第3章基因工程导学案-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程 【学习目标】 1.重组DNA技术所需的三种基本工具的作用和DNA的粗提取和鉴定 2.基因工程基本操作程序的四个步骤和DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面的应用 4.蛋白质工程的基本原理 5.依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 重难点：1.重组DNA技术所需的三种基本工具的作用和DNA的粗提取和鉴定 2.基因工程基本操作程序的四个步骤 3.利用PCR获取和扩展目的基因、DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面的应用 5.蛋白质工程的基本原理 6.依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 【学习内容】 基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。 一、重组DNA技术的基本工具 （一）限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1.简称：限制酶 2.来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的 3.作用： ①能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。 ②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 4.作用部位：磷酸二酯键 5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端。 （二）DNA连接酶——“分子缝合针” 1.功能：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 2.分类和对比 种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端 作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 3．比较与DNA有关的六种酶 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端 （三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。 2.种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 3.作为载体需具备的条件 ①有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中； ②能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制； ③常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选； ④对受体细胞无害。 例1：在基因工程的操作中，需要三种工具，分别是“分子手术刀”、“分子缝合针”和“分子运输车”，关于这三种工具的叙述，正确的是（　C　） A. “分子手术刀”指的是限制性内切核酸酶，可以断开DNA和RNA的磷酸二酯键 B. “分子缝合针”指的是DNA聚合酶，可以催化生成断裂的磷酸二酯键 C. “分子运输车”指的是载体，常用的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体 D. 载体的化学本质一定是核酸 例2：下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（  B  ） A．限制酶SmaI和EcoRV切割形成的末端，可通过E．coliDNA连接酶相互连接 B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成 D．SmaI切割后产生的是黏性末端 例3：限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（  A  ） A．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 B．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 C．E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而米，所以也能剪切自身的DNA 例4：基因工程技术也称DNA重组技术，实施必需具备四个必要的条件是（ A ） A. 工具酶、目的基因、运载体、受体细胞 B. 重组DNA、RNA聚合酶、限制酶、连接酶 C. 模板DNA、信使RNA、质粒、受体细胞 D. 目的基因、限制酶、运载体、体细胞 探究.实践：DNA的粗提取与鉴定 1.提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，选用适当的物理或化学方法对他们进行提取。 2.提取原理： ①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，可以初步分离DNA与蛋白质； ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 溶解规律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液 DNA 溶解 析出 3.鉴定原理：在一定温度下(沸水浴)，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 4.步骤： 研磨——过滤——DNA的析出——DNA的鉴定 （1） 研磨的作用？ 裂解细胞，释放DNA。 （2） 过滤能否用滤纸代替纱布？ 不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 （3） 95%酒精的作用？ 溶解杂质和析出DNA。 （4） 酒精预冷的作用？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 （5） 搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 例5：（2024安徽）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ D ） A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C. DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 例6：（2024山东）关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ A ） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在 4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中 DNA 双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 二、基因工程的基本操作程序 (一)目的基因的筛选与获取 1.目的基因概念 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因(根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因)。 2.筛选目的基因的方法 (1)从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 (2)获取方法 3.