第37讲 发酵工程-【备考无忧】备战2025年高考生物一轮复习优质课件

选修三 第37讲 发酵工程 第九单元 生物技术与工程 1 目标要求 1.掌握运用传统发酵技术生产果酒、果醋、泡菜的基本原理和方法；　 2.阐明发酵工程的基本环节和其应用价值；　 3.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提， 掌握无菌技术的操作方法； 4.通过调整培养基的配方有目的地分离纯化某种微生物；　 5.掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物分离和纯化；　 6.掌握利用稀释涂布平板法和显微镜计数法测定微生物数量。 2 01 传统发酵技术的应用 02 发酵工程及其应用 考点 03 微生物的基本培养技术 04 微生物的选择培养和计数 3 传统发酵技术的应用 01 4 传统发酵技术的应用 一、发酵与传统发酵技术 1.发酵 （1）概念 人们利用 ，在 的条件下，将原料通过 转化为人类所需要的产物的过程。 微生物 适宜 微生物的代谢 发酵的实质就是微生物在有氧或无氧条件下的细胞呼吸，是一个物质氧化分解的过程。 （2）原理 不同的微生物具有 的能力，因此利用它们就可以生产出人们所需要的多种产物。 产生不同代谢产物 5 2.传统发酵技术 一、发酵与传统发酵技术 菌种 来源 原料中 的或前一次发酵保存下来的面团、 卤汁等发酵物中的微生物 类型 以______发酵和_________发酵为主 实质 结果 生产人们需要的各种发酵产品 应用 果酒、果醋、泡菜、酱油等的制作 优点 缺点 天然存在 固体 半固体 有氧或无氧条件下的物质氧化分解 操作简单，便于家庭式或作坊式生产，是文化的传承等 生产条件不易控制，容易受杂菌污染，生产效率较低等 6 2.传统发酵技术 （1）腐乳制作 酵母、曲霉和毛霉等多种微生物 (毛霉起主要作用) 蛋白质 脂肪 小肽 氨基酸 甘油 脂肪酸 + + 脂肪酶 蛋白酶 ☞使得腐乳味道鲜美，易于消化吸收。 毛霉是一种丝状真菌，其生殖方式为孢子生殖，代谢类型是异养需氧型。 7 2.传统发酵技术 （2）泡菜制作 菌种来源 植物体表面的 ， 常见种类有 、 。 制作原理 在 的情况下能将葡萄糖分解成 。 反应式 无氧 乳酸 C6H12O6 2C3H6O3（乳酸）+能量 酶 乳酸链球菌 乳酸杆菌 天然的乳酸菌 8 配制盐水 菜料处理 封坛发酵 （2）泡菜制作 制作过程 配制质量分数为 的盐水，并将盐水 ， 待用。 5%～20% 煮沸 冷却 ☞盐水煮沸有两大作用：一是除去水中的氧气， 二是杀灭盐水中的其他细菌。 ☛冷却是保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响。 将新鲜蔬菜洗净切块，晾干装半坛，放入 ，继续装至 满。 香辛料 八成 将冷却盐水倒入坛中，使盐水 菜料，盖好坛盖， 向坛盖边沿的水槽中 ，创造 条件。 没过 注水 无氧 9 1.为什么泡菜坛只能装八成满？ 加水 习题巩固 在泡菜发酵初期，酵母菌等较为活跃， 发酵产物中有较多的CO2， 防止发酵液溢出坛外； ②防止因装太满使盐水未完全淹没菜料 而导致菜料变质腐烂； ③同时留有一定空间，也更方便拿取泡菜。 10 2.为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这层白膜是怎么形成的？ 形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。 白膜 习题巩固 11 4.为什么要选择新鲜蔬菜？ 蔬菜中含有大量的硝酸盐，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原亚硝酸盐，增加泡菜中的亚硝酸盐含量。 3.为什么含有抗生素的牛奶不能发酵为酸奶？ 牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的发酵作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。 习题巩固 5.泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有哪些? 温度高低、时间长短、食盐用量、腌制方法等。 12 发酵时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐 发酵初期 发酵中期 发酵后期 曲线模型 少（O2抑制乳酸菌活动） 少 增加（硝酸盐还原菌的作用） 最多（乳酸抑制其他菌活动） 增多 下降（硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解） 减少（乳酸积累，pH下降，抑制其活动） 继续增多， 最后保持稳定 下降至保持相对稳定（硝酸盐还原菌被完全抑制） 13 在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1－萘基乙二胺盐酸盐结合生成玫瑰红溶液。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。 实验原理 亚硝酸钠标准显色液 比色法 设计实验跟踪检测泡菜在制作过程中亚硝酸盐含量的变化。 实验目的 进一步探究——测定亚硝酸盐 14 2.传统发酵技术 （3）果酒和果醋的制作 比较项目 菌种 生物类群 代谢类型 菌种来源 果酒制作 果醋制作 醋酸菌 原核生物 酵母菌 异养兼性厌氧型 真核生物 异养需氧型 空气中的野生型醋酸菌 或购买醋酸菌的菌种或 从食醋中分离醋酸菌 新鲜水果果皮表面附着的大量不同种类的酵母菌 15 （3）果酒和果醋的制作 项目 果酒制作 果醋制作 发 酵 条 件 温度 时间 10～12 d 7～8 d 氧气 一般控制在 18～30 ℃ 30～35 ℃ 初期需氧，后期不需氧 需要氧气 16 （3）果酒和果醋的制作 项目 发酵原理 果酒 制作 在有氧条件下： 在无氧条件下： 果醋 制作 氧气、糖源都充足时： 氧气充足、缺少糖源时： C6H12O6 2C2H5OH＋2CO2+能量 酶 C6H12O6＋6O2 6CO2＋6H2O+能量 酶 C6H12O6＋2O2 2CH3COOH＋2CO2＋2H2O+能量 酶 C2H5OH＋O2 CH3COOH＋H2O+能量 酶 17 （3）果酒和果醋的制作 C6H12O6 2C2H5OH(酒精)+CO2+能量 酶 2O2 2CH3COOH(醋酸)+2H2O+能量 酶 + 酒精发酵：无氧，28℃ 醋酸发酵：有氧，30~35℃ 酒精发酵 → 醋酸发酵 ☞当缺少糖源时，将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 18 （3）果酒和果醋的制作 器具消毒 冲洗葡萄 榨汁装瓶 果酒检测 酒精发酵 打开瓶盖，盖上纱布 果醋检测 将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用。 全面防止杂菌污染 19 取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干。 A.新鲜葡萄用清水冲洗的主要目的是什么？ 冲洗次数不宜太多，为什么？ 冲洗次数不宜太多避免冲洗掉附着在葡萄皮上的野生酵母菌。 冲洗的主要目的是洗去浮尘； B.为什么先冲洗葡萄再除去枝梗？ 避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。 