2025届高三生物一轮复习课件第61讲基因工程基本工具和基本操作程序

第61课时 基因工程的基本工具和基本操作程序 1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展起来的。 2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。 3.阐明基因工程的基本操作程序。 课标要求 考情分析 1.基因工程的基本工具 2023·新课标·T6　2021·全国乙·T38　2021·湖北·T7、2024·湖南·T5、2024·江西·T12 2.基因工程的基本操作程序 2023·全国乙·T38　2023·全国甲·T38　2023·湖北·T4　2023·广东·T20、2021·广东·T22、2024·甘肃·T21、2024·贵州·T21、 (1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间 。 (2)DNA双螺旋结构的提出和 的证明。 (3)中心法则的确立。 (4) 的破译。 转移 半保留复制 遗传密码 (5)基因转移载体的发现。 的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 (6) 体外重组的实现。 (7)重组DNA表达实验的成功。 (8)DNA测序和合成技术的发明。 (9) 技术的发明。 (10) 技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 限制酶、DNA连接酶和逆转录酶 DNA PCR 基因组编辑 基因工程的诞生和发展 基因工程诞生的理论基础 拼接的基础 1. DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） 表达的基础 2. 都遵循碱基互补配对原则 3. DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 1. 基因是控制生物性状的结构与功能单位 2. 遗传信息的传递都遵循中心法则 基因在空间上转移并成功表达 3. 生物界共用一套遗传密码。（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。 DNA（基因） 转录 翻译 mRNA 蛋白质 基因工程的诞生和发展 基础检测 1. 基因工程的概念 是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 2. 基因工程的基本工具 限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶、基因导入受体细胞的载体 3. 基因工程的基本操作程序 DNA分子 转基因 遗传特性 生物类型 基因重组 考点一 基因工程的基本工具 1.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 C 考点一 基因工程的基本工具 必备知识：1.限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)——“分子手术刀” ① 来源： 主要是原核生物 ④ 作用特点：（专一性） 能够识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ② 化学本质： 蛋白质 ③ 种类： 数千种 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 考点一 基因工程的基本工具 ⑤.限制酶的识别序列 大多数限制酶的识别序列由 , 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 中轴线 限制酶所识别的序列，呈现碱基互补对称。无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。 想一想限制酶所识别的序列有什么特点？ 6个核苷酸 思考：用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为 4000 Sma I 限制酶只能识别 序列，切割 和 之间的 切开，切割后产生 。 A G T C A T T C G A T A G G A T C A T C A T A T 大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ 限制酶能特异性识别_________序列，并切割___和___之间的____________，切割后产生__________。 GAATTC G A 磷酸二酯键 黏性末端 Eco RI 限制酶 Sma I 限制酶 CCCGGG C G 磷酸二酯键 平末端 C C C G G G G G G C C C G G G C C C C C C G G G 限制酶 限制酶 ⑥. 限制酶的切割的结果 考点一 基因工程的基本工具 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端 必备知识：2. DNA连接酶——“分子缝合针” 考点一 基因工程的基本工具 2.(2024·长沙高三调研)基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是 A.限制酶Sma Ⅰ和EcoR V切 割形成的末端，可以通过 E.coli DNA连接酶相互连接 B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C.限制酶EcoR Ⅰ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端 D.若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接 B 考点一 基因工程的基本工具 课时练1 考点一 基因工程的基本工具 归纳提升 与DNA有关的几种酶的比较 考点一 基因工程的基本工具 3.(不定项)(2024·滨州高三模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述不正确的是 A.目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA B.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞 C.Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构 D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上 ABC 必备知识：3.基因导入受体细胞的载体——“分子运输车” 环状双链DNA分子 噬菌体 有一个至多个 自我复制 受体DNA 标记 考点一 基因工程的基本工具 知识扩展 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 标记基因的筛选原理 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） 考点一 基因工程的基本工具 能力提升 将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制 酶识别序列和切割位点以及质粒上的限 制酶切割位点。请思考以下问题： (1)请用图示法写出限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割后形成黏性末端的过程。 提示　限制酶EcoR Ⅰ： 限制酶Nhe Ⅰ： (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。 提示　用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒，应选用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。 “同尾酶” 同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶 考点一 基因工程的基本工具 总结提升 限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因， 所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因和载体环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 1.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 B 刷真题、明考向   A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 A 2.（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA．构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ） 刷真题、明考向 4、[2022·全国乙卷]新型冠状病毒感染疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。 (1)新型冠状病毒是一种RNA病毒,检测新型冠状病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是 　　　　　　,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新型冠状病毒。 (2)为了确保新型冠状病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新型冠状病毒RNA中的 　　　　　　　 　来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是 　　　。 逆转录酶 特异性核苷酸序列 复性 考点二 基因工程的基本操作程序 必备知识：1、目的基因的筛选和获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。