第2节 第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定-【金版新学案】2024-2025学年高中生物选择性必修3同步课堂高效讲义配套课件（人教版2019 单选）

　 第3章　第2节　基因工程的基本操作程序 第2课时　将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 学习目标 1．阐明将目的基因导入受体细胞的方法。　 2．阐明目的基因的检测与鉴定的方法。　 3．明确DNA片段的扩增及电泳鉴定原理，进行相关操作。 知识点一　将目的基因导入受体细胞 1 知识点二　目的基因的检测与鉴定 2 知识点三　DNA片段的扩增及电泳鉴定 3 课时测评 6 学习小结 4 内容索引 随堂达标演练 5 将目的基因导入受体细胞 知识点一 返回 新知导学 1．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_________和_____的过程。 2．目的基因导入受体细胞的方法 受体细胞 导入方法 内容 植物 细胞 花粉管 通道法 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入_____中。 ②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助____________进入_____ 维持稳定 表达 子房 花粉管通道 胚囊 受体细胞 导入方法 内容 植物 细胞 农杆菌转化法 ①农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有___质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的________(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的_____________上 ②目的基因插入____质粒的________中→导入__________→整合到受体细胞的____________上→表现出新性状的植株 动物细胞 _________技术 ①受体细胞：________。 ②过程：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物。 原核细胞 Ca2+处理法　 用_____处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 Ti T-DNA 染色体DNA Ti T-DNA 植物细胞 染色体DNA 显微注射 受精卵 Ca2+ 精通教材 1．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞吗？ 提示：不是，为培育抗除草剂的作物新品种，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。 2．为什么经常选用大肠杆菌作为受体细胞？ 提示：大肠杆菌的遗传物质少，且容易培养，繁殖速度快等。 合作探究 任务　分析农杆菌转化法 右面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题： (1)为什么在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上？ 提示：Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。 (2)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。 (3)农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。 提示：能，可从双子叶植物中提取该化学物质，再用该化学物质处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。 1．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 (1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。 (2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌(Ca2+处理法)，第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞(农杆菌转化法)。 核心归纳 2．受体细胞的选择 (1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 (2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。 应用1．(2024·新疆乌鲁木齐高二期中)受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是A．大肠杆菌—Ca2+ B．棉花受精卵细胞—花粉管通道法 C．羊高度分化的体细胞—显微注射法 D．番茄细胞—农杆菌转化法 √ 用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，容易吸收外来DNA分子，A正确；当以棉花受精卵为受体细胞时，常用花粉管通道法，B正确；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，常用动物受精卵为受体细胞，C错误；番茄为双子叶植物，番茄细胞可以用农杆菌转化法，D正确。 特别提醒 基因工程植物细胞和动物细胞的受体细胞存在差异 目的基因导入植物细胞时常选用植物的体细胞作为受体细胞，主要是因为植物体细胞具有全能性，且取材方便，而动物的体细胞不易表达全能性，故而对动物细胞来说，常选用全能性最高的受精卵为受体细胞。　　 应用2．下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是 A．图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B．图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 √ 图中Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B错误；图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞，C正确；基因的表达具有一定的独立性，剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D正确。 返回 目的基因的检测与鉴定 知识点二 返回 新知导学 1．分子水平上的检测 PCR mRNA 抗原—抗体杂交 2．个体生物学水平上的检测 提醒：转录水平的检测与复制水平的检测原理都是分子杂交；翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。 