器具消毒 冲洗葡萄 榨汁装瓶 果酒检测 酒精发酵 打开瓶盖，盖上纱布 果醋检测 （3）果酒和果醋的制作 20 器具消毒 冲洗葡萄 榨汁装瓶 果酒检测 酒精发酵 打开瓶盖，盖上纱布 果醋检测 用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶（注意：要留有大约1/3的空间），盖好瓶盖。 在发酵液装瓶后为什么要保持1/3的剩余空间？ 利于酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖， 耗尽氧气后再进行酒精发酵 B.防止发酵过程中产生的CO2造成 发酵液的溢出。 （3）果酒和果醋的制作 21 器具消毒 冲洗葡萄 榨汁装瓶 果酒检测 酒精发酵 打开瓶盖，盖上纱布 果醋检测 将温度控制在18～30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点（注意：不是打开瓶盖），此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10～12d。 ①在果酒发酵阶段每隔12h拧松瓶盖一次， 其原因是什么？ 在果酒发酵过程中产生CO2 ， 防止瓶内气压过高引起爆裂。 ②拧松瓶盖后再将瓶盖拧紧，原因是什么？ 防止O2进入，影响酒精发酵 （3）果酒和果醋的制作 22 器具消毒 冲洗葡萄 榨汁装瓶 果酒检测 酒精发酵 打开瓶盖，盖上纱布 果醋检测 将温度控制在18～30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点（注意：不是打开瓶盖），此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10～12d。 ③为什么将温度控制在18-30℃进行发酵？ 因为果皮表面附着的野生酵母菌可能有很多种，所以提供了适合多种酵母菌生长的温度范围。另外，控制温度在一个较大范围内比较简单易行。 （3）果酒和果醋的制作 23 器具消毒 冲洗葡萄 榨汁装瓶 果酒检测 酒精发酵 打开瓶盖，盖上纱布 果醋检测 可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测。 （3）果酒和果醋的制作 24 器具消毒 冲洗葡萄 榨汁装瓶 果酒检测 酒精发酵 打开瓶盖，盖上纱布 果醋检测 当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。发酵温度为30～35℃，时间为7～8d。 打开瓶盖并盖上一层纱布的目的是什么？ 制造有氧条件，进行醋酸发酵。 （3）果酒和果醋的制作 25 结构 作用 酒精发酵时状态 醋酸发酵时状态 充气口 排气口 出料口 通入空气 关闭 打开，并接入气泵 排出CO2 打开 打开 便于取样检测 关闭 关闭 防止空气中 微生物的污染 填充棉花或者 安装其他过滤装置 果酒和果醋的发酵装置及各部件的作用 26 习题巩固 1.(2023·浙江6月选考)小曲白酒清香纯正，以大米、大麦、小麦等为原料，以小曲为发酵剂酿造而成。下图为传统酿造工艺流程图。 关于小曲白酒的酿造过程，下列叙述错误的是(　 ) A.糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖 B.发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测 C.若酿造过程中酒变酸，则发酵坛密封可能不严 D.蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，立即密封可高效进行酒精发酵 D 糖化主要是利用霉菌产生的淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖，A正确； 可用酸性重铬酸钾溶液检测蒸馏产物有无酒精，若存在酒精则溶液呈现灰绿色，B正确； 若酿造过程中酒变酸，则可能是发酵坛密封不严，导致醋酸菌在有氧条件下将乙醇氧化为醋酸，C正确； 蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，不能马上密封，需要提供氧气先让糟醅中的好氧型霉菌将原料中的淀粉糖化，以及让酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，D错误。 27 习题巩固 2.(2023·山东高考)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是(　 ) A.①主要是为了防止菜料表面的醋酸(杆)菌被杀死 B.②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌 C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入 D.④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低 C ①将盐水煮沸是为了杀灭杂菌和除去氧气，而冷却之后使用主要是为了保证乳酸菌的生命活动不受影响，A错误； ②盐水需要浸没全部菜料的主要目的是造成无氧环境，有利于乳酸菌进行无氧呼吸产生乳酸，B错误； ③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，是为了排气减压、隔绝空气、防止杂菌污染等，C正确； ④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，D错误。 28 习题巩固 3.(2024·忻州联考)酿酒和酿醋在我国已经有上千年的历史。下列关于酿酒和酿醋两种传统发酵技术条件的说法，正确的是(　 ) A.进行果酒发酵的菌种的代谢类型是异养厌氧型 B.果酒发酵的最适温度低于果醋发酵的最适温度 C.果醋发酵需要持续通入无菌空气，果酒发酵则一定不能通入空气 D.若果醋发酵的产物中出现CO2，则说明发酵底物缺少糖源 B 进行果酒发酵的菌种是酵母菌，其代谢类型是异养兼性厌氧型，A错误； 果酒发酵最适温度为18～30 ℃，果醋发酵最适温度为30～35 ℃，B正确； 果醋发酵需要持续通入无菌空气，果酒发酵前期需要通入一定量的空气，促进酵母菌的增殖，C错误； 若果醋发酵的发酵底物缺少糖源，则产物为乙酸和H2O，D错误。 29 习题巩固 AB 4.(多选)(2023·山东高考)果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产相比，共同点有(　 ) A.都利用了酵母菌无氧呼吸产生酒精的原理 B.都需要一定的有氧环境供发酵菌种繁殖 C.发酵前都需要对原料进行灭菌 D.发酵结束后都必须进行消毒以延长保存期 果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产均利用了酵母菌进行无氧呼吸产生酒精的原理，A正确； 发酵前期，果酒的家庭制作和啤酒的工业化生产均需要一定的有氧环境，使酵母菌大量繁殖，B正确； 果酒的家庭制作利用的是附着在原料上的野生酵母菌，发酵前不需要对原料进行灭菌，C错误； 果酒的家庭制作发酵结束后不需要对得到的果酒进行消毒，D错误。 30 习题巩固 5.(2024·保定二模)“寒霜屡下，园菜渐肥。取而曝之，俟略干，置缸中，腌以盐。旬余，便可取食。若藏之于瓮，泥封其口，虽留至明年，犹可食也。”以上为小古文《腌菜》。下列有关说法正确的是(　 ) A.古人多选择在秋冬季节腌菜与乳酸菌发酵的最适温度低有关 B.为成功制得腌菜，可将“园菜”和“瓮”用沸水泡烫片刻 C.腌菜时“泥封其口”是为了创造无氧环境，减少杂菌污染 D.