3.1 重组DNA技术的基本工具，DNA的粗提取与鉴定-【帮课堂】2024-2025学年高二生物同步学与练（人教版2019选择性必修3）

第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具，DNA的粗提取与鉴定 学习目标 1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。 2.认同几英寸的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 3.进行DNA的粗提取与鉴定。 学习重点：重组DNA技术所需三种基本工具的作用。 学习难点：DNA的粗提取与鉴定。 1.基因工程是指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的 ，创造出更符合人们需要的新的 。从技术操作的层面看，由于基因工程是在 上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2.限制性内切酶又称限制酶，主要是从 中分离纯化出来的。能够识别双链DNA分子的 ，并且使每一条链中特定部位的 断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA末端通常有两种形式—— 。当限制酶在它它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生 ；当限制酶在它识别序列的中心轴线切开时产生的是 。 3.DNA连接酶是能够将两个 连接起来的酶。从大肠杆菌分离得到的DNA连接酶- ，只能将 末端的DNA片段连接起来；从T4噬菌体中分离获得，既可以连接 ，又可以缝合 ，但连接 的效率相对较低。 4.基因进入细胞的载体是指将外源基因送入细胞的 分子。包括 、噬菌体的衍生物、 等，其具备的条件有在细胞中 ，有 限制酶切割位点，有特殊的 基因。 5.DNA的粗提取与鉴定：原理是DNA 酒精，但某些蛋白质 。DNA在不同浓度的 中溶解度不同，能溶于2mol/L的 。DNA遇 试剂会呈现 。 6.材料选择：选用DNA含量相对较高的生物组织，破碎细胞：称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，导入10mL研磨液，充分研磨。 7DNA的粗提取的步骤：（1）在漏斗中垫上 ，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在 冰箱中放置几分钟，再取 。或直接将研磨液导入塑料 中，在 r/min的转速下离心 min，再取上清液放入烧杯中。 （2）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为 ），静置 ，溶液中出现的 就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿 方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液导入离心管中，在 r/min的转速下离心 ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA)晾干。 （3）DNA的鉴定:取两支20mL的试管，各加入2mol/L的 5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的 中。然后，向两支试管中各加入4mL的 试剂。混合均匀后，将试管置于 中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 【答案】1.转基因 遗传特性 生物类型和生物产品 DNA分子水平 2.原核生物 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端和平末端 粘性末端 平末端 3.DNA片段 EcoliDNA连接酶 互补黏性 双链DNA片段互补的黏性末端 双链DNA片段的平末端 平末端 4.DNA 质粒 动植物病毒 自我复制 一个或多个 标记 5.不溶于 溶于酒精 NaCl溶液 NaCl溶液 二苯胺 蓝色 6.（1）纱布 4℃ 上清液 离心管 1500 5 （2）95% 2～3min 白色丝状物 一个 10000 5min （3）NaCl溶液 NaCl溶液 二苯胺 沸水 1.外源基因在受体细胞表达的理论基础是什么？ ①基因是控制生物性状的遗传物质的基本结构和功能单位； ②遗传信息的传递都遵循中心法则； ③生物界公用一套遗传密码。 2.基因拼接的理论基础是什么？ ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸； ②DNA分子都遵循碱基互补配对原则； ③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。 3.限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在进化过程中形成了一套完善的防御机制。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，以保证自身的安全。 4.限制酶不切割自身DNA的原因是什么？ 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 5.提取DNA时，用玻璃棒搅拌时，动作为什么要轻缓？ 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 6.DNA粗提取实验为什么不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？ 本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 1．“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（    ） A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【解析】D 裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。 2．限制性内切酶EcoRI识别并切割双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（    ） A．6 B．250 C．4000 D．24000 【解析】C 据图可知，EcoRI的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。C符合题意。 3．粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 【解析】A 木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。 4．将大肠杆菌的质粒连接上人生长激素的基因后，重新置入大肠杆菌的细胞内，通过发酵就能大量生产人生长激素。下列叙述正确的是 A．发酵产生的生长激素属于大肠杆菌的初级代谢产物 B．大肠杆菌获得的能产生人生长激素的变异可以遗传 C．大肠杆菌质粒标记基因中腺嘌呤与尿嘧啶含量相等 D．