精通教材 1．基因表达载体中已经具备标记基因(如抗生素抗性基因)，对受体细胞进行了筛选。为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？ 提示：在含抗生素的选择培养基上能生长的是导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。 2．如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？ 提示：如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验。如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。 合作探究 任务　分析目的基因的检测与鉴定 1．目的基因已经插入受体细胞的染色体DNA上，为什么还要进行转录和翻译水平的检测？ 提示：插入的目的基因不一定会表达。 2．从目的基因表达的角度上看，目的基因的检测与鉴定主要包括哪些步骤？检测的技术手段分别是什么？ 提示：①检测目的基因是否转录出mRNA：PCR等技术；②检测目的基因是否翻译出特定的蛋白质：抗原—抗体杂交技术。 3．鉴定导入的抗虫基因是否表达，并表现出抗虫性状的最简便的方法是什么？ 提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。 1．分子水平上目的基因的检测与鉴定 核心归纳 2．个体水平上检测转基因生物的方法举例 转基因生物 检测方法 观察目标 抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡 抗病植物 病毒(菌)感染 是否出现病斑 抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长 获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能活性是否正常 应用1．(2024·江苏常州高二期中)如图 是将人的生长激素基因导入细菌B细胞 内制“基因工程菌”的示意图。已知 细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒 A上的基因。下列说法正确的是 A．将重组质粒导入细菌B常用的方法 是农杆菌转化法　 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只是导入了普通质粒的细菌 C．为防止特异性引物的特异性差，PCR获取人生长激素基因设计的特异性引物不宜过长 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞中含有人的生长激素基因 √ 将基因表达载体导入细菌B之前，一般 要先用Ca2+处理受体细胞，使其处于感 受态，而农杆菌转化法是将目的基因导 入植物细胞的常用方法，A错误；由于 重组质粒构建过程中抗四环素基因被破 坏，所以能在含有四环素的培养基上生 长的是导入普通质粒A的细菌，B正确； PCR引物的设计是获得大量高纯度目的基因的关键，引物中碱基数量越多，则引物的特异性越高，为防止特异性引物的特异性差，PCR获取人生长激素基因设计的特异性引物不宜过短，C错误；基因表达的产物是蛋白质，目的基因成功表达的标志是受体细胞中表达出相应的蛋白质，D错误。 应用2．科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。下列有关分析错误的是 A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若检测到细胞中无Bt抗虫蛋白，则说明抗虫基因不能表达 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则说明抗虫基因能正常转录和翻译 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能正常转录 D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞 √ 若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译出蛋白质，B错误。 返回 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识点三 返回 新知导学 1．DNA片段的扩增 解聚与结合 30 微量移液器 微量离 心管 离心机 反应液 2．PCR扩增产物的电泳鉴定 (1)实验原理 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 DNA分子的大小和构象 紫外灯 (2)实验步骤 琼脂 核酸染料 加样孔 电泳缓冲液 加样孔 指 糖 示分子大小的标准参照物 指示剂 紫外灯 精通教材 1．将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应，程序应该怎样设定？ 提示：变性(94 ℃)→复性(55 ℃)→延伸(72 ℃)循环。 2．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行严格灭菌，为什么？ 提示：避免污染使外源性DNA大量扩增，造成假阳性反应。 合作探究 任务　分析实验原理和操作 1．判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？如果没有成功应该从哪些方面分析？ 提示：一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。 2．如果没有出现扩增条带，可能的原因有哪些？ 提示：(1)Taq DNA聚合酶失活。(2)引物出现质量问题。(3)Mg2+浓度过低。(4)变性时的温度低，变性时间短等。 1．操作提示 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 核心归纳 2．关键点拨 (1)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G、C含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 (2)出现非特异性扩增条带的主要原因 ①模板DNA出现污染。 ②引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③Mg2+浓度过高。 ④复性时的温度过低等。 应用1．(2024·重庆璧山高三期中)PCR技术在生物工程中应用广泛，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列叙述正确的是 A．PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活RNA聚合酶 B．PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶，该酶可在复性过程起作用 C．