3.2 基因工程的基本操作程序-【帮课堂】2024-2025学年高二生物同步学与练（人教版2019选择性必修3）

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 学习目标 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.针对人类生产或生活的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。 3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 学习重点：基因工程基本操作程序的四个步骤，DNA片段的扩增及电泳鉴定。 学习难点：利用PCR获取和扩增目的基因。 基因组文库 cDNA文库 文库的构建 某种生物全部DNA ↓限制酶 许多DNA片段 分别与载体↓连接导入 受体菌群体 某种生物发育某个时期的mRNA ↓逆转录 cDNA片段 分别与载体↓连接导入 受体菌群体 文库大小 大 小 启动子 有 无 内含子 有 无 基因数目 某种生物的全部基因 某种生物的部分基因 物种之间的基因交流 部分基因可以 可以 1.基因工程的设计和操作中用于改变受体细胞 的基因称为目的基因。目的基因主要是指 的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物讲解和工业用酶等相关的基因。也可以是一些具有 的因子。 2.筛选合适的目的基因的方法有：从相关的已知 的基因中进行筛选，从 中获取，利用 。 3.比较基因组文库和cDNA文库 基因组文库 cDNA文库 文库的构建 文库大小 启动子 内含子 基因数目 物种之间的基因交流 4.PCR的条件 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 其他条件 5.PCR的过程。下图是PCR过程示意图，写出图中数字的含义。 6.引物：引物是一小段能与DNA母链的 的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的 。引物的作用：由于DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能，引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从 端延伸子链。 7.一个DNA，一对引物（A与B），复制n次的PCR结果 ①子代DNA分子等长的DNA分子数为 个 ②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为 个 ③子代DNA分子中不等长链DNA分子数为 个 ④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为 个 ⑤复制过程中共需引物 个 ⑥第n次复制需要引物 个 ⑦PCR技术获取目的基因时至少要经过 次循环才能从DNA分子中分离出目的基因 8.基因表达载体在组成上含有目的基因、 、标记基因、复制原点等。 表达载体构建的过程 ① 用一定的 切割载体，使其出现一个切口。 ② 用 或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③ 将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量 ，形成了一个重组DNA分子。 9.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接：选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 10.若目的基因片段两端不存在和质粒相同的限制酶酶切位点，应在引物的 端设计载体上存在的酶切位点 11.将目的基因导入受体细胞 植物细胞： 、基因枪法、花粉管通道法（受体细胞： ） 动物细胞： （受体细胞：受精卵、早期胚胎细胞） 微生物细胞： （用 处理受体细胞） 12.目的基因的检测与鉴定 （1）分子水平 ① -检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA ② -检测目的基因是否转录 ③ -检测目的基因是否翻译 （2）个体水平：检测个体是否出现相应 。 1.在PCR过程中实际加入的原料是什么？作用是什么？ 2.在PCR过程中，引物是什么？引物的作用是什么？ 3.在PCR过程中，复性温度过高的结果可能是什么？ 4.PCR反应缓冲溶液中为什么要添加Mg2＋？ 5.农杆菌转化法中，有两次拼接，两次导入，其含义分别是什么？ 6.导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因可能导致的危害是什么？ 1．CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ）    A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 2．盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（    ）    A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的 B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害 C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力 D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径 3．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 4. 关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 探究一 限制酶的切割过程 1.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题： （1）请写出同时用EcoRⅠ切割含目的基因的DNA的过程。 （2）请写出同时用BamH和 HindⅢ切割质粒的过程用限制酶切割时需注意的事项。 探究二 PCR扩增DNA片段时加入两种引物的原因 2.PCR扩增时，延伸时需要加入两种引物，原因是什么？对两种引物的要求有哪些？ 探究三 基因表达载体的组成及作用 3.下图是基因表达载体示意图，回答下面的问题。 作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？ 探究四 重组DNA的选择与鉴定 4.目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示： (1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于______________________________。观察上图，如果A为质粒，则C表示 。 (2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。 (3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过____________作用恢复________________________键，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是 。 (4) 作为受体大肠杆菌应不含________________，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。 · 基础过关练 1.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 2.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 3.科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV－16L1蛋白基因，构建了含HPV－16L1蛋白基因的表达载体pBI－L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV－16L1蛋白。下列说法错误的是(　　) A.构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止目的基因与质粒反向连接 B.采用根瘤农杆菌介导转化时可对烟草组织进行切割，以便于农杆菌入侵植物组织 C.为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加赤霉素 D.可以用抗原－抗体杂交法检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白 4.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　) A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 5.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是(　　) A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法 D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 · 能力提升练 6. 大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（ ） A. DNA溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA B. 