第3章 基因工程【单元卷·考点卷】（4大考点）-2024-2025学年高二生物单元速记·巧练（人教版2019选择性必修3）

第3章 基因工程 （考情速览+考点直击+考试提升） 考情揭秘 素养点击 基本考查点 1.基因工程的基本工具、DNA 的粗提取与鉴定 2.PCR扩增的原理及过程、基因工程的操作程序 3.基因工程的应用 4.蛋白质工程的基本思路 1.考点1：科学思维:学会选择合适的展制酶切割质粒和目的基因；科学探究: DNA 的粗提取与鋈定的原理、过程及结果分析； 2.考点2：科学思维:比较DNA 复制和PCR技术异同,以及受体细胞不同采用不同的导入方法，训练比较与归纳思维；科学探究：不同体系下PCR的最适反应条件以及电泳结果的分析；社会责任：体会实施基因工程操作程序时科学技术的发展带来的社会进步； 3.考点3在高考中的命题情境新颖,大多来自大学教材和最新的论文文献,考查基因工程在科学前沿中的最新应用。试题可能涉及生命观念、科学思维、科学探究以及社会责任等生物学学科素养； 4.考点4经常以最新科研成果为背景,综合考查蛋白质工程与基因工程,体现对生命观念、科学思维、社会责任等核心素养的综合考查。 热点及难点 1.结合基因工程的过程对重组DNA技术的基本工具进行考查既是热点也是难点。另外DNA的粗提取相关过程的操作和目的也是考查热点； 2.以最新科研成果为载体,综合考查基因工程的操作步骤。PCR过程中引物选择和电泳结果过程分析； 4.常与本章第2节内容结合在一起，以基因工程在某方面的应用为背景考查基因工程的操作程序； 5.综合考查蛋白质工程与基因工程的应用。 高考中考查形式及地位 1.高考常以最新科研成果为背景结合基因工程的操作程序与应用,以非选择题的形式呈现,其中限制酶和质粒的相关知识有时也以选择题形式单独考查； 2.在分省命题中考查形式多样,既可单独命题,又可结合其他知识跨章节、跨模块综合命题,如与遗传规律、微生物的培养、细胞工程、胚胎工程、免疫学知识等联系起来,综合考查学生解决实际问题的能力； 3.考点3和4以非选择题为主； 考点一、基因工程的基本工具、DNA 的粗提取与鉴定 1．某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【答案】B 【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。 【详解】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误； C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确； D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 2．某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 【答案】C 【分析】DNA连接酶： （1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。 （2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误； B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误； C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确； D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 3．下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 4．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误； D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 考点二、PCR扩增的原理及过程、基因工程的操作程序 5．（不定项）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】AC 【分析】1、PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。 【详解】A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确； B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误； C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确； D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 6．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 7．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 【答案】6．D 7．B 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 6．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 7．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。 8．为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 (2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。 A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在 30s~2min的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。 （2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 9．研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 黏性末端的种类 基因工程的工具 BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序 抗生素筛选 目的基因的检测与鉴定 重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-ATTG3'和5'-AAAC-3'。 （2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 （3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 10．大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据上图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeI和XbaI，原因是 。 (3)将重组表达载体转入农杆菌后，需利用 技术在分子水平上检测目的基因转入是否成功。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接） (3) PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【分析】基因工程技术的步骤： ①目的基因的获取，主要有三种方法：基因文库、PCR技术扩增、人工合成； ②基因表达载体构建，表达载体组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因； ③目的基因导入受体细胞，动物细胞（受体）采用显微注射技术导入，植物细胞（受体）采用农杆菌转化法或基因枪法或花粉管通道法导入，微生物细胞（受体）采用感受态细胞法导入； ④目的基因检测与鉴定，采用分子检测、个体生物学水平鉴定。