生长激素基因在转录时需要解旋酶和DNA连接酶 【解析】B 初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等，生长激素是蛋白质是大分子，不是初级代谢产物，A错误；大肠杆菌获得的能产生人生长激素的变异类型是基因重组，是可遗传的变异，B正确；大肠杆菌质粒是小型环状DNA分子，所以不会出现尿嘧啶，C错误；DNA连接酶是连接磷酸二酯键的，在转录是不需要，生长激素基因在转录时需要RNA聚合酶，D错误。 5．下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验叙述,错误的是 A．酵母和菜花均可作为提取 DNA 的材料 B．DNA 既溶于2 mol / L NaCl 溶液也溶于蒸馏水 C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻璃棒上有白色絮状物 D．DNA 溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后变蓝 【解析】C 酵母菌和菜花含有DNA，可作为提取DNA的材料，A正确；DNA溶于2mol/L的NaCl溶液，也可溶于蒸馏水，B正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞吸水涨破，获得鸡血细胞液，DNA溶于蒸馏水，观察不到白色絮状物，C错误；DNA与二苯胺沸水浴加热呈蓝色，D正确。 探究一 作为基因工程载体的条件 1.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是什么？ 对靶细胞具有较高的转化效率，不能增殖，对细胞无害。 探究二 限制酶切割产生的黏性末端 2.限制性内切核酸酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。 探究三 限制酶的选择原则 3.下图甲是含有某种抗病基因的DNA片段，下图乙是运载抗病基因的载体。在用限制酶切割含抗病基因的DNA核载体时，应选择什么限制酶？ (1)选择限制酶应遵循不破坏目的基因的原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。 (2)选择限制酶应遵循保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。 (3)选择限制酶应遵循确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 探究四 重组DNA技术的酶 4.重组DNA技术所用的DNA连接酶、DNA聚合酶和限制酶都作用于磷酸二酯键，比较它们的区别。 ①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。 ②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 ③限制酶是识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 探究五 DNA的粗提取和鉴定 5.怎样分析粗提取的DNA中可能含有杂质？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功，如果不呈蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现失误等。 · 基础过关练 1.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A. 整个提取过程中可以不使用离心机 B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【解析】A 在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 2.下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ） A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C. DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【解析】D 研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 3.四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是(　　) A.上图中EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接 B.图中Sma Ⅰ、EcoR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接 C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键 D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端 【解析】D　不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D错误。 4.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 【解析】A　构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。 5.下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是(　　) A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量 B.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C.向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质 D.用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化 【解析】D　洋葱研磨液用两层纱布过滤，以保证提取的DNA量，A错误；DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白质在冷酒精中的溶解度较高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提纯DNA，但用玻璃棒搅拌时提取量不会增加，B错误；向含DNA的滤液中加入0.14 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质，C错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化，D正确。 6.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是(　　) A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法 D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 【解析】D　通过PCR获取目的基因时，两种引物分别和目的基因的两条单链结合，并沿相反的方向合成子链，故选用引物甲和引物丙，A正确；由甲图可知，选用BamHⅠ会破坏两种抗性基因，结合乙图可确定应选择BclⅠ和HindⅢ剪切，B正确；将目的基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋转化法，C正确；构建重组质粒时目的基因插入氨苄青霉素抗性基因中，故氨苄青霉素抗性基因被破坏不能表达，D错误。 