电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理 C. 根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 7. 科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析错误的是（ ） A. 对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成 B. 生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列 C. 可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2 D. 构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcoRI、BamHI和Eco52 I 8.原因是节律调控有关基因PER2发生突变，利用PCR 技术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（ ） A. 研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案 B. PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步 C. DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 D. 一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物 9. 基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（ ） A. 应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内 B. 可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物 C. 目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则 D. 转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状 10. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓CATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（ ） A. 质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割 C. 目的基因和质粒均用限制酶I切割 D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 11. 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（ ） A. PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B. 电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关 C. 选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D. 选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接 12. 巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是（ ） A. 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B. 第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定 C. 由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D. 如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 13. 不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（ ） A. 限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计 B. 据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同 C. 上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸 D. 该不对称PCR过程中需要（26-1）a个限制性引物 14.同尾酶是指切割不同的DNA片段后能产生相同黏性末端的一类限制酶，下列四种限制酶中属于同尾酶的是（    ） A．①③ B．②④ C．①③和②④ D．①④ 15.“筛选”是生物技术与工程中常用的技术手段。下列相关叙述正确的是（　　） A．诱导植物原生质体融合时，通过染色体数目即可筛选异种融合细胞 B．制备单克隆抗体时，可利用选择培养基筛选出能产所需抗体的杂交瘤细胞 C．培育耐盐植株时，必须在获得试管苗后才可用盐水浇灌进行筛选 D．制备工程菌时，可通过标记基因对成功转化的受体细胞进行筛选 思维拓展练 16.重组PCR技术是一项新的PCR技术，可将原来两个不相关的DNA连接起来，组成一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-STl融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题：    (1)PCR实验中，为防止外源DNA等因素的污染，使用的微量离心管、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行 。PCR过程中，子链延伸需要在 进行，在 的催化作用下，该酶需要被 （填离子）激活后才能发挥作用。 (2)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列 （填“能”或“不能”）互补；引物P2与引物P3的碱基序列 （填“能”或“不能”）部分互补，原因是 。 (3)DNA子链是从5′端向3′端延伸。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到用于杂交的目的链L、S，则第2次循环的目的是 。 (4)杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中， （填“需要”或“不需要”）加入引物。在图中标出杂交链两条母链的3′端和5′端，    17.为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：    (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 (2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。    (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 18.科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 19. 在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量的有害物质H2O2，PIP2s为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输。我国的科研团队首次发现了植物细胞中AT1基因编码的AT1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理如图一所示。图二表示通过“PCR替换个别核苷酸获得突变基因”的定点突变技术，且个别核苷酸差异不影响引物与模板链的结合。回答下列问题： （1）盐碱环境可引起大多数作物细胞内液渗透压_______，吸水能力_______。图一中植物细胞中AT1基因编码的AT1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理为______。 （2）通过PCR替换个别核苷酸诱导AT1基因突变时，引物_______中含有特定的突变，为防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对_____、______用于合成PCR产物1和PCR产物2；然后将PCR产物1和2加入无引物的PCR反应体系得到含有点突变的目的基因。再用引物对________扩增目的基因，得到大量的点突变目的基因。 （3）为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，对引物1和引物4的要求是_____。 （4）若将点突变目基因导入棉花细胞，我国科学家自己独创的方法是______。要检测是否成功表达，可以从转基因生物个体中提取蛋白质，用相应的抗体进行_______杂交。 20.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题： 甲 乙 (1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。 (2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________。 为将改良基因构建在质粒上，还需要________等酶。 (3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述元件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是____________________________________________________________________________________________________________________________________。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司1 / 17 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 学习目标 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.针对人类生产或生活的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。 3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 学习重点：基因工程基本操作程序的四个步骤，DNA片段的扩增及电泳鉴定。 学习难点：利用PCR获取和扩增目的基因。 基因组文库 cDNA文库 文库的构建 某种生物全部DNA ↓限制酶 许多DNA片段 分别与载体↓连接导入 受体菌群体 某种生物发育某个时期的mRNA ↓逆转录 cDNA片段 分别与载体↓连接导入 受体菌群体 文库大小 大 小 启动子 有 无 内含子 有 无 基因数目 某种生物的全部基因 某种生物的部分基因 物种之间的基因交流 部分基因可以 可以 1.基因工程的设计和操作中用于改变受体细胞 的基因称为目的基因。目的基因主要是指 的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物讲解和工业用酶等相关的基因。也可以是一些具有 的因子。 2.筛选合适的目的基因的方法有：从相关的已知 的基因中进行筛选，从 中获取，利用 。 3.比较基因组文库和cDNA文库 基因组文库 cDNA文库 文库的构建 文库大小 启动子 内含子 基因数目 物种之间的基因交流 4.PCR的条件 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 其他条件 5.PCR的过程。下图是PCR过程示意图，写出图中数字的含义。 6.引物：引物是一小段能与DNA母链的 的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的 。引物的作用：由于DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能，引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从 端延伸子链。 7.一个DNA，一对引物（A与B），复制n次的PCR结果 ①子代DNA分子等长的DNA分子数为 个 ②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为 个 ③子代DNA分子中不等长链DNA分子数为 个 ④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为 个 ⑤复制过程中共需引物 个 ⑥第n次复制需要引物 个 ⑦PCR技术获取目的基因时至少要经过 次循环才能从DNA分子中分离出目的基因 8.基因表达载体在组成上含有目的基因、 、标记基因、复制原点等。 表达载体构建的过程 ① 用一定的 切割载体，使其出现一个切口。 ② 用 或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③ 将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量 ，形成了一个重组DNA分子。 9.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接：选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 10.若目的基因片段两端不存在和质粒相同的限制酶酶切位点，应在引物的 端设计载体上存在的酶切位点 11.将目的基因导入受体细胞 植物细胞： 、基因枪法、花粉管通道法（受体细胞： ） 动物细胞： （受体细胞：受精卵、早期胚胎细胞） 微生物细胞： （用 处理受体细胞） 12.目的基因的检测与鉴定 （1）分子水平 ① -检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA ② -检测目的基因是否转录 ③ -检测目的基因是否翻译 （2）个体水平：检测个体是否出现相应 。 【答案】1.性状或获得预期表达产物 编码蛋白质 调控作用 2.结构和功能清晰 基因库 PCR技术扩增 3. 基因组文库 cDNA文库 文库的构建 某种生物全部DNA ↓限制酶 许多DNA片段 分别与载体↓连接导入 受体菌群体 某种生物发育某个时期的mRNA ↓逆转录 cDNA片段 分别与载体↓连接导入 受体菌群体 文库大小 大 小 启动子 有 无 内含子 有 无 基因数目 某种生物的全部基因 某种生物的部分基因 物种之间的基因交流 部分基因可以 可以 4. 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 解旋酶 打开DNA双链 无需解旋酶,用高温代替 DNA母链 提供DNA复制的模板 DNA(目的基因)模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 4种脱氧核苷酸(dNTP) DNA聚合酶 催化合成DNA子链 耐高温的DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 使DNA聚合酶从引物3/端开始连接脱氧核苷酸 引物（通常为小的单链DNA） 其他条件 如缓冲液（一般添加Mg2+）和控温设备 5.①引物 ②耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） ③脱氧核苷酸（dNTP） ④变性 ⑤复性 ⑥延伸 6.一段碱基序列互补配对 单链DNA 3′ 7.2n－2n 2 2n 2n－1 2n+1－2 2n 3 8.启动子、终止子 9.①限制酶 ②同种限制酶 ③DNA连接酶 10.5’ 11. 农杆菌转化法 体细胞或受精卵 显微注射法 感受态细胞法 Ca2+ 12.（1）①DNA分子杂交 ②核酸分子杂交 ③抗原-抗体杂交 （2）表现型 1.在PCR过程中实际加入的原料是什么？作用是什么？ 在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 2.在PCR过程中，引物是什么？引物的作用是什么？ 在PCR过程中，引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 3.在PCR过程中，复性温度过高的结果可能是什么？ 在PCR过程中，复性温度过高的结果可能是引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。 4.PCR反应缓冲溶液中为什么要添加Mg2＋？ 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。 5.农杆菌转化法中，有两次拼接，两次导入，其含义分别是什么？ 两次拼接的第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入的第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T­DNA导入受体细胞。 6.导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因可能导致的危害是什么？ 有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 1．CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ）    A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 【解析】B 为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。 2．盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（    ）    A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的 B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害 C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力 D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径 【解析】B 由题图右侧的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，A正确；据题图左侧的信息可知，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B错误；结合对A选项的分析可推测，敲除AT1基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，C正确；从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D正确。 3．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 【解析】D 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 4. 