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR的概：PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 ①全称：聚合酶链式反应 ②原理：DNA半保留复制 ③操作环境：体外(PCR扩增仪/PCR仪) ④目的：对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 ⑤优点：可以在短时间内大量扩增目的基因 (3)DNA体外复制(PCR)的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 90℃以上高温 打开DNA双链(变性温度) 耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链 缓冲液(含Mg2+) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 其他不同的温度 变性、复性和延伸 需要不同温度 注：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。复制的原料实为dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，同时水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。 (4)过程 变性 温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右，以单链DNA为模板在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’ 拓展：DNA复制的相关计算 1.子代DNA分子总数： 2n个； 2.第n代产生的DNA数：2n-1个； 3.子代DNA脱氧核苷酸链总数= 2n+1 条 4.第n代产生的DNA链数：2n条 ①n代后，DNA分子有2n个 ②n代后，DNA链有2n+1条 ③第3代出现完整的目的基因 ④n代后，含引物的DNA分子有2n个 ⑤n代后，共消耗2n+1-2个引物 ⑥第n代复制，消耗了2n个引物 ⑦n代后，完整的目的基因有2n-2n个 4.获取目的基因的其他方法 (1)构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 ①基因组文库：包含一种生物所有的基因。 ②部分基因文库：只包含一种生物一部分基因，如cDNA文库。 (2)利用化学方法人工合成：用DNA合成仪，要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知，不需要模板。 例7：将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。下图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为（　A　）    A．5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3' B．5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3' C．5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3' D．5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3' 例8：技术是基因工程中获取目的基因的重要手段，其原理与体内复制类似。图1、图2、图3是与有关的三幅图解，下列相关叙述正确的是（ C  ）   A．图2中第1组引物适合进行，第2组引物不适合进行 B．图3可反映体系中热稳定性聚合酶的功能 C．通过3次图1过程的循环需消耗14个引物 D．体内复制和中的引物都是核糖核苷酸链 例9：“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如下图1所示。下列叙述错误的是（  C  ）    A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个 B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个 C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因 D.经五轮循环后产物中有五种不同长度的DNA分子 例10：RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。下图是RT-PCR过程示意图，①和②为逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述不正确的是（　D　）      A．该技术可用来检测新冠病毒等RNA病毒 B．该技术可用来检测组织细胞中基因是否转录 C．①过程需要的酶是逆转录酶，③过程需要的酶是耐高温的DNA聚合酶 D．③过程中DNA解链后，应升高反应体系温度使引物与模板结合 例11：蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1~4表示DNA上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述不正确的是( C ) A.若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，会破坏4个磷酸二酯键 B.若用PCR技术获取目的基因，则图中的2、3分别是2种引物结合的位置 C.若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白的加工需要细胞中内质网和高尔基体的参与 D.在PCR仪中根据选定的引物至少需经过6次循环才可获得32个符合要求的目的基因 (二)基因表达载体的构建(核心) 1.基因表达载体的组成 基因表达载体必须包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等(若需要能完成自主复制，还应有复制原点)。 (1)启动子 ①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。 ②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。 ③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 ④特殊类型：诱导型启动子。 ⑤诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 (2)终止子 ①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。 ②位置：位于基因的下游。 ③功能：使转录在所需要的地方停下来。 注：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 比较项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA上三个相邻的碱基 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) (3)标记基因 ①作用：便于重组DNA分子的筛选 ②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等 (4)基因表达载体的构建过程同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割 含有目的基因的DNA片段 载体(质粒) 带有相同黏性末端(或平末端)的目的基因片段 带有黏性末端(或平末端)的切口 DNA连接酶 重组DNA分子(重组质粒) 思考：若使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？ ①自连：目的基因自连、质粒自连 ②片段间的连接：目的基因与质粒连接、质粒与质粒连接、目的基因与目的基因连接 例12：科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计，不合理的是（　D　） A．