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 （2）根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 （3） 在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 （4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 11．某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。 (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。 【答案】(1) 变性 氢键 (2) 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶 (3) 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒 (4)甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 PCR过程打开成为单链的阶段 PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段 PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中变性时高温解旋，DNA双链打开成为单链的阶段是变性 双酶切的优点 基因工程的基本工具 双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化 感受态细胞的特点 目的基因导入受体细胞的方法 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。 （2）构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4DNA连接酶连接。 （3）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒 考点三、基因工程的应用 1．新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可） 【答案】(1) 水稻胚乳细胞 终止转录 HindIII EcoRI (2) 农杆菌转化 r2HNmRNA 抗原抗体杂交 (3) 1/4 纯合体自交后代不发生性状分离 (4) 体液 细胞 (5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的类型的判断 启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动转录 载体中可人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。 将r2HN基因导入水稻愈伤组织的方法 可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞 水稻是植物细胞，可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞；可利用显微注射技术将目的基因导入动物细胞 病毒进入体内发生的免疫 特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫 根据图示，抗体和T细胞的数量都增加了，说明病毒进入体内既引发了体液免疫又引发了细胞免疫 （2）逻辑推理与论证： 【详解】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在水稻胚乳中特异性表达的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcoRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HNmRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。 （4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 （5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。 2．为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【分析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图可知，PCR扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F和E-R。 【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增，根据扩增产物相对的分子质量的大小判断大肠杆菌中是否导入pET-SOD-ELP50。由于ELP50中含有重复序列，使用E-F或E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 考点四、蛋白质工程的基本思路 1．水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题: (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路 。 【答案】(1) 氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性 (2) 从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA双链复制 (3) 种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间 【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列； 2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。 【详解】（1）据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。 （2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。 （3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。 （4）为比较不同物质的抗凝血活性差异，可以设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间，凝血时间越长，抗凝血 活性越高。 2．将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是 。 (2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是 。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是 和 。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 【答案】(1) 除去蛋白质杂质 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA (2) PCR技术扩增 人工合成 (3) RNA聚合酶识别并结合的部位 增强目的基因的表达 (4)HygBR (5) F3 R2 (6)D 【分析】（1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶 酶具有专一性 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精 DNA在冷酒精中溶解度较低 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质。