关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【解析】A 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 探究一 限制酶的切割过程 1.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题： （1）请写出同时用EcoRⅠ切割含目的基因的DNA的过程。 （2）请写出同时用BamH和 HindⅢ切割质粒的过程用限制酶切割时需注意的事项。 （1） （2）用限制酶切割时需注意的事项 获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了产生相同的黏性末端，便于连接。但是使用该法缺点是容易发生目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接，为了避免上述情况发生，可采取的措施是分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体。 探究二 PCR扩增DNA片段时加入两种引物的原因 2.PCR扩增时，延伸时需要加入两种引物，原因是什么？对两种引物的要求有哪些？ DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 PCR技术中对两种引物的要求有：引物自身不能环化，两种引物之间不能互补配对，引物长度不宜过短，防止引物随机结合。 探究三 基因表达载体的组成及作用 3.下图是基因表达载体示意图，回答下面的问题。 作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 理由是：生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等。 探究四 重组DNA的选择与鉴定 4.目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示： (1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于______________________________。观察上图，如果A为质粒，则C表示 。 (2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。 (3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过____________作用恢复________________________键，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是 。 (4) 作为受体大肠杆菌应不含________________，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。 答案：供重组DNA的鉴定和选择 重组质粒 DNA连接酶 磷酸二酯键 两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同 ampR和tetR（或氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因） 能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322 质粒 · 基础过关练 1.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 【解析】D　PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。 2.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 【解析】A　构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。 3.科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV－16L1蛋白基因，构建了含HPV－16L1蛋白基因的表达载体pBI－L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV－16L1蛋白。下列说法错误的是(　　) A.构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止目的基因与质粒反向连接 B.采用根瘤农杆菌介导转化时可对烟草组织进行切割，以便于农杆菌入侵植物组织 C.为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加赤霉素 D.可以用抗原－抗体杂交法检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白 【解析】C　构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止质粒的自身环化和目的基因与质粒反向连接，A正确；对烟草组织进行切割，以便农杆菌细胞内的Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的烟草组织细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上，B正确；为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加生长素，C错误；经培养可获得新性状的再生植株，检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白，可以用抗原－抗体杂交法，D正确。 4.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　) A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 【解析】A　⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D错误。 5.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是(　　) A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法 D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 【解析】D　通过PCR获取目的基因时，两种引物分别和目的基因的两条单链结合，并沿相反的方向合成子链，故选用引物甲和引物丙，A正确；由甲图可知，选用BamHⅠ会破坏两种抗性基因，结合乙图可确定应选择BclⅠ和HindⅢ剪切，B正确；将目的基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋转化法，C正确；构建重组质粒时目的基因插入氨苄青霉素抗性基因中，故氨苄青霉素抗性基因被破坏不能表达，D错误。 · 能力提升练 6. 大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（ ） A. DNA溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA B. 电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理 C. 根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 【解析】D DNA不溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA，A错误；DNA带负电，DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，B错误；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，C错误；用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒时，电泳结果中的这些条带通常需要在紫外线下观察和照射才能显示出来，因此需要紫外灯照射，D正确。 7. 科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析错误的是（ ） A. 对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成 B. 生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列 C. 可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2 D. 构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcoRI、BamHI和Eco52 I 【解析】D 对蛋白质结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成，A正确；α—淀粉酶（AmyS1）的化学本质是蛋白质，蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核糖核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，正确；将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C，可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2，C正确；若用BamH I酶进行切割，会导致目的基因结构破坏，因此选择Nde I和EcoR I，既不会破坏目的基因，也能防止目的基因片段反向连接与质粒自身环化等问题；根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是Mlu I和Eco 52Ⅰ，D错误。 