足够多 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T 【答案】A 【详解】A、依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，A错误； B、PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要解旋酶，高温变性解旋，不需要DNA连接酶，两条链都是连续合成，B正确； C、在进行序列时，模板量的数量需要足够多，以确保测序的准确性和可测性。如果模板DNA量不足，可能会导致测序结果不准确或无法进行，C正确； D、患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D正确。 15．抗虫和耐除草剂玉米“双抗12-5”是我国自主研发的转基因品种。在转基因产品的研发、生产、销售等环节，可采用PCR技术进行基因监测，为转基因生物安全监管提供依据。下列叙述错误的是（    ） A．PCR开始阶段的预变性可使模板DNA变性更充分 B．PCR循环过程中，复性的目的是使DNA聚合酶与模板相结合 C．进行PCR基因监测时，应使用待检目的基因的特征序列作为引物 D．安全监管中，应阻止检测出转基因扩增产物的非转基因标识农产品上市 【答案】B 【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，在变性过程中氢键断裂，双链DNA解旋为单链，A正确； B、PCR循环过程中，复性的目的是使引物与模板相结合，B错误； C、进行PCR基因监测时，应使用待检目的基因的特征序列作为引物，保证能获得目的基因，C正确； D、转基因产品需要进行安全评估才能上市，所以安全监管中，应阻止检测出转基因扩增产物的非转基因标识农产品上市，D正确。 16．基因工程技术给人类生产生活和医疗带来巨大的影响，下面有关说法正确的是（    ） A．限制酶具有专一性，因此不同的限制酶不能产生相同的黏性末端 B．在自然条件下，农杆菌转化法不适用于将目的基因导入大多数的单子叶植物细胞 C．只要有证据证明转基因产品不安全，就应禁止转基因技术的研究 D．将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的调控元件重组在一起，导入哺乳动物的乳腺细胞，可获得乳腺生物反应器 【答案】B 【详解】A、同尾酶能产生相同的黏性末端，即有的限制酶虽然识别的碱基序列不同，但切割后可产生相同的黏性末端，A 错误； B、在自然条件下，农杆菌不能感染大多数的单子叶植物，故农杆菌转化法不适用于将目的基因导入大多数的单子叶植物细胞，B 正确； C、转基因技术是中性的，不应禁止，C 错误； D、将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的调控元件重组在一起，导入哺乳动物的受精卵可获得乳腺生物反应器，D 错误。 17．随着转基因技术的发展，其安全性问题引发了极大的关注，下列叙述错误的是（    ） A．转基因农产品可能会引发过敏反应 B．转基因农作物中都含有会危害健康的毒性蛋白 C．转基因农作物可通过传粉将转入的基因扩散到其近缘物种中 D．对转基因安全性的争议源于对基因结构、功能及调控机制了解有限 【答案】B 【详解】A、转基因农产品可能会引发过敏反应，这是转基因安全性需要考虑的一个方面，A正确； B、并不是所有转基因农作物中都含有会危害健康的毒性蛋白，这种说法过于绝对，B错误； C、转基因农作物可通过传粉将转入的基因扩散到其近缘物种中，这是转基因技术可能带来的生态风险，C正确； D、对转基因安全性的争议源于对基因结构、功能及调控机制了解有限，这是正确的，因为了解有限所以存在争议，D正确。 18．CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞，包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，技术原理如图甲所示。回答下列问题： I.某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-CAS9-sgRNA质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，以研究该基因在细胞中的作用，为乳腺癌的治疗提供理论支持。 (1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙，故只需要根据 基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。 (2)构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙，需要通过 扩增，为了确保酶切后能正确连接到质粒上（相应酶切序列如图丙），需在引物1的5'端加上碱基序列 ，引物2的5'端加上碱基序列 。 (3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。感染后用 筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是 。 (4)检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是 。 Ⅱ、其他应用 (5)敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与 相同的序列。 (6)对基因或染色体定位跟踪。将Cas9基因改造成Cas9i基因（表达的Cas9i蛋白丧失切割功能），并与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i基因—GFP基因—终止子—，最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9基因的技术属于 （填“基因工程”“蛋白质工程”“酶工程”）。 (7)调控基因表达。转录因子M如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因转录。要通过sgRNA/Cas9i工具促进乳腺癌细胞中的X基因表达，表达载体构建关键部分为： 。 【答案】(1)人源粘着斑蛋白（VCL） (2) PCR 5'AGATCT3' 5'GCTAGC3' (3) 卡拉霉素和潮霉素 在检测敲除效果时作对照 (4)抗原抗体特异结合 (5)Cas9切点两侧碱基序列 (6)蛋白工程 (7)—启动子—Cas9i基因—M基因—终止子— 【详解】（1）具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-CAS9-sgRNA质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙，故只需要根据人源粘着斑蛋白（VCL）基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。 （2）构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙，需要通过PCR 扩增，为了确保酶切后能正确连接到质粒上（相应酶切序列如图丙），选用BglⅡ和NheⅠ酶，需在引物1的5端加上碱基序列5'AGATCT3'，引物2的5'端加上碱基序列5'GCTAGC3'。 （3）导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。根据标记基因，感染后用卡拉霉素和潮霉素筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是在检测敲除效果时作对照。 （4）检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是抗原抗体特异结合。 （5）敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与Cas9切点两侧碱基序列相同的序列。 （6）对基因或染色体定位跟踪。将Cas9基因改造成Cas9i基因（表达的Cas9i蛋白丧失切割功能），并与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i基因—GFP基因—终止子—，最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9基因的技术属于蛋白质工程。 （7）调控基因表达。转录因子M如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因转录。要通过sgRNA/Cas9i工具促进乳腺癌细胞中的X基因表达，表达载体构建关键部分为—启动子—Cas9i基因—M基因—终止子—。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！6 学科网（北京）股份有限公司 $$