研磨液中的SDS能使蛋白质变性，因此无需担心DNA酶水解DNA。但即使有蛋白质变性剂使蛋白质变性改变其理化性质，仍然有可溶性、不溶性的蛋白质杂志通过沉淀、过滤等物理方式难以去除，因此为了获得较纯的DNA，保证提取的DNA作为PCR模板的品质，需要加入蛋白酶。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。 （2）本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是增强目的基因的表达。 （4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。 （6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。 ABC不符合题意，D符合题意。 1．研究表明，DNA 连接酶能够封闭DNA双螺旋骨架上的切口（图a），却无法封闭缺口（图b ），下列相关叙述，正确的是（　　） A．DNA 连接酶的封闭是指催化核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成 B．DNA 单链发生缺失，在DNA 聚合酶作用下沿缺口3'→5'方向修复 C．DNA 连接酶可以将来源不同的DNA片段拼接成新的 DNA 分子 D．DNA 连接酶封闭切口时，需要识别DNA 片段特定的核苷酸序列 【答案】C 【分析】基因工程的工具： (1)限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二 酯键断裂。 (2)DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。DNA连接酶和DNA聚合酶的区别： ①DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上， 形成磷酸二酯键； ②DNA连接酶是同时连接双链的切口，而DNA聚合酶只是在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来； ③DNA连接酶不需要模板，而DNA聚合酶需要模板。 (3)运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】A、DNA连接酶的封闭是指催化脱氧核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成，A错误； B、DNA单链发生缺失，在DNA聚合酶作用下沿缺口5'→3'方向修复，B错误； C、DNA分子的空间结构都是相同的， 所以DNA连接酶可以将来源不同的DNA片段拼接成新的DNA分子，形成重组DNA，C正确； D、DNA连接酶封闭切口时，不需要识别DNA片段特定的核苷酸序列，D错误。 2．BamHI、MboI、SmaI三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5'-G↓GATCC-3'、5'↓GATC-3'、5′-CCC↓GGG-3'。下图表示某DNA片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（    ） A．若用SmaI完全切割该DNA，则其产物的长度为634bp、896bp、758bp B．若虚线方框内的碱基对被T-A替换，则用SmaI完全切割该DNA可产生3种片段 C．若用MboI和BamHI切割DNA，可形成相同的黏性末端 D．用SmaI切割DNA产生的片段，可用E．coliDNA连接酶重新将其连接 【答案】C 【分析】在基因工程中，限制性内切酶作用对象是磷酸二酯键，能识别DNA中特定的碱基序列并在特定的位置将DNA双链切开成为DNA片段；而DNA连接酶将双链的DNA分子连接，作用对象是磷酸二酯键。 【详解】A、限制酶SmaⅠ的酶切位点是5′-CCC↓GGG-3'，在图1中有两个限制酶SmaⅠ的酶切位点，DNA将被切割成三个片段，结合图解，三个片段的长度分别是637bp、890bp、761bp，A错误； B、发生碱基对替换后，基因中只有一个限制酶SmaⅠ酶切位点，用SmaI完全切割后出现长度分别是634+896-3=1527bp、761bp的两种片段，B错误； C、由题可知，MboI和BamHI识别序列的中间序列相同，因此若用MboI和BamHI切割DNA，可形成相同的黏性末端，C正确； D、用SmaI切割DNA产生的片段产生的是平末端，E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，D错误。 3．某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用a酶切割，把得到的产物用b酶切割，得到的DNA片段大小如下表所示。a酶和b酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法错误的是（　　） a酶切割产物（ bp） b酶再次切割产物（ bp） 2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；300；200 A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列均为3个 B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接 C．限制酶将一个DNA分子切成两个片段需要消耗两个水分子 D．用a酶切割与线性DNA分子具有相同碱基序列的质粒，一定能得到4种切割产物 【答案】D 【分析】分析题图：a酶和b酶识别的脱氧核苷酸序列不同，但切割后产生的黏性末端相同。分析表格：a酶可以把原有DNA切成4段，说明有该DNA分子上有3个切口，即a酶的识别序列有3个；b酶把大小是2100的DNA切成大小分别为1900和200两个片段，把大小是1400的DNA切成大小分别为800和600两个片段，把大小是500的DNA切成大小分别为200和300两个片段且a酶和b酶的识别位点不同，说明b酶的识别序列有3个。 【详解】A、a酶可以把原有DNA切成4段，说明有该DNA分子上有3个切口，即a酶的识别序列有3个；b酶把大小是2100的DNA切成大小分别为1900和200两个片段，把大小是1400的DNA切成大小分别为800和600两个片段，把大小是500的DNA切成大小分别为200和300两个片段且a酶和b酶的识别位点不同，说明b酶的识别序列有3个，A正确； B、由图可以看出a酶和b酶切割后产生的黏性末端相同，它们之间能相互连接，B正确； C、DNA分子是双链结构，限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需断裂两个磷酸二酯键消耗两个水分子，C正确； D、质粒是环状DNA分子，与线性DNA相同碱基序列的质粒含有3个a酶的切割位点，则其被a酶切割后可以得到3种切割产物，而不是4种，D错误。 4．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR 4个基因分别编码4种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述不正确的是（　　） A．OsGLO1启动子启动转录的方向与其他两个基因不同 B．应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 C．可用抗原—抗体杂交技术检测4种酶在转基因水稻中的表达量 D．