限制酶切割质粒前后，质粒的长度不变，故无法通过电泳检测质粒是否被切开 D．若采用PCR技术对一个双链目的基因进行扩增，则第n代复制共需要引物2n个 √ PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，A错误；PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，B错误；因为质粒被切开后可能成为多个DNA片段，相对分子质量彼此不同，因而可通过电泳检测，C错误；PCR技术大量扩增目的基因时，第n次复制形成2n-1个DNA，合成一个DNA分子需要两个引物，因此需要的引物数目为2n-1×2＝2n，D正确。 应用2．(2024·巴蜀中学高三期末)以洋葱为材料提取DNA后，用PCR技术对目的基因进行扩增，并对扩增产物进行电泳检查。若电泳结果有多个条带，则导致该结果的原因是 A．洋葱研磨离心后，取沉淀进行了纯化 B．所用的引物，也结合了其他DNA序列 C．进行扩增时，变性温度设置成了72 ℃ D．配制琼脂糖溶液时，没有加入核酸染料 √ 洋葱研磨离心后，应该取上清液，取沉淀进行纯化，可能提取不到DNA，不会导致电泳结果有多个条带，A错误；若所用的引物，也结合了其他DNA序列，说明引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体，则电泳结果有多个条带，B正确；进行扩增时，变性温度应该为94 ℃，若设置成了72 ℃，DNA双链不会解开，最后扩增不到DNA，电泳结果不会有多个条带，C错误；配制琼脂糖溶液时，若没有加入核酸染料，会导致看不到条带，D错误。 返回 学　习　小　结 返回 思维导图 要语必背 1.转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.将目的基因导入植物细胞的方法有花粉管通道法和农杆菌转化法等。 3.将目的基因导入动物受精卵中最常用显微注射法；导入大肠杆菌需用Ca2+处理。 4.目的基因的检测方法有分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR等技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原—抗体杂交技术。 返回 随 堂 达 标 演 练 返回 1．下列关于将目的基因导入受体细胞的方法中，错误的是 A．我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉 B．用Ca2+处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞 C．将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D．利用农杆菌转化法培育大多数单子叶转基因植物 √ 目前我国的转基因抗虫棉是利用花粉管通道法培育的，A正确；为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用氯化钙溶液进行处理，使大肠杆菌处于易吸收周围环境中DNA分子的感受态，B正确；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最为有效的一种方法，C正确；农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，D错误。 2．(2024·浙江杭州高二期中)目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定关键步骤的是 A．检测受体细胞是否有目的基因 B．检测受体细胞是否有致病基因 C．检测目的基因是否转录mRNA D．检测目的基因是否翻译蛋白质 √ 检测受体细胞中是否有目的基因是鉴定和检测的第一步，但即便受体细胞中存在目的基因，不能说明目的基因一定会稳定遗传并表达，A错误；目的基因不一定是致病基因，B错误；检测目的基因是否转录出mRNA，但能否翻译成相应的所需蛋白质却不一定，所以该步不是最关键的步骤，C错误；检测目的基因是否翻译蛋白质是检测目的基因是否表达的最后步骤，如果存在该蛋白质，说明目的基因能在受体细胞内稳定存在并能表达，D正确。 3．甲醇酵母是基因工程中常用的受体菌，它可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是 A．用两种酶切割目的基因和质粒，可防止目的基因反向连接和质粒的自身环化 B．常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中 C．与大肠杆菌相比，甲醇酵母作受体菌表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近 D．与其他酵母菌相比，甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化 √ 用两种酶切割目的基因和质粒，可形成不同的末端，因此，可防止目的基因反向连接和质粒的自身环化，A正确；常用Ca2+处理法将目的基因导入微生物细胞，B错误；与大肠杆菌相比，甲醇酵母为真核生物，表达出的胶原蛋白经过内质网和高尔基体的加工，所以与人体产生的胶原蛋白结构更相近，C正确；与其他酵母菌相比，甲醇酵母可以高效表达外源蛋白，自身蛋白分泌到培养基的较少，便于目的蛋白的分离和纯化，D正确。 4．(2024·山西太原一模)人血白蛋白在临床上被广泛应用。我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，其流程如下图所示。下列叙述正确的是 A．PCR扩增时需要DNA模板、引物、耐高温的RNA聚合酶等条件 B．过程①需用农杆菌转化法将人血白蛋白基因直接导入水稻胚乳细胞中 C．过程①需将目的基因与胚乳中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组 D．过程②改变生长素和细胞分裂素的浓度及比例不影响细胞的脱分化过程 √ PCR扩增时需要DNA模板、引 物、耐高温的DNA聚合酶、脱 氧核苷酸等条件，A错误；将 目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等，过程①可用农杆菌转化法将含有人血白蛋白基因的基因表达载体导入水稻细胞中，通过植物组织培养获得转基因水稻，所以受体细胞并不是水稻胚乳细胞，B错误；我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，过程①在构建基因表达载体时，需将目的基因与胚乳中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组，从而使目的基因在水稻的胚乳细胞中特异性表达，C正确；过程②进行植物组织培养，主要包括脱分化和再分化过程，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，改变它们的浓度及比例对脱分化和再分化过程均有影响，D错误。 5．关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是 A．PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度 B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中起作用 C．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D．电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出 √ PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌，C错误；电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。 6．(创新情境)B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如图实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。 注：启动子是指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。 回答下列问题： (1)启动子是_________酶识别并结合的部位。题中的基因表达载体除了启动子外，还必须有_________________ ______________(答出两点即可)。 RNA聚合 目的基因、标记基 因、终止子等 启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。题干中的基因表达载体除了启动子外，还必须有目的基因、标记基因、终止子等。 (2)为筛选出导入重组质粒的农杆菌，培养基除了添加农杆菌生长繁殖必需的成分和琼脂外，还要添加_________ _________(答出两点即可)。 潮霉素和 卡那霉素 潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为标记基因，转化成功的农杆菌因含有上述两种抗性基因，可在含有潮霉素和卡那霉素的培养基中存活，否则不存活。 (3)②过程利用了农杆菌能侵染水稻愈伤组织并且将Ti质粒上的________转移至水稻愈伤组织细胞，并整合到水稻细胞染色体DNA上，这种方法称为______________。除此之外，还可用_____________法把目的基因导入植物受体细胞中。 T-DNA　 农杆菌转化法　 花粉管通道 ②过程利用了农杆菌能感染水稻愈伤组织并且将Ti质粒上的T-DNA转移至水稻愈伤组织，并整合到水稻细胞染色体上，这种方法称为农杆菌转化法。除此之外，还可用花粉管通道法把目的基因导入植物受体细胞中。 (4)鉴定和筛选表达B基因的转基因植株的方法是_______________________ ________________________。 检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光 由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光。 返回 课　时　测　评 返回 知识点一　将目的基因导入受体细胞 1．下列关于将目的基因导入受体细胞的描述，正确的是 A．可以通过显微注射法直接将目的基因导入动物的受精卵中 B．通过基因工程大量获得胰岛素时，受体细胞选择大肠杆菌比酵母菌更有优势 C．可以用PEG处理大肠杆菌将目的基因导入其细胞内 D．可以使用病毒将目的基因导入受体细胞 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 目的基因导入受体细胞前必须进行基因表达载体的构建，不能直接将目的基因导入，A错误；酵母菌细胞中有多种细胞器，作为受体细胞生产胰岛素(分泌蛋白)比大肠杆菌更有优势，B错误；大肠杆菌作为受体细胞时应使用Ca2+进行处理，C错误；可以利用部分病毒将自身DNA整合到宿主细胞染色体上的特点构建病毒表达载体，并通过病毒的侵染将目的基因导入相关受体细胞，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2．(2024·福建厦门高二期中)以下关于农杆菌转化法的叙述错误的是 A．若用Ti质粒作载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内 B．将重组Ti质粒导入农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌 C．农杆菌能将重组Ti质粒转移到被侵染的植物细胞内，并将其整合到染色体上 D．能在植物细胞中检测到目的基因，还不能说明转化成功 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 若用Ti质粒作为载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，这样可以保证目的基因随T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，A正确；将重组Ti质粒导入农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌，使细菌处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，B正确；农杆菌能将重组Ti质粒中的T-DNA转移到被侵染的植物细胞内，并将其整合到染色体上，C错误；目的基因成功导入还不能说明该基因工程项目获得成功，只有转基因植株具有相关的特性才能说明基因工程项目获得成功，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 3．(2024·甘肃天水一模)科学家将抵御干旱胁迫反应中具有调控作用的AhCMO基因转入棉花细胞中，培育出了转基因抗旱棉花。下列叙述错误的是 A．将AhCMO基因导入棉花细胞可用农杆菌转化法 B．构建基因表达载体是培育转基因抗旱棉花的核心工作 C．AhCMO基因成功插入棉花细胞染色体上也未必能正常表达 D．PCR扩增AhCMO基因时需要设计两种碱基互补的引物 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 将AhCMO基因导入棉花细胞可用农杆菌转化法，因为农杆菌中的Ti质粒能将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，A正确；构建基因表达载体是培育转基因抗旱棉花的核心工作，即基因表达载体的构建是基因工程的核心，B正确；AhCMO基因成功插入棉花细胞染色体上也未必能正常表达，因为基因的表达包括转录和翻译两个步骤，因此还需要对转基因棉花进行进一步的检测和鉴定，C正确；PCR扩增AhCMO基因时需要设计两种引物，这两种引物之间不能发生碱基互补配对，否则无法实现DNA体外扩增，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 知识点二　目的基因的检测与鉴定 4．