第2节 第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定

第2课时　将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 [学习目标]　1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。　2.阐明目的基因的检测与鉴定的方法。　3.明确DNA片段的扩增及电泳鉴定原理，进行相关操作。 知识点一　将目的基因导入受体细胞 1．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2．目的基因导入受体细胞的方法 受体细胞 导入方法 内容 植物 细胞 花粉管通道法 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 ②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 ①农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上 ②目的基因插入Ti质粒的T-DNA中→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表现出新性状的植株 动物细胞 显微注射技术 ①受体细胞：受精卵。 ②过程：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物。 原核细胞 Ca2+处理法　 用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 [精通教材] 1．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞吗？ 提示：不是，为培育抗除草剂的作物新品种，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。 2．为什么经常选用大肠杆菌作为受体细胞？ 提示：大肠杆菌的遗传物质少，且容易培养，繁殖速度快等。 任务　分析农杆菌转化法 下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题： (1)为什么在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上？ 提示：Ti质粒上的T­DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。 (2)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。 学生用书第100页 (3)农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。 提示：能，可从双子叶植物中提取该化学物质，再用该化学物质处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。 [核心归纳] 1．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 (1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上，第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。 (2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌(Ca2+处理法)，第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T­DNA导入受体细胞(农杆菌转化法)。 2．受体细胞的选择 (1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 (2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。 应用1.(2024·新疆乌鲁木齐高二期中)受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是(　　) A．大肠杆菌—Ca2+ B．棉花受精卵细胞—花粉管通道法 C．羊高度分化的体细胞—显微注射法 D．番茄细胞—农杆菌转化法 答案：C 解析：用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，容易吸收外来DNA分子，A正确；当以棉花受精卵为受体细胞时，常用花粉管通道法，B正确；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，常用动物受精卵为受体细胞，C错误；番茄为双子叶植物，番茄细胞可以用农杆菌转化法，D正确。 基因工程植物细胞和动物细胞的受体细胞存在差异 目的基因导入植物细胞时常选用植物的体细胞作为受体细胞，主要是因为植物体细胞具有全能性，且取材方便，而动物的体细胞不易表达全能性，故而对动物细胞来说，常选用全能性最高的受精卵为受体细胞。　　 应用2.下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是(　　) A．图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B．图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 答案：B 解析：图中Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B错误；图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞，C正确；基因的表达具有一定的独立性，剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D正确。 学生用书第101页 知识点二　目的基因的检测与鉴定 1．分子水平上的检测 2．个体生物学水平上的检测 提醒：转录水平的检测与复制水平的检测原理都是分子杂交；翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。 [精通教材] 1．基因表达载体中已经具备标记基因(如抗生素抗性基因)，对受体细胞进行了筛选。为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？ 提示：在含抗生素的选择培养基上能生长的是导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。 2．如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？ 提示：如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验。如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。 任务　分析目的基因的检测与鉴定 1．目的基因已经插入受体细胞的染色体DNA上，为什么还要进行转录和翻译水平的检测？ 提示：插入的目的基因不一定会表达。 2．从目的基因表达的角度上看，目的基因的检测与鉴定主要包括哪些步骤？检测的技术手段分别是什么？ 提示：①检测目的基因是否转录出mRNA：PCR等技术；②检测目的基因是否翻译出特定的蛋白质：抗原—抗体杂交技术。 3．鉴定导入的抗虫基因是否表达，并表现出抗虫性状的最简便的方法是什么？ 提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。 [核心归纳] 1．分子水平上目的基因的检测与鉴定 2．