1.2 微生物的培养技术及应用（第2课时）-【备课一点通】2024-2025学年高二生物下学期同步特色课件（人教版2019选择性必修3）

第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用 02 微生物的选择培养和计数 一、选择培养基 【 任务一】分离特定种类的微生物 【资料1】 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶已被广泛用于体外扩增DNA片段。 筛选水生栖热菌的思路是什么？ 美国黄石公园 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 为什么这个条件能让水生栖热菌“脱颖而出”？ 水生栖热菌能适应高温环境，而绝大多数微生物在高温下不能生存。 【 任务一】分离特定种类的微生物 你还知道哪些条件能影响微生物的生存？ 特殊营养物质、pH、O2等。 一、选择培养基 这对在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示？ 人为提供有利于目的菌生长的条件（营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。例如，必修二开展的“探究抗生素对细菌的选择作用”活动中，在添加抗生素的培养基中只有耐药菌可以存活。 那什么是选择培养基呢？ 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 不加碳源的培养基 分离出自养微生物 分离耐热菌 70～80℃的高温 不加氮源的培养基 分离固氮微生物 加青霉素的培养基 分离真菌 加高浓度食盐 分离金黄色葡萄球菌 改变培养条件 添加某种化学物质 营养缺陷 加石油为唯一碳源 分离出分解石油的分解菌 特殊碳、氮源 (青霉素能杀死细菌、放线菌) 补充资料——几种选择培养基举例 一、选择培养基 酸性环境培养、筛选出耐酸菌 无氧下 培养基中加氨苄青霉素 没有氨苄青霉素抗性的细菌能够生长 具有抗氨苄青霉素能力的细菌 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 培养基+氨苄青霉素 培养基 一、选择培养基 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 问题：如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 一、选择培养基 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 讨论： 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养 基的配方该如何设计？ 设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源。 尿素 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 CO(NH2)2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 一、选择培养基 思考·讨论：选择培养基配方的设计 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 二、微生物的选择培养 选择培养基 + 稀释涂布平板 单菌落 将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。 二、微生物的选择培养 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 稀释涂布平板法 ①概念： 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g 将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 系列稀释 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 ②操作： 涂布平板 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表 面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 稀释涂布平板法 ②操作： 二、微生物的选择培养 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 培养 稀释涂布平板法 ②操作： 二、微生物的选择培养 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置（同时放一个未接种的培养基），放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 思考：设置空白对照组的目的是什么？ 检测培养基灭菌是否彻底，保证实验结果的准确性。 根据实验结果，能否计算出细菌数目的是多少？原理是什么？ 可以 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测除样品中大约含有多少活菌。 一般选择菌落数在 的平板进行计数。 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取其平均值。 统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。 因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。 因此，统计结果一般用 而不用活菌数来表示。 减少实验误差，保证实验结果更准确 30~300 低 菌落数 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 稀释涂布平板法 三、微生物的数量测定 ③ 原 理： ④ 计数原则： ⑤缺 点： M：代表稀释倍数； C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个 ⑥ 计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M 1.1×108 三、微生物的数量测定 稀释涂布平板法 间接计数法 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、 212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。 三、微生物的数量测定 快速、直观 直接计数法 原理： 利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数。 优点： 缺点： 不能区分死菌与活菌 对细菌等较小的细胞进行观察和计数 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数 思考:为了避免上述缺点，我们该如何做？ 可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）后再进行显微镜计数。 三、微生物的数量测定 显微镜直接计数 →偏大（活菌数和死菌数的总和） 计数区 放大后的计数室 计数方法： 每毫升原液所含细菌数＝ 每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 直接计数法 三、微生物的数量测定 显微镜直接计数 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 计数依据 优点 计算公式 缺点 结果 两种计数方法的比较 细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 细菌个数 培养基上菌落数 计数方便、操作简单 计数的是活菌 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 比实际值偏大 比实际值偏小 三、微生物的数量测定 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 三、微生物的数量测定 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 CO(NH2)2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 实验目的 实验原理 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。 无菌操作：铁铲和信封都要灭菌， 操作完成后，一定要洗手。 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 实验流程 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 选择培养基的配方 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 提供无机盐 凝固剂 提供氮源 提供碳源 思考：制备培养基时除了制备选择培养基还要制备什么培养基？为什么？ 牛肉膏蛋白胨培养基、对照作用 实验流程 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 1×10 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 102 103 104 105 106 107 10g 9 mL 无菌水 90mL无菌水 实验流程 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 测放线菌：一般用103、104、105稀释液。 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 B A C 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养。例如：将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 实验流程 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 实验流程 选择培养基 （平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照) （用以判断选择培养基是否具有选择作用） 整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的 。培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 2 选择培养基和牛肉膏蛋白胨 迪 (迪) - 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。 。 结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿（皿底）时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 实验流程 菌落数目稳定 防止因培养时间不足而导致菌落数目遗漏 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。 稀释度 104 105 106 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 每个平板的菌落数 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 实验流程 ①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 如果没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。 如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 如果用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大， 就需从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。 ②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板?在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近? ③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少?与其他同学统计的结果接近吗?如果差异很大，可能是什么原因引起的? 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 结果分析与评价 得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 得到的菌落不一定就是分解尿素的细菌，如自生固氮菌或利用（分解尿素的）细菌的代谢物进行生长繁殖的微生物，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需要进一步的验证。 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 进一步探究 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。 培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红 酚红培养基——鉴定分解尿素的细菌 脲酶 CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 进一步探究 鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 2. 已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。 【练习与应用】 拓展应用 35 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请 你给出详细的实验方案。 土壤取样 →富含纤维素的环境 →以纤维素为唯一碳源，增加目的菌浓度 （选择培养基） →制备系列稀释液 →筛选产生透明圈的菌落 →将样品涂布到含刚果红的培养基上 （鉴别培养基） 梯度稀释 选择培养 涂布平板 挑选 【练习与应用】 36 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 【练习与应用】 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 结果分析 【课堂小结】 【练习与应用】 Lavf58.51.100 Lavf58.20.100 $$