8.原因是节律调控有关基因PER2发生突变，利用PCR 技术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（ ） A. 研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案 B. PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步 C. DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 D. 一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物 【解析】C 题意显示，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，因此研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案，A正确；PCR 反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，B正确；DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误；一般采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，D正确。 9. 基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（ ） A. 应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内 B. 可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物 C. 目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则 D. 转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状 【解析】C 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内，A正确；若在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物，则可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物，B正确；目的基因的黏性末端与质粒的黏性末端依赖碱基互补配对原则连接在一起，C错误；转基因是否成功，最简便的方法是从个体水平上观察该植物有没有抗虫性状，D正确。 10. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓CATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（ ） A. 质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割 C. 目的基因和质粒均用限制酶I切割 D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 【解析】A 限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，可知限制酶Ⅱ能够识别和切割限制酶Ⅰ的识别序列，目的基因的右端限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，目的基因左端是限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，只有用限制酶Ⅱ才能同时将目的基因切割下来；质粒有GeneI和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶I的识别序列和限制酶Ⅱ的识别序列，如果用限制酶Ⅱ切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因，用限制酶Ⅰ切割，则破坏GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA，A正确，BCD错误。 11. 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（ ） A. PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B. 电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关 C. 选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D. 选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接 【解析】C 退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误；选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100bp的片段，D正确。 12. 巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是（ ） A. 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B. 第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定 C. 由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D. 如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 【解析】D 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确；第二轮PCR使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 ，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。 13. 不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（ ） A. 限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计 B. 据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同 C. 上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸 D. 该不对称PCR过程中需要（26-1）a个限制性引物 【解析】C PCR扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计，A正确；当限制性引物的浓度降低，甚至基本耗尽，双链 DNA 的合成速率显著下降，此时非限制性引物将继续引导单链 DNA 的合成，非限制性引物是与乙链结合，故反应的最后阶段只产生初始 DNA 中一条链的拷贝（非限制性引物引导合成的单链），最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，B正确；扩增时耐高温DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3'端，C错误；PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要（26-1）a个限制性引物，D正确。 14.同尾酶是指切割不同的DNA片段后能产生相同黏性末端的一类限制酶，下列四种限制酶中属于同尾酶的是（    ） A．①③ B．②④ C．①③和②④ D．①④ 【解析】A 同尾酶是指切割不同的DNA片段后能产生相同黏性末端的一类限制酶，平末端不属于黏性末端，故②④不属于同尾酶。限制酶切割后，①产生的黏性末端为CATG，③产生的黏性末端为CATG，因此①③产生的黏性末端都为CATG的相同黏性末端，符合同尾酶的定义，A正确,BCD错误。 15.“筛选”是生物技术与工程中常用的技术手段。下列相关叙述正确的是（　　） A．诱导植物原生质体融合时，通过染色体数目即可筛选异种融合细胞 B．制备单克隆抗体时，可利用选择培养基筛选出能产所需抗体的杂交瘤细胞 C．培育耐盐植株时，必须在获得试管苗后才可用盐水浇灌进行筛选 D．制备工程菌时，可通过标记基因对成功转化的受体细胞进行筛选 【解析】D 诱导植物原生质体融合时，通过染色体数目不能筛选异种融合细胞，因为融合的异种融合细胞和融合的同种融合细胞染色体数目可能相同，A错误；制备单克隆抗体时，可利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，用抗原筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞，B错误； 培育耐盐植株时，可以用含一定浓度钠盐的培养基培养愈伤组织，C错误；标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，制备工程菌时，可通过标记基因对成功转化的受体细胞进行筛选，D正确。 思维拓展练 16.