“旬余，便可取食”与发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低有关 C 古人多选择在秋冬季节腌菜是因为春夏季节时温度高，杂菌繁殖速度快，容易导致菜腐烂变质，A错误； “园菜”不能用沸水泡烫，因为传统发酵过程中制作腌菜所需乳酸菌主要来自蔬菜表面，B错误； 腌菜时“泥封其口”的目的是创造无氧环境，因为无氧且酸度较高的条件可抑制杂菌生长减少杂菌污染，C正确； 发酵过程中亚硝酸盐含量先升高后逐渐降低至相对稳定，D错误。 31 习题巩固 6.(多选)泡菜的制作对工艺流程要求 非常高，如图为某食品公司安检人 员所记录的检测结果，下列相关叙 述正确的是(　 ) A.泡菜制作过程中，pH呈下降趋势，是酵母菌无氧呼吸所致 B.据图可知食盐浓度和腌制时间均会影响亚硝酸盐的含量变化 C.亚硝酸盐的含量达到峰值后会逐渐降低， 可能与乳酸菌产生的亚硝酸还原酶量增多有关 D.泡菜制作过程中泡菜坛内出现的白膜由乳酸菌大量繁殖形成 BC 泡菜制作的原理是乳酸菌的无氧呼吸过程中产生了乳酸，导致发酵液的pH呈下降趋势，A错误； 据图可知，食盐浓度和腌制时间均会影响亚硝酸盐的含量变化，亚硝酸盐含量达到峰值后下降，是因为缺氧和酸性环境抑制杂菌生长，使亚硝酸盐的产生量降低，同时乳酸菌产生的亚硝酸还原酶会将亚硝酸盐分解，B、C正确； 泡菜制作过程中泡菜坛内出现的白膜由酵母菌大量繁殖形成，D错误。 32 发酵工程及其应用 02 33 发酵工程及其应用 一、发酵工程的概念 是指利用 的特定功能，通过现代工程技术， 生产对人类有用的产品。它涉及 、 等方面。 微生物 规模化 菌种的选育和培养 产物的分离和提纯 自然界的微生物 诱变育种的微生物 基因重组的微生物 常规菌 工程菌 包括利用酵母菌发酵制造的啤酒、果酒，利用乳酸菌发酵制造的酸奶，及利用工程菌生产的人胰岛素。 ①微生物 ②产品： ③实质： 利用微生物进行产品生产。 34 发酵工程及其应用 二、发酵工程的基本环节分析 选育菌种 生产柠檬酸 生产啤酒 生产味精 黑曲霉 啤酒酵母 谷氨酸——棒状杆菌 性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。 扩大培养 灭菌 配制培养基 接种 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 35 选育菌种 扩大培养 灭菌 配制培养基 接种 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 扩大培养的原因： 工业发酵罐的体积一 般为及时立方米到几百立 方米，接入的菌种总体积 需要几立方米到几十立方米。 怎样扩大培养？ 将培养到增长速率最快时期的菌体分开，再进行培养。 二、发酵工程的基本环节分析 36 选育菌种 扩大培养 灭菌 配制培养基 接种 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 1.类型： 2.要求： ①根据菌种的代谢类型，选择不同的材料配制培养基。 ②配置的培养基应包括微生物生长所需的碳源、氮源、 水、无机盐及特殊营养要求。 ③应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。 ④配置的培养基要经过反复试验才能大规模应用。 发酵工程一般使用液体培养基。 二、发酵工程的基本环节分析 37 选育菌种 扩大培养 灭菌 配制培养基 接种 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 ①发酵工程所用的菌种大多数是单一菌种。 ②灭菌的原因： 杂菌与菌种之间形成种间竞争关系使产量下降或杂菌产生的代谢物抑制菌种的生长使产量下降。 ③实例： 在青霉素生产过程中如果污染了杂菌， 杂菌分泌青霉素酶就会将青霉素分解掉。 二、发酵工程的基本环节分析 38 选育菌种 扩大培养 灭菌 配制培养基 接种 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 ①发酵过程的监控： 要在发酵过程中随时取样，检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程； 及时添加必需的营养物质组分来延长菌体生长稳定期的时间，以得到更多的发酵产物； 严格控制温度、pH、溶解氧、通气量与转速等发酵条件，已获得所需的发酵产物。 发酵工程的中心环节 二、发酵工程的基本环节分析 39 抽取样本进行检测 调节罐温 控制溶解氧 使微生物与发酵液混合均匀，加快O2的溶解以及散热 调节罐压 培养物或营养物质的加入口 观察孔 取样管 电动机 排气管 pH计 冷却水排出口 冷却夹层 发酵液 搅拌叶轮 生物传感器装置 空气入口 温度传感器和控制装置 冷却水进入口 阀门 放料管 发酵罐示意图 40 选育菌种 扩大培养 灭菌 配制培养基 接种 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 ②发酵过程中为什么还要控制发酵条件呢？ 环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。 例如：谷氨酸的发酵生产：在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。 二、发酵工程的基本环节分析 41 计算机控制系统 温度、pH、溶解氧、灌压、通气量、搅拌、泡沫和营养等 微生物数量、产物浓度 及时添加必需的营养组分 使发酵过程 处于最佳状态 监测 控制 检测 微生物的生长繁殖和代谢物的形成 影响 发酵条件 发酵罐示意图 42 选育菌种 扩大培养 灭菌 配制培养基 接种 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 发酵产物类型 获得产品的方法 微生物细胞 代谢物 过滤、沉淀等方法 适当的提取、分离和纯化措施 分离、提纯产物的方法措施： 二、发酵工程的基本环节分析 43 发酵工程及其应用 三、发酵工程的应用 1.在食品工业上的应用 2.在医药工业上的应用 3.在农牧业上的应用 4.在其他方面的应用 44 1.在食品工业上的应用 （1）生产传统的发酵产品 谷物、水果 酒精+CO2 酵母菌 无氧条件 各种酒类 大豆蛋白质 小分子肽和氨基酸 酱油 霉菌产生蛋白酶 淋洗调制 （2）生产各种各样的食品添加剂 淀粉 黑曲霉 葡萄糖 柠檬酸 谷氨酸 棒状杆菌 谷氨酸 味精 柠檬酸合成酶 发酵 氧气 处理 淀粉酶 45 1.在食品工业上的应用 （3）生产酶制剂 ①概念： 从生物体中提取的具有酶特性的一类化学物质。 ②来源： 少数由动植物生产。 ③应用： 用于食品的直接生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口味、延长食品储存期 和提高产量等方面。 ④产品： α-淀粉酶、β-淀粉酶、果胶酶、氨基酸肽酶和脂肪酶等。 （4）生产各种各样的食品添加剂 46 发芽 1 2 焙烤 3 碾磨 4 糖化 大麦 水 糖化罐 大麦种子发芽， 释放淀粉酶。 加热杀死种子胚 但不使淀粉酶失活 将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉 淀粉水解 形成糖浆 啤酒的工业化生产流程 47 蒸煮 5 6 发酵 7 消毒 8 终止 产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。 