个体水平上检测转基因生物的方法举例 转基因生物 检测方法 观察目标 抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡 抗病植物 病毒(菌)感染 是否出现病斑 抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长 获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能活性是否正常 应用1.(2024·江苏常州高二期中)如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“基因工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。下列说法正确的是(　　) 学生用书第102页 A.将重组质粒导入细菌B常用的方法是农杆菌转化法　 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只是导入了普通质粒的细菌 C．为防止特异性引物的特异性差，PCR获取人生长激素基因设计的特异性引物不宜过长 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞中含有人的生长激素基因 答案：B 解析：将基因表达载体导入细菌B之前，一般要先用Ca2+处理受体细胞，使其处于感受态，而农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法，A错误；由于重组质粒构建过程中抗四环素基因被破坏，所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入普通质粒A的细菌，B正确；PCR引物的设计是获得大量高纯度目的基因的关键，引物中碱基数量越多，则引物的特异性越高，为防止特异性引物的特异性差，PCR获取人生长激素基因设计的特异性引物不宜过短，C错误；基因表达的产物是蛋白质，目的基因成功表达的标志是受体细胞中表达出相应的蛋白质，D错误。 应用2.科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。下列有关分析错误的是(　　) A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若检测到细胞中无Bt抗虫蛋白，则说明抗虫基因不能表达 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则说明抗虫基因能正常转录和翻译 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能正常转录 D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞 答案：B 解析：若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译出蛋白质，B错误。 知识点三　DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．DNA片段的扩增 2．PCR扩增产物的电泳鉴定 (1)实验原理 (2)实验步骤 [精通教材] 1．将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应，程序应该怎样设定？ 提示：变性(94 ℃)→复性(55 ℃)→延伸(72 ℃)循环。 学生用书第103页 2.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行严格灭菌，为什么？ 提示：避免污染使外源性DNA大量扩增，造成假阳性反应。 任务　分析实验原理和操作 1．判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？如果没有成功应该从哪些方面分析？ 提示：一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。 2．如果没有出现扩增条带，可能的原因有哪些？ 提示：(1)Taq DNA聚合酶失活。(2)引物出现质量问题。(3)Mg2+浓度过低。(4)变性时的温度低，变性时间短等。 [核心归纳] 1．操作提示 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 2．关键点拨 (1)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G、C含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 (2)出现非特异性扩增条带的主要原因 ①模板DNA出现污染。 ②引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③Mg2+浓度过高。 ④复性时的温度过低等。 应用1.(2024·重庆璧山高三期中)PCR技术在生物工程中应用广泛，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列叙述正确的是(　　) A．PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活RNA聚合酶 B．PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶，该酶可在复性过程起作用 C．限制酶切割质粒前后，质粒的长度不变，故无法通过电泳检测质粒是否被切开 D．若采用PCR技术对一个双链目的基因进行扩增，则第n代复制共需要引物2n个 答案：D 解析：PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，A错误；PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，B错误；因为质粒被切开后可能成为多个DNA片段，相对分子质量彼此不同，因而可通过电泳检测，C错误；PCR技术大量扩增目的基因时，第n次复制形成2n-1个DNA，合成一个DNA分子需要两个引物，因此需要的引物数目为2n-1×2＝2n，D正确。 应用2.(2024·巴蜀中学高三期末)以洋葱为材料提取DNA后，用PCR技术对目的基因进行扩增，并对扩增产物进行电泳检查。若电泳结果有多个条带，则导致该结果的原因是(　　) A．洋葱研磨离心后，取沉淀进行了纯化 B．所用的引物，也结合了其他DNA序列 C．进行扩增时，变性温度设置成了72 ℃ D．配制琼脂糖溶液时，没有加入核酸染料 答案：B 解析：洋葱研磨离心后，应该取上清液，取沉淀进行纯化，可能提取不到DNA，不会导致电泳结果有多个条带，A错误；若所用的引物，也结合了其他DNA序列，说明引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体，则电泳结果有多个条带，B正确；进行扩增时，变性温度应该为94 ℃，若设置成了72 ℃，DNA双链不会解开，最后扩增不到DNA，电泳结果不会有多个条带，C错误；配制琼脂糖溶液时，若没有加入核酸染料，会导致看不到条带，D错误。 学生用书第104页 思维导图 要语必背 1.转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.将目的基因导入植物细胞的方法有花粉管通道法和农杆菌转化法等。 3.将目的基因导入动物受精卵中最常用显微注射法；导入大肠杆菌需用Ca2+处理。 4.目的基因的检测方法有分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR等技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原—抗体杂交技术。 1．下列关于将目的基因导入受体细胞的方法中，错误的是(　　) A．我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉 B．用Ca2+处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞 C．