7.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是 A.用相同方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提取的DNA D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 【解析】A 哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，不能提取到DNA，鸡的虹吸八婆含有细胞核，可以提取到DNA，用相同方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量差别很大，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔，B正确；预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提取的DNA，C正确；在水浴加热条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色，D正确。 8.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【解析】B　低温时DNA酶的活性降低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；DNA溶解在研磨液中，离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 9.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（    ） A．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 B．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 C．E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而米，所以也能剪切自身的DNA 【解析】A 限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，A正确；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，B错误；E•coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D错误。 10.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，正确的是（    ）        A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤ B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近 C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组 D．步骤①的目的是初步分离DNA与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大 【解析】D DNA的粗提取和鉴定步骤是：加入蒸馏水，破碎细胞→过滤，获取含DNA的滤液→去除滤液中杂质→DNA的析出→鉴定，因此图中表示正确的实验操作顺序是③→②→①→④→⑤，A错误；猪血红细胞中没有细胞核，提取不到DNA，用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量不相同，B错误；⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是实验组，C错误；步骤①的目的是析出并获得DNA，步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，D正确。 · 能力提升练 11.“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（    ） A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【解析】D 裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。 12．关于物质提取、分离或鉴定的高中生物学相关实验，叙述错误的是（　　） A．研磨肝脏以破碎细胞用于获取含过氧化氢酶的粗提液 B．利用不同物质在酒精溶液中溶解性的差异粗提DNA C．依据吸收光谱的差异对光合色素进行纸层析分离 D．利用与双缩脲试剂发生颜色变化的反应来鉴定蛋白质 【解析】C 肝脏细胞中存在过氧化氢酶，故需要破碎细胞制成肝脏研磨液来获得过氧化氢酶的粗提液，A正确；不同物质在酒精溶液中的溶解度不同，故可粗提取DNA，B正确；依据光合色素在层析液中的溶解度不同，对光合色素进行纸层析分离，C错误；蛋白质与双缩脲试剂会发生紫色反应，可以利用与双缩脲试剂发生颜色变化的反应来鉴定蛋白质，D正确。 13.某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。                   下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 【解析】C 酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 14.DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(　　) A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物 B.双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测 D.凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 【解析】B　琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛选效应，来进行分离，可用于分离、鉴定DNA分子的混合物，A正确；凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有关，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误；凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，用于分离后DNA的检测，C正确；DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D正确。 