重组PCR技术是一项新的PCR技术，可将原来两个不相关的DNA连接起来，组成一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-STl融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题：    (1)PCR实验中，为防止外源DNA等因素的污染，使用的微量离心管、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行 。PCR过程中，子链延伸需要在 进行，在 的催化作用下，该酶需要被 （填离子）激活后才能发挥作用。 (2)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列 （填“能”或“不能”）互补；引物P2与引物P3的碱基序列 （填“能”或“不能”）部分互补，原因是 。 (3)DNA子链是从5′端向3′端延伸。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到用于杂交的目的链L、S，则第2次循环的目的是 。 (4)杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中， （填“需要”或“不需要”）加入引物。在图中标出杂交链两条母链的3′端和5′端，    【解析】（1）PCR实验中，使用的微量离心管、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，以防外源DNA等的污染；在PCR过程中，子链延伸时温度需上升到72℃在高温条件下在DNA聚合酶的催化下进行，且该耐高温的DNA聚合酶需要被Mg2+激活后发挥作用。 （2）为防止引物的碱基配对影响扩增结果，引物P1与引物P2的碱基序列不能互补。LTB基因和ST1基因能融合的关键是引物P2和引物P3部分碱基能互补配对，从而将两个基因融合在一起。 （3）扩增LTB基因时，第一次循环使用引物P2，得到的子链是。DNA子链是从5＇端向3＇端延伸的，为了使杂交链引物P2的碱基末端提供3＇端，需要第二次循环，该次循环使用引物P1，得到的子链为，ST1基因的扩增过程类似。 （4）杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端，杂交链两条母链的3′端和5′端标注如图。 【答案】(1) 高压灭菌 耐高温 DNA聚合酶 Mg2+ (2) 不能 能 使LTB基因与ST1基因的单链融合在一起 (3)为杂交链延伸子链起始部位提供3＇端 (4) 不需要 17.为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：    (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 (2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。    (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 【解析】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。 （2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 引物 (2)CD (3)限制性核酸内切酶（限制酶） (4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 18.科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【解析】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 （2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 19. 在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量的有害物质H2O2，PIP2s为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输。我国的科研团队首次发现了植物细胞中AT1基因编码的AT1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理如图一所示。图二表示通过“PCR替换个别核苷酸获得突变基因”的定点突变技术，且个别核苷酸差异不影响引物与模板链的结合。回答下列问题： （1）盐碱环境可引起大多数作物细胞内液渗透压_______，吸水能力_______。图一中植物细胞中AT1基因编码的AT1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理为______。 （2）通过PCR替换个别核苷酸诱导AT1基因突变时，引物_______中含有特定的突变，为防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对_____、______用于合成PCR产物1和PCR产物2；然后将PCR产物1和2加入无引物的PCR反应体系得到含有点突变的目的基因。再用引物对________扩增目的基因，得到大量的点突变目的基因。 （3）为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，对引物1和引物4的要求是_____。 （4）若将点突变目基因导入棉花细胞，我国科学家自己独创的方法是______。要检测是否成功表达，可以从转基因生物个体中提取蛋白质，用相应的抗体进行_______杂交。 【解析】 （1）盐碱环境可引起大多数作物细胞内液渗透压上升，吸水能力增强，图一中植物细胞中PIP2s是水通道蛋白的一种，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，抑制H2O2外排，导致细胞抗氧化胁迫减弱，最终死亡。 （2）据图二可知，引物2和引物3中含有特定的突变，由PCR产物1和PCR产物2的位置分析可知，为了防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对为1和2、3和4，要扩增发生突变的目的基因，需要用能与目的基因两侧发生碱基互补配对的引物，即引物1和4。 （3）因为目的基因两侧没有某种限制酶的酶切位点，所以为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，应该在引物1和4均带上该限制酶识别序列。 （4）若将目的基因导入棉花细胞的方法很多，其中花粉管通道法是我国科学家自己独创的。要检测目的基因是否成功表达，即检测相关蛋白质是否合成，需要从转基因生物个体中提取蛋白质，可通过抗原-抗体杂交方法检测目的基因是否表达成功。 【答案】（1） ①. 上升 ②. 增强 ③. PIP2s是一种水通道蛋白，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，抑制H2O2外排 （2） ①. 2和3 ②. 1和2 ③. 3和4 ④. 1和4物种多样性减少，群落优势度增大 （3）均带有该限制酶识别序列 （4） ①. 花粉管通道法 ②. 抗原—抗体 20.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题： 甲 乙 (1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。 (2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________________________________________ ___________________________________________________________________。 为将改良基因构建在质粒上，还需要________等酶。 (3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述元件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是 __________________________________________________________________ __________________________________________________________________。 【解析】(1)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到一个不含突变位点的DNA，一个有一条链含有突变位点的DNA，进行第二轮循环，即可得到三个不含突变位点的DNA和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物；从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。(2)限制酶XmaⅠ切割后产生与改良基因相同的黏性末端，限制酶SmaⅠ切出的是平末端，无法与改良基因准确连接。由酶切位点分析，除使用XmaⅠ外，还需使用BglⅡ切出另一个切口产生一个新的黏性末端与改良基因CTAG一侧进行配对。(3)因LacZ基因编码的酶能分解β－半乳糖苷，产生蓝色物质，所以应加入β－半乳糖苷进行检测质粒上是否含有改良基因；白色菌落含有重组质粒，原因是重组质粒的LacZ基因在重组过程中被切断，不能编码相应的酶分解β－半乳糖苷。 【答案】　(1)2　②　(2)SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接　BglⅡ、DNA连接酶　(3)β－半乳糖苷　构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β－半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北 1 / 26 学科网（北京）股份有限公司 $$