将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D．利用农杆菌转化法培育大多数单子叶转基因植物 答案：D 解析：目前我国的转基因抗虫棉是利用花粉管通道法培育的，A正确；为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用氯化钙溶液进行处理，使大肠杆菌处于易吸收周围环境中DNA分子的感受态，B正确；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最为有效的一种方法，C正确；农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，D错误。 2．(2024·浙江杭州高二期中)目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定关键步骤的是(　　) A．检测受体细胞是否有目的基因 B．检测受体细胞是否有致病基因 C．检测目的基因是否转录mRNA D．检测目的基因是否翻译蛋白质 答案：D 解析：检测受体细胞中是否有目的基因是鉴定和检测的第一步，但即便受体细胞中存在目的基因，不能说明目的基因一定会稳定遗传并表达，A错误；目的基因不一定是致病基因，B错误；检测目的基因是否转录出mRNA，但能否翻译成相应的所需蛋白质却不一定，所以该步不是最关键的步骤，C错误；检测目的基因是否翻译蛋白质是检测目的基因是否表达的最后步骤，如果存在该蛋白质，说明目的基因能在受体细胞内稳定存在并能表达，D正确。 3．甲醇酵母是基因工程中常用的受体菌，它可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是(　　) A．用两种酶切割目的基因和质粒，可防止目的基因反向连接和质粒的自身环化 B．常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中 C．与大肠杆菌相比，甲醇酵母作受体菌表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近 D．与其他酵母菌相比，甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化 答案：B 解析：用两种酶切割目的基因和质粒，可形成不同的末端，因此，可防止目的基因反向连接和质粒的自身环化，A正确；常用Ca2+处理法将目的基因导入微生物细胞，B错误；与大肠杆菌相比，甲醇酵母为真核生物，表达出的胶原蛋白经过内质网和高尔基体的加工，所以与人体产生的胶原蛋白结构更相近，C正确；与其他酵母菌相比，甲醇酵母可以高效表达外源蛋白，自身蛋白分泌到培养基的较少，便于目的蛋白的分离和纯化，D正确。 4．(2024·山西太原一模)人血白蛋白在临床上被广泛应用。我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，其流程如下图所示。下列叙述正确的是(　　) 学生用书第105页 A．PCR扩增时需要DNA模板、引物、耐高温的RNA聚合酶等条件 B．过程①需用农杆菌转化法将人血白蛋白基因直接导入水稻胚乳细胞中 C．过程①需将目的基因与胚乳中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组 D．过程②改变生长素和细胞分裂素的浓度及比例不影响细胞的脱分化过程 答案：C 解析：PCR扩增时需要DNA模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、脱氧核苷酸等条件，A错误；将目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等，过程①可用农杆菌转化法将含有人血白蛋白基因的基因表达载体导入水稻细胞中，通过植物组织培养获得转基因水稻，所以受体细胞并不是水稻胚乳细胞，B错误；我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，过程①在构建基因表达载体时，需将目的基因与胚乳中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组，从而使目的基因在水稻的胚乳细胞中特异性表达，C正确；过程②进行植物组织培养，主要包括脱分化和再分化过程，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，改变它们的浓度及比例对脱分化和再分化过程均有影响，D错误。 5．(2023·辽宁卷)基质金属蛋白酶MMP2和MMP9是癌细胞转移的关键酶。MMP2和MMP9可以降解明胶，明胶可被某染液染成蓝色，因此可以利用含有明胶的凝胶电泳检测这两种酶在不同条件下的活性。据下图分析，下列叙述正确的是(不定项)(　　) A．SDS可以提高MMP2和MMP9活性 B．10 ℃保温降低了MMP2和MMP9活性 C．缓冲液用于维持MMP2和MMP9活性 D．MMP2和MMP9降解明胶不具有专一性 答案：BC 解析：37 ℃保温、加SDS、加缓冲液组比37 ℃保温、不加SDS、加缓冲液那组的MMP2和MMP9条带周围的透明带面积小，说明明胶被降解得更少，故MMP2和MMP9活性更低，因此，SDS可降低MMP2和MMP9活性，A错误；与37 ℃(不加SDS)相比，10 ℃(不加SDS)，MMP2和MMP9条带周围的透明带面积更小，说明明胶被降解的更少，故MMP2和MMP9活性更低，因此，10 ℃保温降低了MMP2和MMP9活性，B正确；缓冲液可以维持pH条件的稳定，从而维持MMP2和MMP9活性，C正确；MMP2和MMP9都属于酶，酶具有专一性，D错误。 6．(创新情境)B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如图实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。 注：启动子是指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。 回答下列问题： (1)启动子是　　　　　　　　酶识别并结合的部位。题中的基因表达载体除了启动子外，还必须有　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。 (2)为筛选出导入重组质粒的农杆菌，培养基除了添加农杆菌生长繁殖必需的成分和琼脂外，还要添加　　　　　　　　(答出两点即可)。 (3)②过程利用了农杆菌能侵染水稻愈伤组织并且将Ti质粒上的　　　　转移至水稻愈伤组织细胞，并整合到水稻细胞染色体DNA上，这种方法称为　　　　　　　　。除此之外，还可用　　　　　　　法把目的基因导入植物受体细胞中。 (4)鉴定和筛选表达B基因的转基因植株的方法是 ________________________________________________________________________。 答案：(1)RNA聚合　目的基因、标记基因、终止子等　(2)潮霉素和卡那霉素　(3)T­DNA　农杆菌转化法　花粉管通道　(4)检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光 解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。题干中的基因表达载体除了启动子外，还必须有目的基因、标记基因、终止子等。(2)潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为标记基因，转化成功的农杆菌因含有上述两种抗性基因，可在含有潮霉素和卡那霉素的培养基中存活，否则不存活。(3)②过程利用了农杆菌能感染水稻愈伤组织并且将Ti质粒上的T­DNA转移至水稻愈伤组织，并整合到水稻细胞染色体上，这种方法称为农杆菌转化法。除此之外，还可用花粉管通道法把目的基因导入植物受体细胞中。(4)由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光。 学科网（北京）股份有限公司 $$