用β-珠蛋白基因、启动子、终止子、抗四环素基因等元件来构建基因表达载体 B．利用正常小鼠DNA分子通过PCR克隆出β-珠蛋白基因的编码序列 C．用含有四环素的培养基筛选出已经导入β-珠蛋白编码序列的大肠杆菌 D．将β-珠蛋白基因表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中 例13：第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是（  C  ） A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒 B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团 C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶 例14：食物中的生物胺会引起胃肠道不适和过敏等不良反应，微生物来源的多铜氧化酶(MCO)能高效分解生物胺。科研人员采用PCR技术获得发酵乳酸杆菌的MCO基因，然后转入大肠杆菌中实现了高效表达。若目的基因MCO经限制酶切开后的末端如图甲，要MCO片段能与载体质粒pCLY15(图乙)高效连接，需用于切割的酶组合为（  C  ）    A．BspHI和 Not I B．BsrGI和Xma I C．Kpn I和 Xma I D．KpnI和SmaI (三)将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞常用方法比较： 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+处理法 （增加细胞壁的通透性） 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 导入过程 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 构建基因表达载体并提纯→利用显微注射将表达载体注入动物的受精卵→早期胚胎培养→胚胎移植→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中 农杆菌特点： ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的_T-DNA( 可转移的DNA )转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (3)农杆菌转化法的过程：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。 注： 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。） 例15：将棉花的酶D基因与拟南芥的转运肽基因相连，导入双子叶植物油菜的叶片细胞，可培育出高产转基因油菜品种。下图是需要用到的Ti质粒。下列叙述错误的是( B ) A.可以用不同的限制酶对目的基因和T-DNA进行切割 B.四环素抗性基因可检测目的基因是否表达成功 C.将重组Ti质粒导入农杆菌后，再用其侵染油菜叶片细胞 D.两个基因的表达产物不能影响油菜叶片细胞的存活 例16：如图所示为培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是（ D ） A. 过程A 需要的启动子，位于基因的下游，有了它才能驱动基因转录出 mRNA B. 过程B需要用Ca2+处理，以提高番茄细胞壁的通透性 C. 抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达 D. 转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定 例17：研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方向）插入图中载体P区，构建表达载体，转入大肠杆菌，获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述不正确的是（  A  ） A．PCR扩增启动子S时，图中引物I、Ⅱ分别加入BamHI、XhoI识别序列 B．用Ca2+处理大肠杆菌以便于转入构建好的表达载体 C．使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入载体的菌株 D．可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含毒物 (四)目的基因的检测与鉴定 检测目的 检测方法 判断标准 目的基因是否插入转基因生物的DNA PCR技术 是否扩增出目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR技术 是否扩增出目的基因 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交技术 是否出现杂交带 个体水平的检测 如抗虫、抗病的接种实验 是否表现出相应的特性 注： 检测目的基因是否插入受体细胞或否转录出了mRNA，还可用分子杂交技术。 基因探针：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。 例18：噬菌体展示技术是将编码某蛋白质的基因导入噬菌体的DNA中，使该外源基因随噬菌体外壳蛋白表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。以下对该技术分析正确的是（　D　） A．噬菌体展示技术的遗传学原理是基因突变 B．构建目的基因表达载体时需使用限制酶和DNA酶 C．需用营养成分齐全的培养基扩大培养噬菌体 D．可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白 例19：科学家将拟南芥的抗寒基因（CBFl），转入香蕉以获得抗寒的香蕉品种。如图是某质粒载体上的SacⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ四种限制酶的切割位点示意图。    据图回答问题： (1)在该实验中为构建基因表达载体，用SacⅠ、XbaⅠ切下CBFl基因后，对质粒载体进行切割的限制酶是 ，理由是 。 (2)连接CBFl基因到该质粒载体后，作为基因表达载体的组成还必须有 。将重组质粒导入香蕉细胞最常用的方法是 。 (3)为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含 的培养基进行筛选。 (4)科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉（实验组）与非转基因香蕉（对照组）进行 处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果 ，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。 (5)基因工程技术中对已获得的目的基因，常采用PCR技术大量扩增。该技术的基本过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链， 与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行 ，如此重复循环多次。 (6)限制酶SmaⅠ能识别下图所示核苷酸序列，并在图中箭头位置切断DNA．    用限制酶SmaⅠ切割获取的目的基因需用 酶构建基因表达载体。 【答案】(1)SacI、XbaI 用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端 (2)启动子和终止子 农杆菌转化法 (3)氨苄青霉素 (4)低温 实验组的抗寒能力明显高于对照组 (5)引物 互补链的合成（或延伸） (6)T4DNA连接 探究.