酵母菌将糖转化为酒精和CO2 杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期。 过滤、调节、分装啤酒进行出售。 糖浆 啤酒花 过滤 冷却 装瓶 装罐 储存罐 啤酒的工业化生产流程 48 发芽 焙烤 碾磨 糖化 蒸煮 发酵 消毒 终止 加啤酒花 冷却 接种 过滤 主发酵 后发酵 酵母菌繁殖， 大部分糖分解和代谢物生成。 在低温、密闭的环境下储存一段时间，形成澄清、成熟的啤酒。 啤酒的工业化生产流程 49 1.啤酒的发酵过程分为_______和_______两个阶段； 2.主发酵阶段完成： ； 3.后发酵的条件________________________________； 4.焙烤的目的：________________________________； 5.蒸煮的目的： 主发酵 后发酵 酵母菌的繁殖、大部分糖分解和代谢物的生成 低温、密闭的环境下储存一段时间 加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活 产生风味组分（啤酒花），终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。 习题巩固 50 类别 “精酿”啤酒 “工业”啤酒 原料 是否添加食品添加剂 麦芽汁浓度 发酵时间 特点 只使用麦芽、啤酒花、酵母菌和水 麦芽、啤酒花、酵母菌、水、大米、玉米、淀粉等 不添加 添加 较高，口味浓郁 较低，口味清淡 长，可达2个月 短，通常7天左右 产量低、价格高 产量高、价格低 “精酿”啤酒与“工业”啤酒的区别 51 2.在医药工业上的应用 （1）生产抗生素 例如应用产黄青霉生产青霉素，用于治疗肺炎等。 （2）生产多种氨基酸 许多微生物都能产生氨基酸，发酵工程可生产许多具有治疗作用的氨基酸。 （3）生产激素 （4）生产免疫调节剂 例如，利用工程菌生产乙肝疫苗。 利用工程菌生产生长激素释放抑制激素，用于肢端肥大症的治疗。 52 基因工程、蛋白质工程与发酵工程相结合 发酵工程生产的药物 动植物的基因 微生物 直接改造微生物 转入 微生物 病原体的 抗原基因 转入 发酵 工程 药物 药物 疫苗 各种抗生素 多种氨基酸 多种激素 多种免疫调节剂 发酵工程生产药物的方法 53 3.在农牧业上的应用 （1）生产微生物肥料 利用微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长。 利用微生物代谢物抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。 （2）生产微生物农药 利用微生物或其代谢物来繁殖病虫害。 微生物农药作为　　　　 的重要手段。 生物防治 54 项目 微生物农药防治 化学农药防治 防治机理 优点 缺点 利用微生物或代谢物进行防治 成本低、无污染，可以维持生态平衡 防治速度慢 利用化学药剂（如杀虫剂、杀鼠剂）等进行防治 见效快，操作简单 成本高，污染环境，不利于维持生态平衡 微生物农药防治和化学农药防治的比较 55 （3）生产微生物饲料 微生物含有丰富的蛋白质，而且生长繁殖速度快。 以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的 ， 即单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。 微生物菌体 3.在农牧业上的应用 56 4.在其他方面的应用 （1）解决资源短缺和环境污染问题 利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质。 （2）对极端微生物（生活在高温、高压、高盐和低温环境）的利用 利用嗜热菌、嗜盐菌生产洗涤剂 嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量 57 习题巩固 1.(2024·大连模拟)某工厂采用发酵罐进行葡萄酒发酵。 下列叙述正确的是(　 ) A.可以采用过滤、沉淀等方法来获得葡萄酒 B.发酵工程中的中心环节是分离和提纯产物 C.可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵 D.在发酵工程中培养基需经过严格的灭菌， 而发酵设备则保持干净不需灭菌 C 发酵工程生产的产品不同，分离提纯的方法一般不同。如果产品是微生物细胞本身，可采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；如果产品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取，葡萄酒属于发酵产品，应用萃取、蒸馏等方法获得，A错误。 发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节，B错误。 发酵液中残留糖的浓度可指示发酵的进程，随着发酵的进行，当发酵液中糖的浓度降到较低水平时，酵母菌代谢减慢，此时可终止发酵，C正确。 在发酵工程中，为了获得纯净培养物，防止外来杂菌的污染，培养基和发酵设备都应经过严格的灭菌才能使用，D错误。 58 习题巩固 2.(2023·辽宁高考)利用某种微生物 发酵生产DHA油脂，可获取DHA (一种不饱和脂肪酸)。如图为发酵 过程中物质含量变化曲线。 下列叙述错误的是( 　 ) A.DHA油脂的产量与生物量呈正相关 B.温度和溶解氧的变化能影响DHA油脂的产量 C.葡萄糖代谢可为DHA油脂的合成提供能量 D.12～60 h，DHA油脂的合成对氮源的需求比碳源高 D 12～60 h间，发酵液中葡萄糖的减少量明显大于蛋白胨的减少量，由此推断，在此段时间，DHA油脂的合成对碳源的需求比氮源高 由图像分析可知，DHA油脂的产量和生物量均随着发酵的进行先逐渐增加后保持不变，二者的变化呈正相关，A正确； 温度和溶解氧的变化会影响微生物的生长繁殖，进而影响DHA油脂的产量，B正确； 葡萄糖可用于微生物的呼吸作用，葡萄糖分解释放能量，可为DHA油脂的合成提供能量，C正确； 由图可知，12～60 h间，发酵液中葡萄糖的减少量明显大于蛋白胨的减少量，由此推断，在此段时间，DHA油脂的合成对碳源的需求比氮源高，D错误。 59 习题巩固 AD 3.(多选)(2024年1月·吉林适应性演练) 为保障粮食安全，我国科研人员以富 含纤维素的农业残渣(秸秆)为原料， 利用基因工程改造面包酵母使其表面 携带相关酶，可同时高效生产人工淀粉和单细胞蛋白。部分生产工艺如下图，下列叙述正确的是(　 ) 注：酵母增殖的适宜温度为28～32 ℃，适宜pH为4.0～5.0； 酵母发酵的适宜温度为24～35 ℃，适宜pH为5.0～5.8。 A.面包酵母的增殖能促进纤维二糖水解及淀粉合成 B.生产单细胞蛋白时选择26 ℃、pH 5.5的条件为宜 C.本生产过程最宜在不加通气和搅拌的啤酒发酵罐中进行 D.生产前培养基高压蒸汽灭菌的条件可为121 ℃、20 min 令酵母菌增殖 面包酵母表面携带促进纤维二糖水解的酶和促进淀粉合成的酶，因此其增殖能促进纤维二糖水解及淀粉合成，A正确； 生产单细胞蛋白需要令酵母菌增殖，适宜温度为28～32 ℃，适宜pH为4.0～5.0，B错误； 本生产过程要使面包酵母增殖，应当在有氧环境下进行，C错误； 生产前培养基高压蒸汽灭菌的条件为121 ℃、100 kPa条件下处理15～30 min，D正确。 60 网络构建 61 网络构建 62 微生物的基本培养技术 03 63 微生物的基本培养技术 一、培养基的配置 1.概念 人们按照微生物对 的不同需求， 配制出供其 的营养基质。 营养物质 生长繁殖 2.