插入的4个基因以DNA的同一条单链为模板进行转录 【答案】D 【分析】1、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 2、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 【详解】AD、由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，故四个基因转录时不都以DNA的同一条单链为模板，A正确，D错误； B、据图可知，卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，B正确； C、可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，C正确。 5．水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。斑马鱼的肌细胞、生殖细胞等均存在E物质受体，且幼体透明。将绿色荧光蛋白（GFP）基因、Ga14蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是（    ） A．基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵 B．E物质-受体复合物可直接促进GFP基因的转录和翻译过程 C．用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的 D．在被雌激素类物质污染的河水中该种斑马鱼的幼体会显绿色 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵，受精卵全能性高，基因成功表达的概率大，A正确； B、E物质一受体复合物通过激活启动子直接进GFP基因的转录过程，不能促进翻译过程，B错误； C、用于监测 E 物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的，避免因有性生殖带来的基因污染，C正确； D、在被雌激素类物质污染的河水中，雌激素类物质（E物质）能够与相应的受体结合形成E物质一受体复合物，促进了FFP基因的表达，则该种斑马鱼的幼体会显绿色，D正确。 6．常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列叙述错误的是（    ） A．启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游 B．细胞分化与组织特异性启动子的调控有关，与组成型启动子无关 C．乳腺生物反应器的构建需要将组织特异性启动子与目的基因连接 D．盐诱导型启动子在高盐环境中被激活，可增加农作物的抗逆性 【答案】B 【分析】动物基因工程的应用：培育快速生长的转基因动物，如转基因绵羊、转基因鲤鱼；改善畜产品品质的转基因动物，如乳汁中含乳糖较少的转基因牛；生产药物的转基因动物，如利用乳腺生物反应器生产药物；作器官移植供体的转基因动物，如无免疫排斥的转基因猪。 【详解】A、启动子是基因上的RNA聚合酶结合位点，其本质是是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，A正确； B、根据题干信息“组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达”，所以在细胞分化过程中，与组成型启动子有关，B错误； C、组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，而乳腺生物反应器需要将组织特异性启动子与目的基因连接，导入细胞中，保证基因在乳腺细胞中表达，C正确； D、根据题干信息：诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高，而盐诱导型启动子在高盐环境中被激活，可增加农作物的抗逆性，D正确。 7．T4溶菌酶耐热性差，若将该酶的第3位氨基酸进行改造（如图所示），并使第3位氨基酸和第97位氨基酸之间形成1个二硫键，可以大大提高其耐热性。下列叙述错误的是（    ） A．根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可推测出多种脱氧核苷酸序列 B．T4溶菌酶耐热性提高的原因是其氨基酸的种类和数量均发生改变 C．改造T4溶菌酶可利用基因定点突变技术，对相关基因进行改造 D．改造后的T4溶菌酶需要进行功能鉴定才能应用于生产实践 【答案】B 【分析】蛋白质工程，即以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、由于一种氨基酸可能对应多种密码子，因此根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可能推测出多种脱氧核苷酸序列，A正确； B、根据题意“科学家通过相关研究，最终使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸”可知，T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和排列顺序发生了改变，而氨基酸的数量没变，B错误； C、根据题意，改造T4溶菌酶可以从合成蛋白质的基因进行改造，因此可利用基因定点突变技术，对相关基因进行改造，C正确； D、该实例将蛋白质进行了改造，属于蛋白质工程的范畴，T4溶菌酶本质为蛋白质，可利用抗原—抗体特异性结合的特点对该酶进行检测，D正确。 8．胰岛素在高浓度时以二聚体的形式存在，若将其B链第28位的脯氨酸改为赖氨酸，第29位的赖氨酸改为脯氨酸，通过对胰岛素结构的这种“小改”可以获得单体速效胰岛素。用蛋白质工程设计速效胰岛素的过程如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．蛋白质工程可生产出自然界从来没有过的蛋白质 B．构建新的胰岛素模型的主要依据是胰岛素的预期功能 C．可通过改变基因的局部碱基序列对胰岛素结构进行“小改” D．新的胰岛素基因直接导入大肠杆菌中即能表达出速效胰岛素 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质，这些蛋白质是自然界从来没有过的蛋白质，A正确； B、构建新的胰岛素模型的思路：从预期的胰岛素功能出发→设计预期的胰岛素结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得预期的胰岛素，B正确； C、依题意，若将胰岛素B链第28位的脯氨酸改为赖氨酸，第29位的赖氨酸改为脯氨酸，可以获得单体速效胰岛素。据此可推断，可通过改变相应的基因的局部碱基序列对胰岛素结构进行“小改”，C正确； D、新的胰岛素基因与载体构建成基因表达载体，再导入大肠杆菌中表达，D错误。 9．抗体的结构可分为可变区和恒定区，其中可变区决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。根据这一结构特点，研究人员通过改造获得了一种“人鼠嵌合抗体”，其结构如图所示，这一技术可减弱人对小鼠单克隆抗体的免疫反应。下列有关叙述错误的是（    ） A．通过对抗体进行改造以生产人鼠嵌合抗体，属于蛋白质工程 B．人鼠嵌合抗体基因由人抗体的恒定区基因与鼠抗体的可变区基因组成 C．为获得结构正确的嵌合抗体，通常不宜选用大肠杆菌作为受体细胞 D．获得人鼠嵌合抗体的过程中，难度最大的是找到并改变相对应的基因 【答案】D 【分析】蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。蛋白质工程是指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、人鼠嵌合抗体是自然界不存在的蛋白质，是一种新的蛋白质，通过蛋白质工程制造出来的，A正确； B、由图可知，人鼠嵌合抗体由人抗体恒定区和鼠抗体的可变区组成，因此人鼠嵌合抗体基因由人抗体的恒定区基因与鼠抗体的可变区基因组成，大肠杆菌为原核生物，B正确； C、抗体属于分泌蛋白，需要内质网和高尔基体的加工，大肠杆菌为原核生物，不能对抗体进行加工，因此通常不宜选用大肠杆菌作为受体细胞，C正确； D、蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂，获得人鼠嵌合抗体的过程中，难度最大的是明确蛋白质复杂的高级结构，D错误。 