15.CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ）    A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 【解析】B 为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。 16.外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（　　）    A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶 B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行 C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利 D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释 【解析】C 由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA聚合酶，A正确；填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5’到3’的方向进行，B正确；DNA有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA复制的正确进行，对细胞最有利，C错误；癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释，D正确。 17.某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。                   下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 【解析】C 酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 18．由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述错误的是（　　） A．基因工程的核心步骤是构建基因表达载体 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P只能作为中间载体，因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，则表明重组载体可能导入受体细胞 【解析】B 基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，A正确；由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误；由图可知，载体P是中间质粒，不含有有表达目的基因的启动子和终止子，不能表达，C正确；受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D正确。 19．关于DNA粗提取与鉴定的实验，下列叙述正确的是（    ） A．可选择哺乳动物的成熟红细胞和肝细胞作为实验材料 B．实验中将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率基本不变 C．DNA鉴定时，沸水浴加热会使DNA双螺旋结构发生改变 D．DNA析出时，用玻璃棒快速搅拌以提高DNA提取量 【解析】C 哺乳动物的成熟红细胞无细胞核和细胞器，不能作为DNA粗提取与鉴定的实验材料，A错误；研磨液能够溶解细胞膜，促使细胞破裂，从而释放出细胞内的DNA，同时能够稳定溶液的pH值，防止DNA在pH变化时降解或变性‌，实验中将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率将降低，B错误；鉴定过程中沸水浴加热可能使DNA双螺旋结构发生改变，C正确；DNA析出过程中，用玻璃棒搅拌时动作要轻柔，以防止DNA断裂，从而获得较完整的DNA分子，D错误。 20．酒精在高中生物学实验中应用广泛，下列有关酒精的实验相关叙述，错误的是（    ） A．检测生物组织中的脂肪实验中，用体积分数为50%的酒精滴加到染过色的花生子叶上，目的是洗去浮色 B．低温诱导植物细胞染色体数目的变化实验中，用体积分数为95%的酒精浸泡经诱导处理的根尖0．5～1h，以固定细胞形态 C．微生物的实验室培养中，可以用体积分数为70%的酒精对实验操作人员的双手以及超净工作台进行消毒 D．DNA粗提取实验中，通过加入体积分数为95%的预冷的酒精，利用DNA不溶于酒精但某些蛋白质溶于酒精的原理来粗提取DNA分子 【解析】B 检测生物组织中的脂肪实验中，体积分数50%的酒精用于洗去浮色，A正确；在低温诱导植物细胞染色体数目的变化实验中，用卡诺氏液固定细胞形态，用体积分数为95%的酒精冲洗的目的是洗去卡诺氏液，B错误；在微生物接种的实验中，一般用70%酒精对实验者的双手进行消毒，C正确；加入预冷的体积分数为95%酒精的原理是：DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，所以能析出DNA，D正确。 思维拓展练 21．某小组进行了“DNA的粗提取与鉴定”实验，部分实验步骤如图所示，其中B为可能会加入的某试剂。回答下列问题： (1)该实验利用酒精初步分离DNA与蛋白质的原理是 。 (2)若实验材料A为菜花等硬度较高的植物，则B可能是 酶等，上述酶可以破坏植物细胞的细胞壁，加强研磨效果。 (3)将上述滤液C冷却后加入 溶液，静置几分钟后得到的白色丝状物就是粗提取的DNA。将丝状物处理后溶于适量2mol⋅L-1的NaCl溶液中进行鉴定。鉴定时所用的是 试剂，DNA遇该试剂会呈现 色，该试剂在使用时应注意的事项有 （答出1点）。 【解析】（1）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。 （2）植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，若实验材料A为菜花等硬度较高的植物，则B可能是纤维素酶等，上述酶可以破坏植物细胞的细胞壁，加强研磨效果，提高DNA粗提取的效率。 （3）DNA不溶于冷酒精，因此将上述滤液C冷却后加入（预冷的体积分数为95%的）酒精溶液，静置几分钟后得到的白色丝状物就是粗提取的DNA。将丝状物处理后溶于适量2mol·L-1的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，水浴加热条件下溶液会呈现蓝色，该试剂在使用时应注意沸水浴加热、需要现用现配。 【答案】(1)DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精 (2)纤维素（或果胶） (3)（预冷的体积分数为95%的）酒精 二苯胺 蓝 需要沸水浴加热；需要现用现配 22．某小组开展了DNA的粗提取与鉴定实验，选择了不同温度（20℃、-20℃）条件下保存的花菜、辣椒和蒜黄作为实验材料，部分实验步骤如图1所示。回答下列问题：    (1)选择花菜等植物材料时，为了使研磨的效果更好，可以在处理材料的过程中加入适量的 （填酶的名称）。 (2)图1中，将获取的研磨液直接倒入塑料离心管中，然后进行离心处理，再取 （填“上清液”或“沉淀物”）放入烧杯中。加入体积分数为95%的预冷酒精溶液来初步提取DNA，这样做的原理是 。 (3)将DNA粗提取物溶于2mol·L-1的NaCl溶液中，加入 试剂，在 条件下进行鉴定。 (4)DNA鉴定结果如图2所示。据图2分析，相同温度条件下， 的DNA粗提取含量最高。同种实验材料在 ℃条件下DNA粗提取含量更高，其原因可能是 （从酶的角度作答）。 【解析】（1）由于菜花细胞含有细胞壁，可在研磨过程中加入适量的纤维素酶和果胶酶，以缩短研磨时间，避免研磨时间过长，影响DNA的提取量。 （2）将获取的研磨液直接倒入塑料离心管中，然后进行离心处理，再取上清液放入烧杯中。DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，因此加入体积分数为95%的预冷酒精溶液来初步提取DNA。 （3）将DNA粗提取物溶于2mol·L-1的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下进行鉴定。 （4）据图2分析，相同温度条件下，蒜黄的DNA粗提取含量最高。同种实验材料在-20℃条件下DNA粗提取含量更高，其原因可能是与20℃相比，-20℃的低温抑制了酶的活性，DNA的降解速率更慢。 【答案】(1)纤维素酶（和果胶酶） (2)上清液 DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精 (3)二苯胺 沸水浴 (4)蒜黄 -20 与20℃相比，-20℃的低温抑制了酶的活性，DNA的降解速率更慢 23．科研团队发现，从某植物细胞中提取的一种蛋白质A对治疗糖尿病效果良好。该团队欲运用生物工程技术生产蛋白质A作为治疗糖尿病的临床药物。设计方案1：利用植物细胞工程技术；方案2：利用基因工程制备大肠杆菌工程菌，再结合发酵工程批量生产蛋白质A．回答下列问题： (1)蛋白质A在某植物生长、发育的各个阶段都有合成，推测其最可能是植物的 （填“初生”或“次生”）代谢产物。利用植物细胞工程获取蛋白质A的过程是 。 (2)方案2中，研究人员根据蛋白质A的氨基酸序列人工合成的DNA片段碱基排列顺序不唯一，原因是 ，该方法得到的DNA序列还需添加 （元件名称）。也可用PCR技术从植物细胞中扩增出蛋白质A的基因，该技术的原理是 。 (3)下图、表为制备大肠杆菌工程菌时所使用的质粒、目的基因及其相关限制酶识别序列和切割位点，其中LacZ基因表达的产物可将无色物质X-gal转变为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色。 注：Neo基因为卡那霉素抗性基因。 限制酶 BamHI XmaI EcoRI SmaI Sau3AI 识别序列和切割位点 ①为将目的基因准确插入质粒中，应选用 酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和质粒需使用 （填“T4”“E。coli”或“T4或E。coli”）DNA连接酶处理，才能得到重组质粒。重组质粒用Sau3AⅠ和EcoRⅠ双酶切割后通过电泳分离可得到 个条带（不考虑切割的条带同等大小）。 ②筛选出成功导入重组质粒的受体菌的思路是 。 (4)在加入发酵罐前应该先对选育的大肠杆菌菌种进行 。若该大肠杆菌是通过引入信号肽改造过的工程菌，可以将蛋白质A分泌出细胞，则与方案1相比，方案2的优点有 （答出1点即可）。 【解析】（1）蛋白质A在某植物生长、发育的各个阶段都有合成，因此最可能属于初生代谢产物。利用植物细胞工程获取蛋白质A是指在离体条件下对该植物细胞进行组织培养使其增殖，破碎细胞后提取蛋白质A。 （2）研究人员根据蛋白质A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于密码子的简并性，即同一种氨基酸可以对应多种密码子，因此该方法得到的DNA片段碱基排列顺序不唯一，且该方法得到的基因缺少启动子、终止子。PCR技术扩增出蛋白质A基因的原理是DNA半保留复制。 （3）①应该将目的基因插入质粒的启动子和终止子之间，且转录方向应从启动子指向终止子，若选择EcoR I会破坏目的基因，所以选择Xma I和BamH I切割质粒，为得到相同的黏性末端，应该选择Xma I和Sau3A I切割目的基因，Sau3A I和BamH I产生的黏性末端相同，所以质粒和目的基因切割后可以正确连接。由于3种限制酶产生的均为黏性末端，所以使用T4或E.coli DNA连接酶处理均能得到重组质粒。重组质粒中有2个EcoR I的切割位点、1个Sau3A I的切割位点，BamH I的识别序列中同样有Sau3A I的切割位点，所以质粒上总共有4个切割位点，环状结构被切成4段，电泳分离可得到4个条带。 ②由图可知，质粒中含有LacZ基因和卡那霉素抗性基因，在构建基因表达载体时，LacZ基因被破坏，无法使无色的X-gal变为蓝色物质。因此，在培养基中加入卡那霉素和X-gal，只有成功导入含目的基因的重组质粒的大肠杆菌才能在含卡那霉素培养基中存活，同时表现为无色（或白色）菌落。 （4）在加入发酵罐前应该先对选育的大肠杆菌菌种进行扩大培养，以增加菌种数量。初生代谢物是植物细胞生命活动必须的，不会分泌到细胞外，因此方案1需要破碎植物细胞后再提取蛋白质A，方案2可以从发酵液中直接提取和分离蛋白质A；由于微生物细胞生长、繁殖迅速，方案2比方案1获得的蛋白质A产量高。 【答案】(1)初生 在离体条件下对该植物细胞进行培养使其增殖，破碎细胞后提取获得其产物蛋白质A (2)一种氨基酸可能由多种密码子编码（或密码子具有简并性） 启动子、终止子 DNA半保留复制 (3)Xma I和Sau3A I T4或E.coli 4 在培养基中添加卡那霉素和X-gal，选择存活下来的无（或白）色菌落 (4)扩大培养（增加菌种数量） 方案1需要破碎植物细胞后提取蛋白质A，方案2可以从发酵液中直接提取和分离蛋白质A，操作简单；微生物细胞生长、繁殖迅速，方案2比方案1获得的蛋白质A产量高 24．根据基因工程的有关知识，回答下列问题。 (1)限制酶切割DNA分子后产生的片段，其末端形式有 和 。 (2)质粒用EcoRⅠ切割后产生的片段如下： AATTC……G G……CTTAA 为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA片段除可用EcoRⅠ切割外，还可用其他限制酶切割，“其他限制酶”必须具有的特点是 。 (3)实际操作中，往往用EcoRⅠ和另一种限制酶同时切割质粒和外源DNA分子，其优点在于可防止 。 (4)按其来源不同，基因工程中常常使用的DNA连接酶有两类，即 DNA连接酶和 DNA连接酶。 (5)基因工程中除质粒外， 和 也可作为载体。质粒中通常含有特殊的标记基因，这些标记基因的作用是 。 【解析】（1）限制酶切割DNA分子后产生两种类型的末端，即黏性末端（切割位点在中轴线两侧）和平末端（切割位点在中轴线上）。 （2）为使载体与目的基因相连，两种限制酶切割产生的末端应相同，故“其他限制酶”必须具有的特点是切割产生的末端与EcoRⅠ切割产生的相同。 （3）根据题意分析，用不同的限制酶同时切割质粒和外源DNA分子，可以防止质粒和目的基因的自身环化及反向连接，进而使得目的基因准确插入质粒。 （4）基因工程常用的DNA连接酶按来源分，可分为E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （5）基因工程中常用的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体等；质粒具有标记基因，便于重组DNA的筛选。 【答案】(1)黏性末端 平末端 (2)切割产生的末端与EcoRⅠ切割产生的相同 (3)质粒和目的基因的自身环化及反向连接 (4)E.coli T4 (5)动植物病毒 噬菌体 便于重组DNA的筛选 25．“基因编辑婴儿”露露和娜娜的诞生引发了巨大的争议。基因编辑技术能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对基因中特定DNA片段的敲除、加入等。请回答下列有关问题： (1)露露和娜娜的诞生借助了试管婴儿技术，包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术。精子需经过 处理才能与发育至 期的卵子结合形成受精卵。 (2)露露和娜娜的CCR5基因中被敲除了32个碱基对，使得T细胞不能正常表达某种膜蛋白，从而使HIV无法识别并攻击T细胞。敲除CCR5基因中32个碱基对，类似于 酶的作用，敲除后产生的DNA片段末端通常有两种形式即 ，并通过 酶连接起来。 (3)基因编辑技术引起的变异属于 。 【解析】（1）试管婴儿是指人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎，体外受精时，精子需经过获能处理才能与发育至减数第二次分裂中期的卵子结合形成受精卵。 （2）碱基对的敲除相当于将基因进行切割，类似于限制性核酸内切酶的作用，敲除后产生的DNA片段末端通常有两种形式即黏性末端或平末端，并通过DNA连接酶连接起来，通常黏性末端连接起来的成功率更高。 （3）基因中碱基对的缺失或增加引起的变异属于基因突变，可见基因编辑技术引起的变异属于基因突变。 【答案】(1) 获能 减数第二次分裂中 (2)限制性核酸内切（或限制） 黏性末端或平末端 DNA连接 (3)基因突变 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北 1 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具，DNA的粗提取与鉴定 学习目标 1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。 2.认同几英寸的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 3.进行DNA的粗提取与鉴定。 学习重点：重组DNA技术所需三种基本工具的作用。 学习难点：DNA的粗提取与鉴定。 1.基因工程是指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的 ，创造出更符合人们需要的新的 。从技术操作的层面看，由于基因工程是在 上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2.限制性内切酶又称限制酶，主要是从 中分离纯化出来的。能够识别双链DNA分子的 ，并且使每一条链中特定部位的 断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA末端通常有两种形式—— 。当限制酶在它它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生 ；当限制酶在它识别序列的中心轴线切开时产生的是 。 3.DNA连接酶是能够将两个 连接起来的酶。从大肠杆菌分离得到的DNA连接酶- ，只能将 末端的DNA片段连接起来；从T4噬菌体中分离获得，既可以连接 ，又可以缝合 ，但连接 的效率相对较低。 4.基因进入细胞的载体是指将外源基因送入细胞的 分子。包括 、噬菌体的衍生物、 等，其具备的条件有在细胞中 ，有 限制酶切割位点，有特殊的 基因。 5.DNA的粗提取与鉴定：原理是DNA 酒精，但某些蛋白质 。DNA在不同浓度的 中溶解度不同，能溶于2mol/L的 。DNA遇 试剂会呈现 。 6.材料选择：选用DNA含量相对较高的生物组织，破碎细胞：称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，导入10mL研磨液，充分研磨。 7DNA的粗提取的步骤：（1）在漏斗中垫上 ，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在 冰箱中放置几分钟，再取 。或直接将研磨液导入塑料 中，在 r/min的转速下离心 min，再取上清液放入烧杯中。 （2）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为 ），静置 ，溶液中出现的 就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿 方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液导入离心管中，在 r/min的转速下离心 ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA)晾干。 （3）DNA的鉴定:取两支20mL的试管，各加入2mol/L的 5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的 中。然后，向两支试管中各加入4mL的 试剂。混合均匀后，将试管置于 中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 1.外源基因在受体细胞表达的理论基础是什么？ 2.基因拼接的理论基础是什么？ 3.限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 4.限制酶不切割自身DNA的原因是什么？ 5.提取DNA时，用玻璃棒搅拌时，动作为什么要轻缓？ 6.DNA粗提取实验为什么不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？ 1．“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（    ） A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 2．限制性内切酶EcoRI识别并切割双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（    ） A．6 B．250 C．4000 D．24000 3．粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 4．将大肠杆菌的质粒连接上人生长激素的基因后，重新置入大肠杆菌的细胞内，通过发酵就能大量生产人生长激素。下列叙述正确的是 A．发酵产生的生长激素属于大肠杆菌的初级代谢产物 B．大肠杆菌获得的能产生人生长激素的变异可以遗传 C．大肠杆菌质粒标记基因中腺嘌呤与尿嘧啶含量相等 D．生长激素基因在转录时需要解旋酶和DNA连接酶 5．下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验叙述,错误的是 A．酵母和菜花均可作为提取 DNA 的材料 B．