作用 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或 。 积累其代谢物 3.营养构成 （1）基本成分 碳源、氮源、水、无机盐 各种有机物 蛋白质、核酸 64 ①碳源： 无机碳源： CO2、CO32-、HCO3- 有机碳源： 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等 自养微生物 异养微生物 ②氮源： 无机氮源： NH4＋、NO3-、NH3等 有机氮源： 蛋白胨、牛肉膏、尿素、氨基酸等 含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源 ③无机盐： Ca、K 、Mg为大量元素 Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素 （1）基本成分：碳源、氮源、水、无机盐 65 （2）特殊需求 满足微生物对 、 、 的需求。 特殊营养物质 pH O2 ④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。 ①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ； ②培养霉菌时，需要将培养基调至 ； ③培养细菌时，需要将培养基调至 ； 维生素 酸性 中性或弱碱性 无氧 维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 3.营养构成 66 4.类型 固体 培养基 液体 培养基 有无琼脂 分离、计数、 鉴定等 扩大培养、 工业生产 ①加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用， 只起到凝固作用。 ②微生物在固体培养基 表面生长，可以形成 肉眼可见的菌落。 一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 一、培养基的配置 67 培养基种类 特点 用途 物理性质 成分来源 不加凝固剂 加凝固剂， 如琼脂 工业生产 观察微生物的运动、 分类鉴定 微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种 液体培养基 半固体培养基 固体培养基 培养基的类型 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 培养基成分明确 分类、鉴定 天然培养基 合成培养基 68 培养基种类 特点 举例 功能 在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物 在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物 鉴别不同种类微生物 选择培养基 鉴别培养基 培养基的类型 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，变红；伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌，呈黑紫色并带有金属光泽 69 微生物的基本培养技术 二、无菌技术 1.目的 防止培养物被污染 2.关键 防止感染实验操作者 防止杂菌污染 ①消毒； ②灭菌； 3.防止杂菌污染的方法 ③避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触； ④为了避免周围环境微生物污染， 操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。 70 类型 适用范围 消 毒 灭 菌 较为温和理化方法，杀死部分微生（包括部分芽孢、孢子） 强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括所有芽孢、孢子） 煮沸消毒法 日常生活 巴氏消毒法 不耐高温的液体 化学药剂消毒法 生物活体、水源等 紫外线消毒法 灼烧灭菌法 接种工具 干热灭菌法 玻璃器皿和金属用具等 湿热灭菌 （高压蒸汽灭菌法） 培养基、培养皿等 接种室（箱）、 超净工作台 71 习题巩固 教材隐性知识 1. 选择性必修3 P10“相关信息”：生物消毒法是指利用生物或其　　 　除去环境中的部分微生物的方法。 代谢物 2.利用某些微生物可以净化污水、污泥，原因是___________________________________________________。 有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解 72 微生物的基本培养技术 三、微生物的纯培养 在微生物学中，将接种于 内，在合适条件下形成的含 的群体。 培养基 特定种类微生物 获得纯培养物的过程就是纯培养。 由 所获得的微生物群体。 单一个体繁殖 1.培养物 2.纯培养物 3.纯培养 ①配制培养基 ②灭菌 ③接种 ④分离 ⑤培养 4.纯培养的过程 5.纯培养的常用方法 平板划线法、稀释涂布平板 73 1.概念 分散的微生物(单一个体)在适宜的 表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 。 固体培养基 子细胞群体 2.特征 形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。 ——是鉴定菌种的重要依据 3.获得单菌落的方法 ①平板划线法 ②稀释涂布平板法 菌落 74 微生物的基本培养技术 四、酵母菌的纯培养 1.方法步骤 接种和分离 培养酵母菌 制备培养基 （1）制备培养基 配制培养基 灭菌 倒平板 Ⅰ.配制培养基 称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。 75 （1）制备培养基 配制培养基 灭菌 倒平板 Ⅱ.灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。 包器材 1.方法步骤 76 Ⅲ.倒平板 倒平板注意事项 ①温度：培养基冷却至50℃左右； ②操作：在酒精灯火焰附近； ③冷凝后平板倒置。 （1）制备培养基 配制培养基 灭菌 倒平板 1.方法步骤 77 1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 习题巩固 78 接种和分离 培养酵母菌 制备培养基 （2）接种和分离酵母菌 平板划线法 平板划线法是通过 在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。 单个细胞 微生物群 单个菌落 连续划线 分散或稀释 生长繁殖 接种环 1.方法步骤 79 ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。 ⑤试管口通过火焰， 并塞上棉塞 ③试管口通过火焰 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 平板划线法 80 分区划线法 1 2 3 4 5 1.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次； 2.划线首尾不能相接； 3.每次划线前接种环进行灭菌； 4.划线后，培养皿倒置培养。 连续划线法 划3个平板（重复实验） 1个不划线（空白对照） 平板划线法注意事项 81 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时， 为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 4.