下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是 A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译 C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质 D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物(染色体)DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误；PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误；抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 5．(2024·山东济宁高二期中)右 图表示应用基因工程技术生产 干扰素的三条途径，下列叙述 错误的是 A．途径甲中，过程Ⅰ应将干 扰素基因和乳腺细胞特异表达 的基因的启动子重组 B．途径乙中，过程Ⅱ一般采用的方法是农杆菌转化法 C．途径丙中，过程Ⅱ可用Ca2+处理大肠杆菌，以制备感受态细胞 D．三条途径中，由于使用的目的基因相同，表达出的干扰素结构也完全相同 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 途径甲中，要想使目的基因在乳 腺中表达，过程Ⅰ应将干扰素基 因和乳腺细胞特异表达的基因的 启动子重组，A正确；途径乙中， 过程Ⅱ将目的基因导入植物细胞 时，一般采用的方法是农杆菌转化法，B正确；途径丙中，过程Ⅱ将目的基因导入大肠杆菌时，常用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为易吸收周围环境中DNA的感受态细胞，C正确；干扰素是一种分泌蛋白，干扰素基因表达后需要在真核细胞的内质网和高尔基体进行加工才能形成具有特定结构的蛋白质，大肠杆菌没有内质网和高尔基体，表达出的干扰素结构与前两条途径获得的干扰素结构不同，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 6．(2024·湖北武汉模拟)为了获得抗 蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花 莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集 素基因(ACA)与载体(pBI121)结合， 然后导入棉花细胞。下列叙述错误 的是 A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因 B．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞即为成功转入目的基因的细胞 D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 由图可知，GNA、ACA都含有限制酶 BsaBⅠ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ 和DNA连接酶处理两种基因可获得 GNA－ACA融合基因，A正确；图中 质粒与GNA－ACA融合基因上都含有 KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，避免反向连接，B正确；在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞为成功转入目的基因的细胞或含有普通质粒的细胞，C错误；PCR技术可用于基因探针的制备，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，即用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 知识点三　DNA片段的扩增及电泳鉴定 7．下列有关电泳的叙述，不正确的是 A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 √ 由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 8．用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是 2号：野生型植株DNA　3号：？　4～9号：转基因植株DNA A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间 B．3号样品为不含目的基因的载体DNA C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D．10号确定反应体系等对结果没有干扰 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 PCR过程中，可以通过设计特定 的引物来扩增特定的DNA片段， 4～9号是转基因植株，理论上应 包含目的基因，结合2号野生型 和10号蒸馏水组的结果，推测包 含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 9．(2024·江苏扬州模拟)DNA琼脂糖凝胶电泳是一种分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的技术。下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙述，正确的是 A．mRNA也是核酸，因此可直接用PCR扩增仪扩增 B．PCR反应缓冲液中一般要添加ATP，以激活耐高温的DNA聚合酶 C．带电量相同的情况下，相对分子质量比较大的DNA片段距离加样孔越近 D．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 mRNA是核酸，但不能直接用PCR扩增仪扩增，需要先逆转录为cDNA再用PCR扩增仪扩增，A错误；PCR反应缓冲液中一般要添加dNTP，耐高温的DNA聚合酶不需要添加ATP激活，需要Mg2+激活，B错误；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，带电量相同的情况下，相对分子质量比较大的DNA片段移动距离较短，距离加样孔越近，C正确；琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中不含指示剂，不能在紫外灯下被检测出来，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 10．(2024·云南昆明高三期末)研究发现，某农作物的品系N具有抗虫、高产等优良性状，但是甜度不高，而基因Z与农作物的甜度有关。科研人员以Ti质粒为载体，以品系N的叶片外植体为受体，培育转Z基因的新品系n。下列叙述错误的是 A．若只用一种限制酶切割目的基因和Ti质粒可能导致目的基因反向插入载体 B．