DNA 既溶于2 mol / L NaCl 溶液也溶于蒸馏水 C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻璃棒上有白色絮状物 D．DNA 溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后变蓝 探究一 作为基因工程载体的条件 1.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是什么？ 探究二 限制酶切割产生的黏性末端 2.限制性内切核酸酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。 探究三 限制酶的选择原则 3.下图甲是含有某种抗病基因的DNA片段，下图乙是运载抗病基因的载体。在用限制酶切割含抗病基因的DNA核载体时，应选择什么限制酶？ 探究四 重组DNA技术的酶 4.重组DNA技术所用的DNA连接酶、DNA聚合酶和限制酶都作用于磷酸二酯键，比较它们的区别。 探究五 DNA的粗提取和鉴定 5.怎样分析粗提取的DNA中可能含有杂质？ · 基础过关练 1.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A. 整个提取过程中可以不使用离心机 B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 2.下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ） A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C. DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 3.四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是(　　) A.上图中EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接 B.图中Sma Ⅰ、EcoR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接 C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键 D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端 4.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 5.下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是(　　) A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量 B.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C.向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质 D.用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化 6.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是(　　) A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法 D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 7.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是 A.用相同方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提取的DNA D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 8.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 9.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（    ） A．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 B．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 C．E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而米，所以也能剪切自身的DNA 10.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，正确的是（    ）        A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤ B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近 C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组 D．步骤①的目的是初步分离DNA与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大 · 能力提升练 11.“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（    ） A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 12．关于物质提取、分离或鉴定的高中生物学相关实验，叙述错误的是（　　） A．研磨肝脏以破碎细胞用于获取含过氧化氢酶的粗提液 B．利用不同物质在酒精溶液中溶解性的差异粗提DNA C．依据吸收光谱的差异对光合色素进行纸层析分离 D．利用与双缩脲试剂发生颜色变化的反应来鉴定蛋白质 13.某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。                   下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 14.DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(　　) A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物 B.双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测 D.凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 15.CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ）    A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 16.