平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？ 最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，则增加了酵母菌数目，得不到纯化的效果。 习题巩固 82 5.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？ 在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 灼烧时期 目的 取菌种前 每次划线前 接种结束后 杀死接种环上残留的菌种， 避免细菌污染环境和感染操作者 杀死上次划线时残留菌种， 使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞 杀死接种环上原有微生物 习题巩固 83 （3）培养酵母菌 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。 作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染 接种和分离 培养酵母菌 制备培养基 1.方法步骤 84 习题巩固 A 1.(2024·深圳模拟)关于微生物纯培养的叙述，错误的是(　 ) A.各种培养基在配制时都应包含碳源、氮源、水和无机盐等 B.在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性 C.使用涂布器涂布后，需待菌液被培养基吸收后再将平板倒置 D.使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境 如固氮菌的培养基中不需要加入氮源 培养基的配方中一般包含碳源、氮源、水、无机盐，但不是各种微生物的培养基配方中都要包含这四种营养物质，如固氮菌的培养基中不需要加入氮源，A错误； 在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性，B正确； 使用涂布器涂布后，需待菌液被培养基吸收后再将平板倒置，放入恒温培养箱中培养，C正确； 使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境和感染操作者，D正确。 85 习题巩固 D 2.(2024·泉州调研)为纯化菌种，在鉴别培养基上 接种尿素分解细菌，培养结果如图所示。 下列叙述正确的是(　 ) A.图示采用的接种方法为平板划线法和稀释涂布平板法 B.可用干热灭菌法对盛有培养基的培养皿和试管等进行灭菌 C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的 D.培养基中的尿素被分解后，可使酚红指示剂变为红色 图示采用的接种方法为平板划线法，A错误； 可用湿热灭菌法对盛有培养基的培养皿和试管等进行灭菌，B错误； 该实验Ⅲ区有单菌落，可以达到菌种纯化目的，C错误； 培养基中的尿素被分解后呈碱性，可使酚红指示剂变为红色，D正确。 86 习题巩固 B 3.(2024·柳州一模)黑曲霉是一种丝状真菌，是重要的发酵工业菌种，其代谢产物广泛应用于食品加工等领域。黑曲霉的PDA液体产酶培养基组成为麸皮、豆粉饼、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4，培养时需要通气振荡。下列说法错误的是(　 ) A.黑曲霉的代谢类型为异养需氧型 B.上述培养基需要灭菌后将pH调至酸性 C.豆粉饼可提供黑曲霉生长所需的碳源和氮源 D.工业化生产时，黑曲霉接种前一般要进行扩大化培养 调节pH应该在灭菌之前进行 培养黑曲霉菌需要添加有机碳源且需要通气振荡，因此该菌的代谢类型为异养需氧型，A正确； 调节pH应该在灭菌之前进行，B错误； 豆粉饼中含有蛋白质、糖类等，可提供黑曲霉生长所需的碳源和氮源，C正确； 工业化生产时需大量的微生物，因此黑曲霉接种前一般要进行扩大化培养，增加菌种的数量，D正确。 87 习题巩固 C 4.获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。下列相关叙述正确的是(　 ) A.接种室、接种箱或超净工作台在使用过程中， 可用紫外线照射30分钟进行消毒 B.消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法 杀死物体表面或内部全部微生物 C.涂布器、接种环和接种针常采用灼烧灭菌的方法迅速彻底地灭菌 D.分离土壤中分解尿素的细菌时，将土壤稀释液彻底灭菌后 再接种到培养基上，可以有效防止杂菌的污染 接种室、接种箱或超净工作台在使用前用紫外线照射30分钟进行消毒，A错误； 消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，B错误； 灼烧灭菌是将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，C正确； 将土壤稀释液彻底灭菌，所要培养的目的菌也会一并被杀死，D错误。 88 习题巩固 C 5.(2024·南通模拟)下列有关纯培养酵母菌实验的叙述， 正确的是(　 ) A.配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞并用皮筋扎紧后， 放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌 B.灭菌后的培养基在酒精灯火焰附近倒入培养皿， 待冷却到50 ℃左右将培养皿倒置 C.通过接种环在固体培养基表面连续划线， 将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 D.划线完成后，待菌液被培养基吸收， 将平板放入适宜条件下培养，观察并计数 加棉塞，包上牛皮纸用皮筋扎紧后 灭菌后待培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸用皮筋扎紧后，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，A错误； 灭菌后待培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板，倒平板过程需要在酒精灯火焰旁进行，防止空气中的杂菌污染，B错误； 平板划线法是通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，C正确； 平板划线法不能用于计数，D错误。 89 微生物的选择培养和计数 04 90 微生物的选择培养和计数 一、选择培养基 在微生物学中，将允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 特定种类的微生物 抑制 阻止 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 空白 菌落 91 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 一、选择培养基 92 微生物的选择培养和计数 二、微生物的选择培养 1.方法 稀释涂布平板法 两个基本操作： 和 。 