（辨析：目的基因一定是编码蛋白质的基因（ ） (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用 和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取： 表达产物 结构和功能清晰 序列数据库 性状 ①人工合成目的基因、②PCR获取和扩增目的基因 ③通过构建基因文库来获取目的基因 X 5、农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环,并以此环为模板进行PCR,扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列,以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列相关叙述错误的是( 　) A.PCR技术依据的原理是DNA半保留复制 B.PCR技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 C.选择图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列 D.通过与受体细胞的基因组序列比对来确定插入位置 B 必备知识：PCR a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。 b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种_____ 、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。 DNA半保留复制 组分 大量复制 缓冲溶液（含Mg2+) 引物 脱氧 核苷酸 耐高温的 温度 考点二 基因工程的基本操作程序 提示　不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。 考点二 基因工程的基本操作程序 c.PCR扩增的过程 d、PCR产物鉴定： 90 50 引物 72 耐高温的DNA聚合酶 单链 什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？引物的作用是什么？ 概念：引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 原因：在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。 作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 思考：筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？ 思考：引物结合在模板链的什么位置？ 引物1 3’ 5’ 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 3’ 5’ 琼脂糖凝胶电泳 拓展：PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？ 考点二 基因工程的基本操作程序 提示　经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2n－2n)个。 6．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ）   A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 B 考点二 基因工程的基本操作程序 2.基因表达载体的构建—核心 (1)构建基因表达载体的目的 ①使目的基因在受体细胞中　　　　　, 并且　　 给下一代。 ②使目的基因能够　　　　　　　　。 (2)基因表达载体的组成 稳定存在 表达和发挥作用 遗传 必备知识： (3)基因表达载体的构建过程 启动子 标记基因 [提醒]启动子、 起始密码子、终止子、终止密码子的区别 考点二 基因工程的基本操作程序 7、 [2023·山东东营模拟] 科研团队利用农杆菌转化法将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中,使它呈现出自然界没有的颜色变异。以下说法正确的是( 　) A.在自然条件下,农杆菌能侵染单子叶植物和裸子植物,而对大多数双子叶植物没有侵染能力 B.当农杆菌感染植物时,Ti质粒会进入受体细胞的染色体上 C.利用农杆菌介导的矮牵牛转基因技术有两次转化,第一次是将含目的基因的重组Ti质粒导入Mg2+处理的农杆菌中 D.检测转基因矮牵牛是否培育成功的第一步可以采用PCR等技术 D 必备知识：3、将目的基因导入受体细胞 (1)将目的基因导入植物细胞 ①花粉管通道法——我国独创 a.用微量注射器将含　　　　　　　　　　直接注入　　 中; b.在植物　　　后一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴在　　　　　,使目的基因通过　　　　　　进入胚囊。 ②农杆菌转化法 转化:指目的基因进入受体细胞内,并在受体细胞内　　　　　　　 的过程。 a.农杆菌特点:能在自然条件下侵染　　　　　　　　 　　,而对大多数　 　　　没有侵染能力。 目的基因的 DNA 溶液 受粉 子房 花粉管通道 花柱切面 稳定维持和表达 双子叶植物和裸子植物 单子叶植物 考点二 基因工程的基本操作程序 b.农杆菌的优势与缺点:农杆菌细胞内的Ti质粒上的　　　 可携带目的基因整合到受体细胞的　　　　　　上;但存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。 c.农杆菌转化法的两次拼接和两次导入: 第一次拼接:　　　　　　　　　　　　　　　　　　; 第二次拼接(非人工操作):指 ; 第一次导入:　　　　　　　　　　　　　　　　; 第二次导入(非人工操作):指　　　　　　　　　　　　　　　 　。 T-DNA 染色体 DNA 将目的基因拼接到Ti质粒的 T-DNA 上 插入目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞的染色体 DNA 上 将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌 含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞 考点二 基因工程的基本操作程序 d.转化方法: 可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞,并再生成植株;受体细胞是　　 ；也可以将花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间,然后培养植株并获得种子,再进行筛选、鉴定等;受体细胞是　　　　。 (2)将目的基因导入动物细胞 ①方法:常用　　　　　 。 ②选择受精卵作为受体细胞的理由:a.　　　　,易操作。 b.　　　　　,易培养成完整个体。 体细胞 受精卵 显微注射法 受精卵 体积大 全能性高 (3)将目的基因导入原核细胞 ①方法: 。 ②原理:使用Ca2+处理可使细胞处于一种 的生理状态。 ③过程: ④优点与缺点: 优点:生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作; 缺点:原核细胞作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性,需要在体外进行再加工。 4.目的基因的检测与鉴定 Ca2+处理法 能吸收周围环境中DNA分子 考点二 基因工程的基本操作程序 关键能力提升：据图分析抗虫棉的培育过程。 (1)该过程中的目的基因是 ，载体是 。 (2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割 目的基因，这样做的原因是什么？ Bt基因 Ti质粒 为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。 (3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？ 目的基因应插入启动子与终止子之间。 (4)该实例中，导入目的基因的方法是 。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？ 由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA， 农杆菌转化法 (5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？ 一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。 (6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？ 抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。 考点二 基因工程的基本操作程序 1. [2023·浙江6月选考] 某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合 到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合 子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所 示。下列叙述正确的是(　 ) A.Gata3基因的启动子无法 控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子 B 刷真题、明考向 2、[2023·山东卷] 科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测, 该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是　　　　　　。除图甲中 标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　 　　　　　　 　 (答出2个结构即可)。 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测, 若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　　　 　。已知J基因转录的模板 链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　(填“a链”或“b链”)相应 部分的序列相同。 RNA 聚合酶 a 链 F 2和 R1或 F1与 R2 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　 ,条带2所检出的蛋白　　　(填 “是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 融合蛋白 不是 刷真题、明考向 $$