备课素材：制备单克隆抗体过程中B淋巴细胞问题释疑-2024——2025学年度第一学期高中生物学选择性必修三

制备单克隆抗体过程中B淋巴细胞问题释疑 单克隆抗体在生物、农业、医疗、制药等众多领域得到极为广泛的应用,同时也是高考考查的重点。人教版普通高中教科书《生物学·选择性必修3·生物技术与工程》(以下简称“新教材”)重新绘制了制备单克隆抗体过程示意图： 与课标实验教科书选修3相比,新教材的插图明确了与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞有多种,这样描述更加准确,更利于学生理解。但由于篇幅所限,新教材并未对怎样获取 B淋巴细胞等问题进行深人阐释。 1.与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞为什么有多种？ 新教材P.48图2-16的单克隆抗体制备过程示意图中(以下简称“过程图”)显示:从免疫的小鼠脾中得到的 B淋巴细胞有多种。一些教辅提道之所以有多种 B淋巴细胞,是因为小鼠还会接触到 其他抗原,这些抗原刺激机体产生了相应的B淋巴细胞。而过程图明确指出从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的 B淋巴细胞。 每个抗原都有一些不同的抗原决定簇,因此由该抗原刺激的每个B淋巴细胞都可能产坐物种针对某一特定抗原决定簇的抗体。这些由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定簇的抗体,称为多克隆抗体。理论上用于和骨髓瘤细胞融合的细胞就是这些B淋巴细胞,即过程图中的“产生特定抗体的 B淋巴细胞”。但实际操作时,选用的是从脾中分离的细胞,因为脾中有很多种细胞,包括B淋巴细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞、树突状细胞等。这里就包括特定抗原刺激产生的能产生特定抗体的B淋巴细胞,还有其他抗原刺激产生的B淋巴细胞。分离的脾细胞中所含对抗原具有特异性的B淋巴细胞较少,所以融合后还需要多次筛选。 2.能否从其脾中获取产生特定抗体的B淋巴细胞？ 根据前文的分析可知,过程图中分离出能产生特定抗体的多种 B淋巴细胞是理论上想要得到的那么,实际操作中能不能做到只分离由特定抗原刺激产生的对抗原具有特异性的 B淋巴细胞呢? 由于分离的脾细胞中所含对抗原具有特异性的 B淋巴细胞较少,实际操作中,有些研究者在融合前先富集对抗原具有特异性的B淋巴细胞,然后再进行细胞融合。即先将抗原包被在培养板上或其他基质上,然后与脾细胞结合,那些表面有特异性抗体的B细胞与抗原结合使B细胞黏附于培养板上或基质上,轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞用于融合。还有科学家采用特异性电融合的方法,利用生物素-抗生物素-抗原-抗体桥使具有特异性的 B细胞与骨髓瘤细胞特异性配对,或直接将抗原标记到骨髓瘤细胞表面,利用抗原与抗体特异性结合造成两种细胞特异性配对,然后施加高压电脉冲使细胞融合。值得注意的是,这里所描述的B细胞表面特异性抗体指的是B细胞表面抗原受体(BCR),BCR是位于B细胞表面的负责特异性识别及结合抗原的分子,其本质是一种膜表面免疫球蛋白--mlg,有 mlgM 和 mlgD 等类型。 这两种方法都能够做到选出与骨髓瘤细胞融合的特异性B细胞,但仍然有多种B细胞(针对同一抗原)。另外,由于骨髓瘤细胞具有合成和分泌球蛋白的机制,也会分泌一些免疫球蛋白,所以用于融合的骨髓瘤细胞也需要选择。通常筛选出缺失抗体分泌能力的细胞株,以避免杂交瘤细胞分泌一种以上的免疫球蛋白而影响单克隆抗体的产生。 3.用于融合的 B 淋巴细胞是不是浆细胞？ 新教材 P.48 过程图中与小鼠骨髓瘤细胞融合的细胞是从经免疫的小鼠脾中分离的多种B淋巴细胞,而通过对选择性必修1免疫调节的学习可知,能够分泌抗体的细胞是浆细胞,于是学生产生疑惑:浆细胞算不算B细胞?用于融合的B淋巴细胞是不是浆细胞? 1975年,英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒创造性地将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,所得到的融合细胞能大量增殖,产生足够数量的特定抗体，包括Calfrè和Milstein于1981年所做的实 验,都未对脾细胞进行筛选。在杂交瘤技术发展过程中,也有用淋巴结细胞和骨髓瘤细胞融合的报道“。该阶段的研究使用的B细胞都是包括了各个发育阶段的B细胞的混合群体。 1985年,沈国良等研究了小鼠不同分化阶段的B细胞对杂交瘤形成的影响。该研究根据B细胞的表面有无抗原特异性表面Ig(即BCR)以及是否分泌特异性抗体,将B细胞受抗原刺激后的分 化过程分为抗原特异性B细胞(有表面J8不分泌Ig)、前浆细胞(有表面I8分泌Ig)及浆细胞(分泌Ig而无表面I8)3个阶段。用抗原特异性玫瑰花技术从脾细胞中除去抗原特异性B细胞及前浆细胞但基本上保留浆细胞)以后,再与骨髓瘤细胞融合,并与未经处理的脾细胞的融合结果进行比较观察浆细胞在淋巴细胞融合中所起的作用,用保留有80%浆细胞的脾细胞进行融合时,杂交瘤的特异性效率从未分离时的 55%下降到分离后的9.29%。实验结果表明,浆细胞(分泌Ig而无表面I8)参与融合并形成具有分泌抗体功能的杂交瘤的可能性很小。 之后的研究更多的是通过目标抗原和B细胞表面抗原受体(BCR)的特异性结合,如前文所述采用不同方法提前筛选出符合抗原特异性要求的B细胞,再与骨髓瘤细胞融合,这种方法必然不再 包含不表达 BCR 的成熟浆细胞。因为在B细胞的发育过程中,mlg的表达会发生变化:mIgD是B细胞成熟的标志,未成熟的 B细胞仅表达 mlgM;成熟的B细胞可同时表达mIgM和mgD;而B细胞活化 后其表面的mlgD则逐渐消失;当B细胞最终分化为浆细胞后,则不表达 mlg。 综上所述,杂交瘤研究的初始阶段,用于融合的是未经筛选的脾细胞,包括各个发育阶段的B细胞。随着研究的深人,科学家采用特定抗原与B细胞表面抗原受体特异性结合的原理先筛选出特定的B细胞,再与骨髓瘤细胞融合,此方法获得的B细胞由于表面抗原受体还在,所以不再包括浆细胞。 学科网（北京）股份有限公司 $$