实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）实验原理： ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极移动。 ②影响DNA分子的迁移率的因素：DNA的分子大小，DNA分子的构象，凝胶的浓度等。 ③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来。 （2） 步骤 ①DNA片段的扩增：PCR加样——离心——扩增 ②电泳鉴定：配制琼脂糖溶液——制备凝胶——电泳加样——电泳、观察 （3） 注意事项 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 例20：下列关于DNA的提取和DNA片段的扩增及电泳鉴定的叙述，正确的是（  D  ） A．电泳鉴定时，在带电量相同的情况下相对分子质量越大的DNA片段距离加样孔越远 B．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，可以在紫外灯下被检测出来 C．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入二苯胺试剂中进行沸水浴加热 D．利用DNA和蛋白质在冷酒精中溶解性的差异可初步分离出DNA 例21：（2024吉林）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ A ） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 例22：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　B　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 三、基因工程的应用 （一）基因工程在农牧业方面的应用 分类 实例 处理或作用 转基因抗虫植物 转基因抗虫棉、玉米、大豆、水稻和马铃薯 从某些生物中分离出抗虫基因导入作物，使之具有抗虫性状。可减少因　化学农药　的使用而造成的环境污染和对人类健康的损害，降低生产成本、提高产量  。 转基因抗病植物 抗病毒转基因甜椒、番木瓜和烟草等 将源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入作物,培育出抗病作物。 抗病毒的目的基因 抗真菌的目的基因 转基因抗逆植物 抗除草剂玉米、转鱼抗寒基因番茄等 抗逆性基因：调节细胞渗透压的基因(提高作物抗盐碱、抗干旱)；抗除草剂基因；鱼的抗冻蛋白基因。 改良植物的品质 高赖氨酸玉米、含大量纤维素的转基因玉米、转基因矮牵牛 改善植物的营养成分含量(如氨基酸、蛋白质)或提升观赏价值等。 提高动物的生长速率 转生长激素基因的鲤鱼 由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长更快，可将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。 改善畜产品的品质 转肠乳糖酶基因牛 将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低。 （二）基因工程在医药卫生领域的应用 分类 实例 处理或作用 转基因动物生产药物 乳腺生物反应器(乳房生物反应器) 将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。 转基因动物作器官移植的供体 克隆猪器官 抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。  基因治疗 镰状细胞贫血的治疗方案 基因治疗的策略主要有基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。 （三）基因工程在食品工业方面的应用 淀粉酶、凝乳酶、天冬氨酸和苯丙氨酸等的生产 利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵生产凝乳酶。 （四）乳腺生物反应器与基因工程菌生产药物比较 比较项目 乳腺生物反应器 工程菌 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性。 受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞 导入目的基 因的方式 显微注射技术 感受态细胞法 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞中提取 例23：下列有关基因工程的成果及应用的说法，错误的是（  B  ） A．基因工程可实现基因在不同种生物之间转移 B．利用基因工程技术，将人产生胰岛素的基因转入大肠杆菌后，大肠杆菌内表达出的胰岛素与人的胰岛素结构相同 C．基因工程在给人类生产和生活带来益处的同时，也使人们产生关于其安全性方面的担忧 D．基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物 例24：霍乱是因感染霍乱弧菌引起的一种传染性非常强的消化道疾病，患者往往上吐下泻，甚至死亡。研究人员通过基因工程改变大米的蛋白质构成，使其携带一种叫“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体后，能促进人体产生免疫反应，有效预防霍乱的感染。下列有关说法错误的是（  C  ） A．大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应 B．该项研究成功的标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体 C．当接种者再次接触抗原时，体内记忆细胞会迅速分泌大量抗体，与抗原特异性结合 D．“大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，效果明显，可造福世界人民 例25：基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述，正确的是( B ) A.为增加器官的来源，可对猪的器官进行改造以促进抗原决定基因的表达 B.将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，可降低乳汁中乳糖含量 C.作为乳腺生物反应器的动物体内只有乳腺细胞含目的基因 D.将牛凝乳酶导入黑曲霉中，再通过工业发酵可生产凝乳酶 四、蛋白质工程的原理和应用 1.蛋白质工程：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。  2.蛋白质工程和基因工程的比较 比较项目 蛋白质工程 基因工程 操作对象 基因 基因 操作起点 预期蛋白质功能 目的基因 操作水平 DNA分子水平 DNA分子水平 操作流程 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞 →目的基因的检测与鉴定 结果 可生产自然界没有的蛋白质 可生产自然界已有的蛋白质 实质 通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状 联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程； ②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程基本操作。 3.蛋白质工程的应用 （1）研发速效胰岛素类似物 （2）延长干扰素体外保存时间 （3）降低人对小鼠单抗了抗体的免疫反应 通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域(即可变区)“嫁接”到人的抗体(即恒定区)上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。 （4）其他 (1)改进酶的性能或开发新的工业用酶。 (2)改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加粮食的产量。 (3)改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。 （4）蛋白质工程现状 蛋白质工程是一项难度很大的工程；主要原因是蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。 例26：蛋白质工程是基因工程的延伸，下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（  A  ） A．通过蛋白质工程改造后的蛋白质的性状不可以遗传 B．蛋白质工程和基因工程都需要构建基因表达载体 C．蛋白质工程需要限制酶、DNA连接酶和载体等工具 D．蛋白质工程经常要建立蛋白质高级结构的三维模型 例27：图为蛋白质工程操作的基本思路，下列相关叙述正确的是（  D  ）    A．图中⑤、⑥过程分别在细胞核和核糖体中进行 B．根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA碱基序列是唯一的 C．蛋白质工程的直接操作对象是蛋白质，不需要对基因进行操作 D．蛋白质工程的目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求 例28：人体内的蛋白TPA能降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，但为心梗患者注射大剂量的TPA会诱发颅内出血。研究证实，通过蛋白质工程，将TPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的改良TPA，进而显著降低出血副作用。下列关于该蛋白质工程的叙述正确的是（   B  ） A．制造改良TPA的过程不遵循中心法则 B．可利用X射线衍射技术分析TPA的晶体结构 C．该例中TPA蛋白的基因增添碱基时可使用基因定点诱变技术 D．需要在分子水平上直接对TPA进行定向改造 例29：重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是（ D ） A.过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率 B.过程①只需要1轮PCR就能得到图中所示PCR产物 C.过程②的产物都可以完成延伸过程 D.若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2 【巩固训练】 1.下列有关基因工程说法中，不正确的是（ B ） A. 基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向地改造生物，培育出新品种 B. 基因工程的操作步骤包括提取目的基因、目的基因与运载体结合和导入目的基因 C. 基因工程中的工具酶是限制酶和DNA连接酶；常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等 D. 对于基因工程或分子生物学实验室向外排放转基因细菌等必须严加管制 2．T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是（　C　） A．T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性 B．T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变 C．ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键 D．T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下 3.利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时（ C ） A.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来 B.离心后上清液中加入75%冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的DNA C.将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象 D.可利用DNA在低温下遇到二苯胺试剂呈现蓝色反应的特性对其进行鉴定 4．RT—PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。以mRNA为模板，通过RT—PCR技术获取目的基因时，下列哪项叙述是错误的（ D ） A．加入的原料是4种脱氧核苷酸 B．加入的酶包括逆转录酶和热稳定DNA聚合酶 C．反应缓冲液中一般要添加镁离子 D．DNA延伸时温度控制在50℃左右 5．下图为采用“实时荧光定量RT-PCR(即将病毒RNA逆转录后再进行PCR扩增)”技术检测2019nCoV核酸的基本流程，1～2h内即可得到检测结果。有关说法正确的是（ D ）    A．过程①是逆转录过程，不属于中心法则的内容 B．过程②表示扩增DNA片段，需使用RNA聚合酶 C．荧光标记法还可以用于探究DNA的复制方式 D．RT-PCR反应体系中加入的原料是脱氧核苷酸 6. CD163 蛋白是 PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控 CD163 蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白 RFP基因与 CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ B ） A. CD163 基因中编码起始密码子的序列 B. CD163 基因中编码终止密码子的序列 C. RFP 基因中编码起始密码子的序列 D. RFP 基因中编码终止密码子的序列 7.某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　B　） A. Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B. 翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C. 2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D. 若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 8．重组PCR 技术是一项新的PCR技术，可将原来两个不相关的DNA 连接起来，成为一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1 基因片段，用重组PCR 技术构建了LTB-ST1 融合基因，融合基因的制备过程如图所示。下列相关分析正确的是（  D  ） A．PCR 实验中，离心管、缓冲液和蒸馏水使用前要进行消毒 B．在设计引物时，P1、P2和P3的部分碱基都能互补配对 C．得到的多个杂交链都能作为模板用来延伸子链，以扩增融合基因 D．由杂交链延伸生成融合基因的过程中，不需要再另外添加引物 9.下图为不同限制性核酸内切酶识别的序列及切割位置（箭头所指），下列错误的是（ B ） A．图示4种限制性核酸内切酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列 B．若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶高 C．酶切时使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 D．用酶BglII切出的目的基因与酶BamH I切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开 10.某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ B ） A. 