梯度稀释 涂布平板 （1）等比稀释操作（如图） 93 序号 图示 操作 1 取0.1 mL菌液，滴加到___________ 2 将涂布器浸在盛有______的烧杯中 3 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器 后，再进行涂布 4 用涂布器将菌液 地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀 （2）涂布平板操作 1.稀释涂布平板法 培养基表面 酒精 冷却 均匀 2.培养并观察培养基菌落 待涂布的菌液被 后，将平板 ，放入 中培养 d，在涂布有 菌液的平板上就可以观察到分离的 。 培养基吸收 倒置 恒温培养箱 1~2 合适浓度 单菌落 恒温培养箱 二、微生物的选择培养 95 1.培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养， 为什么？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长， 说明了什么？ 培养未接种的培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。 习题巩固 96 1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时， 不要忽略； 2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即 目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长 繁殖，所以还需要进一步验证； 3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行； 4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽， 然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的 烧杯中，以免引燃酒精。 注意事项 97 常用微生物分离方法比较 比较 平板划线法 稀释涂布平板法 工具 接种环 涂布器 原理 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落 特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数， 但操作复杂 共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体 ——菌落 98 微生物的选择培养和计数 三、微生物的数量测定 1.稀释涂布平板法 2.显微镜直接计数法 ——间接计数法 ——直接计数法 当样品的稀释度足够 时，培养基表面生长的一个 ，来源于 中的一个 。通过计数平板上的 数，就能推测出样品中大约含有多少 。 （1）原理 高 菌落 样品稀释液 活菌 菌落 活菌 1.间接计数法——稀释涂布平板法 99 （2）计数原则 ①选择菌落数为 的平板计数。 ② 稀释度下，应 对 个平板进行重复计数， 然后求出 。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目 。 ④统计的结果一般用 而不是活菌数。 30~300 同一 至少 3 平均值 低 菌落数 因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落。 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 1.间接计数法——稀释涂布平板法 100 （3）计算公式 M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 每g样品中的菌落数＝ (C÷V)×M 例题.某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 1.间接计数法——稀释涂布平板法 101 （1）原理 利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 血细胞计数板 细菌计数板 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 （2）缺点 ①不能区分死菌和活菌→偏大。 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 （3）优点 快速、直观 2.直接计数法——显微镜直接计数法 102 （3）计数方法 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。 （“染色排除法”） 2.直接计数法——显微镜直接计数法 103 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 显微镜、细菌计数板 或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差 计算公式 每毫升原液含菌株数＝ 400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝ 平均菌落数/所用涂布液体积 ×稀释倍数 三、微生物的数量测定 104 微生物的选择培养和计数 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.分离原理 土壤中的细菌分解尿素是因为他们能合成 。 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 配置以 为唯一氮源的选择培养基, 能够生长的细菌就是能够分解尿素的细菌。 脲酶 尿素 尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收 。 105 2.分离过程 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 在酸碱度接近 的潮湿土壤中取样。 （1）土壤取样 中性 （2）样品稀释 一般选用104、105、106倍稀释的菌液。 （3）培养、观察 每隔24h统计一次菌落数目， 选取 时的记录作为结果。 菌落数目稳定 3.鉴定计数 ① 可作为鉴定菌种的重要依据。 ②在培养基中加入 指示剂， 若指示剂变红，可确定细菌能分解尿素。 菌落特征 酚红 106 内容 现象 结论 有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 对照组的培养皿中有菌落 菌落形态多样，菌落数偏高 选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的 菌落数目大于 选择培养基上的数目 样品的 稀释操作 得到3个或3个以上菌落数目在30~300的平板 重复组的结果 未被杂菌污染 被杂菌污染 培养基中混入其他杂菌 选择培养基 具有筛选作用 操作成功 若选取同一土样，统计结果应接近 107 微生物的筛选与鉴别方法 微生物的筛选方法 单菌落挑取法 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物 选择培养法 利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物 鉴定培养法 利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物 微生物的鉴别方法 菌落特征鉴别法 根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别 指示剂鉴别法 如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红，说明该种微生物能够分解尿素 透明圈鉴别法 例如为了筛选出高效降解淀粉菌种，该培养基应以可溶性淀粉为唯一碳源，由于培养基中含有淀粉，而以淀粉为唯一碳源的微生物能产生淀粉酶分解淀粉，淀粉被分解后遇碘液不呈现蓝色，因而随着淀粉被分解，蓝色褪去出现透明圈 109 习题巩固 D 1.