1.2 微生物的培养技术及应用（第二课时）（教学课件）-【上好课】2024-2025学年高二生物同步精品课堂（人教版2019选择性必修3）

选择性必修三《生物技术与工程》 第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用 微生物的选择培养和计数（第二课时） 微量移液器 目录 课堂小结 探究新知 04 情境导入 03 02 01 课堂练习 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一.选择培养基 二.微生物的选择培养 三.微生物的数量测定 情境导入 在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。 寻找耐高温的DNA聚合酶 美国黄石公园 PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 耐高温的酶 耐高温生物体 寻找 高温环境 寻找 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。 实验室筛选原理: 启示 选择培养基 4 01 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 类型 条件 分离得到的菌种 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 选择培养基 1.概念: 2.方法: 一.选择培养基 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 思考： 1.如让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基配方该如何设计？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 以尿素为唯一氮源，只有能合成脲酶细菌才能生长。 除以尿素为唯一氮源外，该培养基其他营养成分与普通培养基基本相同。 选择培养基配方的设计 一.选择培养基 尿素施入土壤后，会被某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。 尿素[CO(NH2)2] 3.怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 那么1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 一.选择培养基 选择培养基配方的设计 02 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 主要过程: ①梯度稀释菌液 ②涂布平板 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 二.微生物的选择培养 稀释涂布平板法 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 稀释涂布平板法的具体操作步骤? 02 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9mL 无菌水 90mL无菌水 10g ①铲取土样，将样品装入纸袋中 注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 （1）梯度稀释： 二.微生物的选择培养 稀释涂布平板法操作 微量移液器 9 02 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 浸 涂 灼 滴 注：各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照。 （2）涂布平板： 二.微生物的选择培养 稀释涂布平板法操作 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 恒温培养箱 思考：设置空白对照组的目的是什么？ 检测培养基灭菌是否彻底，保证实验结果的准确性。 根据实验结果，能否计算出细菌数目的是多少？原理是什么？ 可以。 培养与观察： 二.微生物的选择培养 ② 计数原则： ① 原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。 活菌 活菌 选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数； 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 三.微生物的数量测定 ——间接计数法 ——直接计数法 1.稀释涂布平板法 2.显微镜直接计数法 1.间接计数法——稀释涂布平板法 M：代表稀释倍数； C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个 ③ 计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M 1.1×108 三.微生物的数量测定 稀释涂布平板法——间接计数法 利用特定的____________或 ______________在________下观察、计数，然后再计算 __________的样品中微生物的数量； ①原理： 细菌计数板 血细胞计数板 显微镜 一定体积 ②优点： ③缺点： 快速、直观 ①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 2.直接计数法——显微镜直接计数法 *血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等； 细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 三.微生物的数量测定 显微镜直接计数法——直接计数法 计数区 放大后的计数室 ④计数方法： 每毫升原液所含细菌数＝ 每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 三.微生物的数量测定 显微镜直接计数法——直接计数法 项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、_____________ 　　　　　　 等 培养基等 计数依据 菌株本身 培养基上的　 　数 优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌 缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差 计算公式 每毫升原液含菌株数＝ 每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 血细胞计数板 或细菌计数板 菌落 每毫升原液含菌株数＝ 平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数 三.微生物的数量测定 比较直接计数法与间接计数法 平板划线法 稀释涂布平板法 主要步骤 接种工具 单菌落的获得 用途 培养结果 相同点 接种环在固体培养基 表面连续划线 等比稀释操作和涂布平板操作 接种环 涂布器 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 三.微生物的数量测定 两种纯培养方法比较 ①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。 1.提出问题（实验目的） （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 2.实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 脲酶 以尿素作为唯一氮源 选择 分解尿素 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3.实验步骤 （1）土壤取样 ③注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 （2）制备培养基 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源。 ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 ③KH2PO4和Na2HPO4的作用是： 提供无机盐； 调节pH。 ①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。 （细菌适宜在该环境中生长） ②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。 （细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。） 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (3)样品的稀释与涂布平板 测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养。 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (3)样品的稀释与涂布平板 ①每个浓度设置了 个平板，1、 2、3平板是选择培养基（ 实验）， 4为 培养基。 （用以判断选择培养基是否具有选择作用）； ②另外，整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的 。培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 4 重复 牛肉膏蛋白胨 2 选择培养基和牛肉膏蛋白胨 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时 的记录作为结果。防止 。 结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 因培养时间不足而导致菌落数目遗漏 24h 菌落数目稳定 注意事项： 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等； (4)微生物的培养与观察 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 如果没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。 如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 如果用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大， 就需从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。 ②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板?在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近? ③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少?与其他同学统计的结果接近吗?如果差异很大，可能是什么原因引起的? 4.结果分析与评价 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助 生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。 5.进一步探究 方法：在培养基中加入酚红指示剂 ——鉴别培养基 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。 可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 如果pH升高，指示剂将变红 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况； 固体培养基： 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 鉴别培养基——在成分中加入能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。 鉴定培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 四.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 课堂小结 1.下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是(　　) A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养 B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌 C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力 D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值 A　 课堂练习 筛选产纤维素酶菌的培养基应以纤维素为唯一碳源。 A　 2.下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　) A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株 B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源 C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落 D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌 D　 课堂练习 D　 产脲酶菌分解尿素，不分解酚红指示剂，该指示剂是用来鉴定尿素分解产物的。 Lavf59.27.100 $$