其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B. 步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C. 用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D. 酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 11.像BclⅠ（-T↓GATCA-）、BglⅡ（-A↓GATCT-）、MboⅠ（-↓GATC-）这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是（ B ） 选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析 A BclI和BglⅡ BclI和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同 B BclI和BglⅡ MboI 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化 C MboI BclI和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboI再次切开，但可能无法被BclI和BglⅡ再次切开 D MboI MboI 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化 12．下列关于基因工程及基因表达过程的描述，错误的是（ C ） A．连接酶和聚合酶都是连接磷酸二酯键，但它们催化的底物不同 B．运输目的基因的载体上常有标记基因，便于重组分子的筛选 C．聚合酶与位于基因上游的起始密码子结合后起始转录 D．农杆菌转化法需将目的基因插入质粒的上进而整合到受体细胞的上 13.下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（ D ） A. 分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列 B. 该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上 C. 若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组 D. 获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异 14．幽门螺杆菌（Hp）感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶Xho I和Xba I切割，通过基因工程制备相应的疫苗，质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述错误的是（　C　）   A．Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组 B．基因表达载体导入之前，可用Ca2+处理大肠杆菌 C．培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素 D．能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中 15.用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　D　） A. 若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B. 若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C. 若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D. 若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 16．科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的（　B　） A．实验用PCR技术对M基因进行扩增，需要两种引物 B．含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上 C．即使M在西红柿中成功表达，也要做个体生物学水平鉴定 D．西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存 17．如图表示利用现代生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器的流程图，目的是从转基因山羊的乳汁中获得人乳铁蛋白。已知细胞甲是来自雌山羊的胚胎成纤维细胞，下列相关叙述错误的是（ C ）    A．完成图中①过程用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等 B．筛选出的细胞乙是含有目的基因的胚胎成纤维细胞 C．该重构胚发育至囊胚时需要进行DNA分析以鉴定性别 D．图示流程中，②④⑤过程都用到了显微操作技术 18．胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体中后，会堆积在皮下，要经过较长的时间才能进入血液，而进入血液的胰岛素又容易被分解，因此治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，下列说法不正确的是（　A　）    A．蛋白质工程是根据人们的特定需求，直接对蛋白质结构进行的设计或改造 B．蛋白质工程难度很大的主要原因是蛋白质的功能必须依赖复杂的空间结构 C．在将基因表达载体导入大肠杆菌时，一般要用Ca2+处理该菌 D．在大肠杆菌中直接生产的胰岛素不具有生物活性 19．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经加工后形成两条肽链（A链和B链）的有生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：    (1)由于 ，“AB”法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。“BCA”法是利用人体 细胞中的mRNA，再由mRNA经 得到的胰岛素基因， （填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。 (2)如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶 的识别序列，PCR引物应该添加在识别序列的 （填“3’或5’）端。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，若计划用1个胰岛素基因为模板获得m（m大于2）个胰岛素基因，则消耗的引物总量是 个。引物序列中的的GC含量越高，对PCR过程中的 步骤〔写出具体过程）影响最大，越 （填“有利于”或“不利于”）目标DNA的扩增。 (3)PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列叙述中正确的有______。 A．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在退火过程起作用 B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 D．琼脂糖溶液中加入的核酸染料利于DNA在紫外灯下被检测 (4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经 （处理方法）大肠杆菌后，与重组质粒混合培养一段时间，将大肠杆茵接种到添加了 和X-gal的培养基上筛选出 色的菌落即为工程菌种。 【答案】(1) 一种氨基酸可能对应多种密码子 胰岛B 逆转录 “AB”和“BCA” (2) Xhol和Munl 3’ 2m-2 变性 不利于 (3)BCD (4)钙离子处理 氨苄青霉素 白 20．