外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（　　）    A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶 B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行 C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利 D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释 17.某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。                   下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 18．由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述错误的是（　　） A．基因工程的核心步骤是构建基因表达载体 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P只能作为中间载体，因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，则表明重组载体可能导入受体细胞 19．关于DNA粗提取与鉴定的实验，下列叙述正确的是（    ） A．可选择哺乳动物的成熟红细胞和肝细胞作为实验材料 B．实验中将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率基本不变 C．DNA鉴定时，沸水浴加热会使DNA双螺旋结构发生改变 D．DNA析出时，用玻璃棒快速搅拌以提高DNA提取量 20．酒精在高中生物学实验中应用广泛，下列有关酒精的实验相关叙述，错误的是（    ） A．检测生物组织中的脂肪实验中，用体积分数为50%的酒精滴加到染过色的花生子叶上，目的是洗去浮色 B．低温诱导植物细胞染色体数目的变化实验中，用体积分数为95%的酒精浸泡经诱导处理的根尖0．5～1h，以固定细胞形态 C．微生物的实验室培养中，可以用体积分数为70%的酒精对实验操作人员的双手以及超净工作台进行消毒 D．DNA粗提取实验中，通过加入体积分数为95%的预冷的酒精，利用DNA不溶于酒精但某些蛋白质溶于酒精的原理来粗提取DNA分子 思维拓展练 21．某小组进行了“DNA的粗提取与鉴定”实验，部分实验步骤如图所示，其中B为可能会加入的某试剂。回答下列问题： (1)该实验利用酒精初步分离DNA与蛋白质的原理是 。 (2)若实验材料A为菜花等硬度较高的植物，则B可能是 酶等，上述酶可以破坏植物细胞的细胞壁，加强研磨效果。 (3)将上述滤液C冷却后加入 溶液，静置几分钟后得到的白色丝状物就是粗提取的DNA。将丝状物处理后溶于适量2mol⋅L-1的NaCl溶液中进行鉴定。鉴定时所用的是 试剂，DNA遇该试剂会呈现 色，该试剂在使用时应注意的事项有 （答出1点）。 22．某小组开展了DNA的粗提取与鉴定实验，选择了不同温度（20℃、-20℃）条件下保存的花菜、辣椒和蒜黄作为实验材料，部分实验步骤如图1所示。回答下列问题：    (1)选择花菜等植物材料时，为了使研磨的效果更好，可以在处理材料的过程中加入适量的 （填酶的名称）。 (2)图1中，将获取的研磨液直接倒入塑料离心管中，然后进行离心处理，再取 （填“上清液”或“沉淀物”）放入烧杯中。加入体积分数为95%的预冷酒精溶液来初步提取DNA，这样做的原理是 。 (3)将DNA粗提取物溶于2mol·L-1的NaCl溶液中，加入 试剂，在 条件下进行鉴定。 (4)DNA鉴定结果如图2所示。据图2分析，相同温度条件下， 的DNA粗提取含量最高。同种实验材料在 ℃条件下DNA粗提取含量更高，其原因可能是 （从酶的角度作答）。 23．科研团队发现，从某植物细胞中提取的一种蛋白质A对治疗糖尿病效果良好。该团队欲运用生物工程技术生产蛋白质A作为治疗糖尿病的临床药物。设计方案1：利用植物细胞工程技术；方案2：利用基因工程制备大肠杆菌工程菌，再结合发酵工程批量生产蛋白质A．回答下列问题： (1)蛋白质A在某植物生长、发育的各个阶段都有合成，推测其最可能是植物的 （填“初生”或“次生”）代谢产物。利用植物细胞工程获取蛋白质A的过程是 。 (2)方案2中，研究人员根据蛋白质A的氨基酸序列人工合成的DNA片段碱基排列顺序不唯一，原因是 ，该方法得到的DNA序列还需添加 （元件名称）。也可用PCR技术从植物细胞中扩增出蛋白质A的基因，该技术的原理是 。 (3)下图、表为制备大肠杆菌工程菌时所使用的质粒、目的基因及其相关限制酶识别序列和切割位点，其中LacZ基因表达的产物可将无色物质X-gal转变为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色。 注：Neo基因为卡那霉素抗性基因。 限制酶 BamHI XmaI EcoRI SmaI Sau3AI 识别序列和切割位点 ①为将目的基因准确插入质粒中，应选用 酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和质粒需使用 （填“T4”“E。coli”或“T4或E。coli”）DNA连接酶处理，才能得到重组质粒。重组质粒用Sau3AⅠ和EcoRⅠ双酶切割后通过电泳分离可得到 个条带（不考虑切割的条带同等大小）。 ②筛选出成功导入重组质粒的受体菌的思路是 。 (4)在加入发酵罐前应该先对选育的大肠杆菌菌种进行 。若该大肠杆菌是通过引入信号肽改造过的工程菌，可以将蛋白质A分泌出细胞，则与方案1相比，方案2的优点有 （答出1点即可）。 24．根据基因工程的有关知识，回答下列问题。 (1)限制酶切割DNA分子后产生的片段，其末端形式有 和 。 (2)质粒用EcoRⅠ切割后产生的片段如下： AATTC……G G……CTTAA 为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA片段除可用EcoRⅠ切割外，还可用其他限制酶切割，“其他限制酶”必须具有的特点是 。 (3)实际操作中，往往用EcoRⅠ和另一种限制酶同时切割质粒和外源DNA分子，其优点在于可防止 。 (4)按其来源不同，基因工程中常常使用的DNA连接酶有两类，即 DNA连接酶和 DNA连接酶。 (5)基因工程中除质粒外， 和 也可作为载体。质粒中通常含有特殊的标记基因，这些标记基因的作用是 。 25．“基因编辑婴儿”露露和娜娜的诞生引发了巨大的争议。基因编辑技术能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对基因中特定DNA片段的敲除、加入等。请回答下列有关问题： (1)露露和娜娜的诞生借助了试管婴儿技术，包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术。精子需经过 处理才能与发育至 期的卵子结合形成受精卵。 (2)露露和娜娜的CCR5基因中被敲除了32个碱基对，使得T细胞不能正常表达某种膜蛋白，从而使HIV无法识别并攻击T细胞。敲除CCR5基因中32个碱基对，类似于 酶的作用，敲除后产生的DNA片段末端通常有两种形式即 ，并通过 酶连接起来。 (3)基因编辑技术引起的变异属于 。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司1 / 14 学科网（北京）股份有限公司 $$