培育转Z基因的新品系n的过程中利用了植物细胞的全能性 C．成功转入重组Ti质粒的叶片细胞培育成的植株即为新品系n D．重组DNA技术可定向改变生物的性状 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 若只用一种限制酶切割目的基因和Ti质粒，会产生相同的末端而导致反向连接，A正确；培育转Z基因的新品系n的过程利用了叶片作为外植体培育成植株，利用了植物细胞的全能性，B正确；成功转入重组Ti质粒的叶片细胞培育成的植株中基因Z不一定能稳定遗传和表达，还要进行进一步的筛选，C错误；重组DNA技术是将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建基因表达载体，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术，可定向改变生物的性状，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 11．(2024·山东德州高二期中)限制酶介导的整合技术(REMI)是一种研究基因的新方法。用限制酶酶切得到的线性质粒与该酶组成的转化混合物进入并转化细胞时，会切割受体细胞基因组，产生与线性质粒互补的黏性末端，线性质粒通过碱基配对插入基因组。如果插入发生在一个已知基因的内部，则该基因的功能可能改变或丧失，即发生了基因突变。下列叙述错误的是 A．当外源质粒带有抗性基因时，可根据其在受体细胞内的表达情况筛选出转化细胞 B．所有的限制酶都具有专一性 C．REMI使基因突变具有随机性，且限制酶识别序列越长，随机性越大 D．REMI利用了限制酶的特异性可探究某基因的功能 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 抗性基因属于标记基因，标记基因可将含有目的基因的重组质粒筛选出来，故当外源质粒带有抗性基因时，可根据其在受体细胞内的表达情况筛选转化细胞，A正确。限制酶能识别特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割，即所有的限制酶都具有专一性，B正确。REMI是一种切割基因的方法，其本质是基因工程，该技术可引发基因突变；由于限制酶能够识别特定序列，并在特定位点进行切割，故限制酶识别序列越长，随机性越小，C错误。利用REMI可实现已知线性质粒插入一个基因的内部，使该基因的表达改变或功能丧失，进而可用于研究该基因的功能，即REMI利用了限制酶的特异性探究某基因的功能，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 12．为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图。据图分析，下列说法错误的是 A．对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同 B．电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关 C．复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D．58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 实验设计应遵循对照原则与单一变量原则， 故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他 成分相同，A正确；PCR技术中，反应最 终的电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状 态的模板DNA(或者模板)含量呈正相关， B错误；PCR扩增时，温度会影响PCR扩增产物的纯度，故复性温度的设定是成败的关键，复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，进而影响PCR扩增产物的纯度，C正确；据图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 13．在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述不正确的是 A．电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的 B．该载体最可能为环状DNA分子 C．限制酶R1与R2的切点最长相距约600 bp D．两种限制酶在载体上识别的序列可能相同 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 根据图示可知，200 bp的DNA分子量小，800 bp的 DNA分子量较大，200 bp的DNA移动速度快，所以 在电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的，A 正确；当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种 长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA 分子，B正确；两种限制酶同时切割时产生600 bp和 200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的切点最长相距约600 bp，C正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种不同长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，二者识别的序列不相同，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 14．(10分)(2024·河南信阳二模)In-Fusion技术 是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在 目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的 DNA序列(即同源序列，通常为15～20bp)，然 后用In-Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段 5′→3′末端16个碱基，并使其降解)处理即可实 现无缝连接。与传统构建重组质粒的方法相比， In-Fusion技术的优势之一是不受限制酶切位点 的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏。它的操作步骤(如图)大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题： 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (1)过程①需要用到的酶是____________ __________________________，质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为_______个。 Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶) 0、2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 过程①是利用两种引物进行的质粒线性 化过程，该过程属于PCR技术的应用， 故需要Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚 合酶)；环状质粒无游离磷酸基团，一条 DNA链含有一个游离的磷酸基团；线性 化DNA是双链，则含有2个游离的磷酸基 团，故质粒线性化前后所含有的游离磷酸 基团的个数分别0和2。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (2)过程③中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的好处是____________ ________________________________________________。 防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化 过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基排序不同，这样设计的好处是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (3)过程④中，用_______处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和___________酶，实现完全环化。 Ca2+　 DNA连接 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 Ca2+能促进细菌摄取外源的DNA，常使 用Ca2+制备感受态细胞，进而转入外源 DNA，故过程④中，用Ca2+处理大肠杆 菌，以便重组质粒导入受体细胞。DNA 连接酶能将DNA片段连接成一个重组 DNA分子，故重组质粒利用大肠杆菌细 胞中的DNA聚合酶和DNA连接酶，实现 完全环化。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (4)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其 转化后的抗性效果。在含____________ 的液体培养基中培养一段时间，然后分 别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进 行计数，计数结果分别是M、N，则致 死率可用___________×100%表示，此 结果较真实值偏大，原因是后一种计数 时________________________________________________________。 氨苄青霉素 (M－N)/M 当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 结合题图，标记基因为氨苄青霉素抗性基 因，故在含氨苄青霉素的液体培养基中培 养一段时间，然后分别用显微镜计数法(死 菌和活菌均被计数)和稀释涂布平板法(用 于活菌计数)进行计数。故若计数结果分别 是M、N，致死率可用(M－N)/M×100%表 示，由于在用稀释涂布平板法计数时，当 两个或多个细胞连在一起时，在平板上观 察到的是一个菌落，会导致N偏小，进而导致此结果较真实值偏大。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 15．(14分)(2024·北京昌平高三期末)病毒侵染植物时，植物识别外源的核酸并启动一系列的调控机制来降解病毒的RNA。研究人员改造病毒载体，使其携带目的基因cDNA后侵染植物，最终特异性降解目的基因mRNA，即病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)，RNA病毒TSWV能侵染辣椒，科研人员推测用VIGS技术沉默TSWV的N基因可使辣椒抵抗TSWV，进行如下实验。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (1)用改造的病毒TRV作为载体，与TSWV的N基因连接，构建重组载体TRV—N(如下图)，通过农杆菌转化法导入辣椒细胞。请完善制备TRV—N的技术路线：获取N基因的mRNA→________→PCR→________→连接成TRV—N。 cDNA N基因 制备TRV—N的技术路线：获取N基因的mRNA→cDNA→PCR→N基因→连接成TRV—N。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (2)C基因是类胡萝卜素合成关键酶的基因，当类胡萝卜素合成途径被阻断，植物出现白化现象。用上述方法构建重组载体TRV—C并导入辣椒细胞，作为构建沉默体系的对照。若辣椒出现白化表型，说明_____________________________________________________。 重组载体TRV—C侵染成功，类胡萝卜素合成途径被阻断 C基因是类胡萝卜素合成关键酶的基因，当类胡萝卜素合成途径被阻断，植物出现白化现象，重组载体TRV—C并导入辣椒细胞，重组载体TRV—C侵染成功，类胡萝卜素合成途径被阻断，辣椒出现白化表型。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (3)TSWV侵染辣椒植株会使其叶片出现明显的褪绿、黄化斑等症状，以易感TSWV的辣椒作为实验材料，实验分组及处理如下表。 注：＋代表添加，—代表不添加。 　组别 实验处理　　　　 第1组 第2组 第3组 导入TRV—C ＋ — — 导入TRV—N — — ＋ ？ — ＋ ＋ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 ①表中“？”的处理为___________。 ②为使实验结果更准确，除设置空白对照组外，还应该增加第4组，其实验处理为____________。 ③观察各组辣椒叶片状态和颜色，若结果为__________________________ ______________________________，则说明沉默TSWV的N基因可使辣椒抵抗TSWV。 不做处理 导入TSWV 第1组白化，第2组正常，第 3组正常，第4组褪绿、黄化斑 ①表中“？”的处理为不做处理，作为空白对照。②为使实验结果更准确，除设置空白对照组外，还应该增加第4组，其实验处理为导入TSWV。③观察各组辣椒叶片状态和颜色，若结果为第1组白化，第2组正常，第3组正常，第4组褪绿、黄化斑，则说明沉默TSWV的N基因可使辣椒抵抗TSWV。 返回 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 谢 谢 观 看 ！ 第 3 章 　 基 因 工 程 $$