紫杉醇是目前最好的抗肿瘤药物之一，但其药源植物红豆杉十分稀缺。利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇是解决紫杉醇药源紧缺问题的有效途径之一，但大多数红豆杉细胞培养物的紫杉醇产量较低，仍不足以进行工业化应用。超表达紫杉醇合成关键酶基因是提高红豆杉细胞紫杉醇产量的有效方法。回答下列问题： (1)Bapt基因是紫杉醇合成关键酶基因之一，可用红豆杉细胞中的相关mRNA通过___________过程得到cDNA，然后用___________技术对cDNA进行扩增。扩增过程中，加热使DNA解链后再将温度降低的目的是__________。 (2)若欲将超表达Bapt基因（Bapt基因与强启动子的结合物）导入到红豆杉细胞的染色体的DNA上，一般可使用___________法，在构建超表达Bapi基因载体的时候，可将超表达Bapt基因插入到___________上。 (3)可通过DNA分子杂交技术检测红豆杉细胞中___________（填“Bapt基因”或“强启动子”）的有无，从而确定超表达载体是否导入，原因是___________。为检验最终的实验目的是否达到，还应检测红豆杉细胞培养物中的___________。 【答案】(1)反转录 PCR 使引物与模板链的相应互补序列结合 (2)农杆菌转化 农杆菌中的Ti质粒的T-DNA (3)强启动子 红豆杉细胞中本身就存在Bapt基因，不管超表达载体是否成功导入，检测结果都能产生Bapt基因的杂交带 紫杉醇的产量 21．科研人员通过基因工程将Ipp20基因导入大肠杆菌体内并进行扩大培养。如图所示为部分过程，图2中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如图所示）。回答下列问题：    (1)在构建基因表达载体的过程中，质粒载体的目的基因上游通常需要有 碱基序列，是 识别位点，能驱动 。 (2)将构建好的目的基因导入大肠杆菌细胞时，通常需要用 处理大肠杆菌，处理后的大肠杆菌能 ，从而有利于目的基因进入其体内。 (3)已知在构建载体时，目的基因插入到了庆大霉素抗性基因序列中，但未改变质粒上青霉素抗性基因序列，则培养基A、B分别添加了 ，以便于对大肠杆菌进行筛选，图中菌落 中含有目的基因。 【答案】(1) 启动子 RNA聚合酶 目的基因转录出mRNA (2) Ca2+ 吸收周围环境中DNA分子 (3) 青霉素、庆大霉素 3和5 22．抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因（部分过程如图1所示），从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽。   (1)DNA聚合酶能够从引物的 （填“3´”或“5´”）端开始连接脱氧核苷酸。若设计的引物较长，为提高PCR的准确度需要适当 （填“提高”或“降低”）复性温度。 (2)Piscidin基因表达以a链为模板，NK-lysin基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物 和引物 的5´端添加互补序列。 (3)图2为PCR1扩增产物（Ⅰ、Ⅱ）和PCR2扩增产物（Ⅲ）的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是 。   (4)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是 ；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片。根据图示实验结果推测，在A、D区域放置的滤纸片分别为 。   【答案】(1)3´ 提高 (2) X Z (3)Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等 (4)使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用 空白滤纸片、含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片 23．某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图1中质粒为载体，进行转基因。不同限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题： 限制酶 BamHI EcoRI MfeI KpnI HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT (1)限制酶主要是从 中分离纯化出来的。应使用限制酶 切割图1中质粒，使用限制酶 切割图2中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 (2)与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 启动子（选填“植物”、“真菌”或“放线菌”）。 (3)W基因转录的模板链是 （选填“甲链”或“乙链”）。利用PCR技术对W基因进行扩增的原理是 ，子链的延伸方向是 。 (4)研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5′-UGAAC-GCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3′。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为______。 A．5′-TGAACGCTA… B．5′-CGAGTCGAC… C．5′-GAATTCTGA… D．5′-AAGCTTCGA… 【答案】(1) 原核生物 MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ (2)RNA聚合酶 放线菌 (3)乙链 DNA复制 5′→3′ (4)CD 24．PCR技术的实用性和极强的生命力其使成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题： (1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物，如图所示： ①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCRI应选择图1中引物 ，大量扩增突变产物AD则应选择引物 。 ②重叠延伸PCR通过 实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是 。 ③若正常基因可被限制酶DpnI识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnI识别，请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因： 。 (2)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 ①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是 。 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是 （填“顺时针”或“逆时针”），PCR产物 （填“含有”或“不含”）EcoRI的酶切位点。 【答案】(1) a和b a和d 在引物b和c上引入突变 引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效 用限制酶DpnI分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳；若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因 (2) DNA两端序列未知，无法设计引物 逆时针 含有 学科网（北京）股份有限公司 $$