(2023·山东高考)平板接种常用在微生物培养中。 下列说法正确的是(　 ) A.不含氮源的平板不能用于微生物培养 B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒 C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃 D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物 不含氮源的平板可用于固氮微生物的培养，A错误； 平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，B错误； 使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误； 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。 110 习题巩固 D 2.(2023·广东高考)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　 ) A.a点时取样、尿素氮源培养基 B.b点时取样、角蛋白氮源培养基 C.b点时取样、蛋白胨氮源培养基 D.c点时取样、角蛋白氮源培养基 该实验的目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，应该用以角蛋白为唯一氮源的选择培养基进行筛选培养，且应该在高温条件下取样，即c点时取样，D符合题意。 111 3.(2024年1月·广西高考适应性演练)渥堆是六堡茶生产的关键工艺，渥堆期间微生物分泌的多酚氧化酶可催化茶叶中的儿茶素(C15H14O6)形成黄红色的氧化聚合物。要从渥堆茶叶样品中筛选产多酚氧化酶的细菌，下表中培养基配方设计最合理的是(注：“－”表示不添加；“＋”表示添加。)(　 )   组分/(g/L)名称 儿茶素 牛肉膏 葡萄糖 蛋白胨 KNO3 NaCl 琼脂 2 5 20 1 10 5 18     A 甲 － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ B 乙 ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ C 丙 ＋ － ＋ － － ＋ ＋ D 丁 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － 习题巩固 B 甲培养基没有儿茶素，无法筛选，A错误； 乙培养基为固体培养基，且含有碳源、氮源、无机盐、水、儿茶素，B正确； 丙培养基没有氮源，产多酚氧化酶的细菌无法生存，C错误； 丁未加入琼脂，液体培养基无法筛选，D错误。 112 习题巩固 D 4.DMF(一种含碳有机物)是一种优良的工业溶剂和有机合成材料，它广泛应用于制革、医药、农药等多个生产行业。含DMF的废水毒性大，会对环境造成严重危害，某实验小组筛选分离得到能够高效降解DMF的细菌，用于DMF的降解。下列有关叙述正确的是(　 ) A.分离高效降解DMF的菌株所用的培养基可以是液体培养基或固体培养基 B.可采用平板划线法或稀释涂布平板法对细菌进行分离并计数 C.利用平板划线法接种时，灼烧接种环的次数等于划线次数 D.利用显微镜对细菌进行直接计数时，统计的结果往往大于实际活菌数 对微生物的分离采用固体培养基，液体培养基可以用于微生物的扩大培养，A错误； 平板划线法不能用于细菌计数，因为平板划线法不能充分将微生物菌体分离开，划线用的菌液体积不能确定，每次划线前灼烧接种环会杀死部分微生物，使计数不准确，B错误； 利用平板划线法接种时，由于每次接种前和最终接种完成后需要对接种环灭菌，因此灼烧接种环的次数比划线次数多一次，C错误； 利用显微镜对细菌进行直接计数时，由于不能区分死菌和活菌，因此统计的结果往往大于实际活菌数，D正确。 113 习题巩固 C 5.(2024·成都预测)某研究团队从食塑 料蜡虫肠道中分离能降解聚乙烯(PE) 的细菌，以解决塑料污染问题。将分离得到的 两种细菌(YT1和YP1)在PE薄膜培养液中培养， 培养液中细菌数量变化以及PE失重率(降解PE能力的高低)变化如图所示。 下列叙述正确的是(　 ) A.用经湿热灭菌后的含PE、葡萄糖和无机盐等成分的液体培养基 分离目的细菌 B.分离得到目的细菌的纯培养可用平板划线法在酸性的选择培养基上进行 C.在对细菌进行计数时，常用显微镜计数法和稀释涂布平板法 D.在第20天后两种细菌群体降解PE的能力差异增大， 且细菌YT1强于细菌YP1 分离目的细菌要用PE为唯一碳源的固体培养基，不加葡萄糖，A错误； 培养细菌应在中性或弱碱性环境中培养，B错误； 对微生物进行计数时，常用显微镜计数法和稀释涂布平板法，C正确； 由图2中20天后PE失重率变化曲线可知YP1的值明显高于YT1，即细菌YP1降解PE的能力强于细菌YT1，D错误。 114 习题巩固 D 6.(2023·重庆高考)垃圾分类有利于变废为宝，减少环境污染。如图为分类后餐厨垃圾资源化处理的流程设计。 下列叙述错误的是( 　 ) A.压榨出的油水混合物可再加工，生产出多种产品 B.添加的木屑有利于堆肥体通气，还可作为某些微生物的碳源 C.X中需要添加合适的菌种，才能产生沼气 D.为保证堆肥体中微生物的活性，不宜对堆肥体进行翻动 产甲烷菌等 除了油和水，压榨出的油水混合物中还可能含有其他成分，油水混合物经过再加工，可以生产出多种产品，A正确。 添加木屑后形成的堆肥体疏松，有利于通气；木屑的主要成分为纤维素，可以为能分解纤维素的微生物提供碳源，B正确。 X中需要添加产甲烷菌等，才能产生沼气，C正确。 对堆肥体进行翻动可增大氧气供应，有利于需氧型微生物的活动，D错误。 115 7.营养缺陷型菌株是野生型菌株经过人工诱变或自发突变失去合成某种成长因子的能力，只能在补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。某研究小组对酵母菌用紫外线照射后将其接种到甲培养皿的培养基上，一段时间后将甲培养皿的菌落影印接种(不改变菌落位置)到乙、丙两培养皿的培养基中，进一步培养得到如下图所示结果。 下列分析正确的是( ) A.接种到甲培养皿采用的是 平板划线法 B.甲、丙两培养皿中的培养基是基本培养基 C.甲培养皿中菌落数有可能比接种的酵母菌数少 D.甲、乙、丙三个培养皿都可能存在营养缺陷型菌落 C 习题巩固 116 8. (2021·山东，20)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是（ ） A.乙菌的运动能力比甲菌强 B.为不影响菌的运动需选用液体培养基 C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量 D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染 B 习题巩固 117 网络构建 THANKS 作业 完成小本，明天收 119 $$