10．研究人员利用农杆菌转化法将海岛棉中抗草铵膦除草剂基因 Bar导入陆地棉中，经培养筛选获得抗草铵膦除草剂的棉花。回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因的前提是 。扩增Bar基因，需要设计 种引物，扩增3次需要 对引物。 (2)图1质粒中TetR基因的作用是 ，与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是 （答出两点）。 (3)Bar 基因缺少限制酶的识别序列，为确保目的基因正确连接到质粒上，需要在引物的 端添加限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，Bar 基因的碱基序列和限制酶的识别序列如图1所示，则扩增 Bar基因时所用的引物碱基序列为 （写出引物5'端的前8个碱基）。 (4)培育转基因棉花的过程中，除了利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，还可利用 法。检测 Bar基因是否在陆地棉细胞中翻译常利用 技术。 (5)提取 T₁ 代转基因棉花的基因组 DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的 DNA样品进行检测，结果如图2所示。在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与 （答出两点）有关。为筛选出符合育种目标的植株，还需检测编号为 的转基因棉花的草铵膦除草剂的抗性。 注：M：Marker；1：水对照；2： Bar基因阳性对照；3：野生型对照；4~11：T₁代转基因棉花样品。 (6)将抗草铵膦除草剂的某转基因植株自交一代，发现其后代大约有 1/4的个体不具有草铵膦除草剂的抗性，其原因是 。 【答案】(1) 已知目的基因两端的核苷酸序列 2 7 (2) 便于重组DNA分子的筛选 防止目的基因和质粒自身环化，防止目的基因反向接入质粒 (3) 5' 5'-GAATTCAT-3'、5'-GGATCCCT-3'   (4) 花粉管通道 抗原—抗体杂交 (5) 凝胶的浓度和DNA分子的构象 4、5、7、8、10、11 (6)抗草铵膦除草剂（Bar）基因只插入到受体细胞的一条染色体DNA上，亲代产生的未导入Bar基因的配子受精 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸；转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过 【详解】（1）利用PCR扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因两端的核苷酸序列，据此可以设计引物。扩增Bar基因，需要设计2种引物，分别与模板DNA的两条链的3’端进行配对，扩增3次形成23=8个DNA分子，每个DNA分子有2条链，其中只有原来的模板链不带有引物，因此该过程中需要23×2-2=14个引物，即7对引物。 （2）图1质粒中TetR基因的作用是作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选，与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是防止目的基因和质粒自身环化，防止目的基因反向接入质粒，进而可能影响基因表达产物的形成。 （3）Bar 基因缺少限制酶的识别序列，为确保目的基因正确连接到质粒上，需要在引物的5’端添加限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，Bar 基因的碱基序列和限制酶的识别序列如图1所示，根据碱基互补配对原则以及引物配对的位置可以分析出扩增 Bar基因时所用的引物碱基序列为5'-GAATTCAT-3'、5'-GGATCCCT-3'。 （4）培育转基因棉花的过程中，除了利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，还可利用花粉管通道法，我国抗虫棉的培育就是用该技术进行了转基因过程。检测 Bar基因是否在陆地棉细胞中翻译常利用抗原—抗体杂交技术，该技术的原理是抗原、抗体特异性结合。 （5）提取 T₁ 代转基因棉花的基因组 DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的 DNA样品进行检测，结果如图2所示。在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与凝胶的浓度和DNA分子的构象有关。通过比对可以发现，4、5、7、8、10、11中含有抗除草剂的基因，为了检测抗性个体是否表现出相应的性状，还需检测编号为4、5、7、8、10、11转基因棉花的草铵膦除草剂的抗性。 （6）将抗草铵膦除草剂的某转基因植株自交一代，发现其后代大约有 1/4的个体不具有草铵膦除草剂的抗性，这是因为该抗性植株相当于杂合子，其自交会发生性状分离，即抗草铵膦除草剂（Bar）基因只插入到受体细胞的一条染色体DNA上（为杂合子），亲代产生的未导入Bar基因的配子受精进而产生了不具有抗性的植株。 11．某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。 【答案】(1) 磷酸二酯键 保证片段甲含有N基因启动子、N基因、N基因终止子 (2)C-G、A-T、U-A (3) 菌株B2的基因组 无法扩增出目的产物 (4)不污染环境、增加土壤养分 【分析】信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对 RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C 向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A 利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆 产生废气少，分解后剩余的无机盐留在土壤中 不污染环境、增加土壤养分 【详解】（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，保证片段甲含有N基因启动子、N基因、N基因终止子，保证N基因正常发表达。 （2）RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。 （3）用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2的基因组中N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出目的产物。 （4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。 12．人体内的t-PA蛋白能高效降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程t-PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与血纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。 (1)制造该性能优异t-PA突变蛋白的过程称为 工程。 (2)高纯度的DNA模板是成功扩增目的基因的前提条件之一，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除蛋白质，原因是_____。 A．蛋白质空间结构容易破坏 B．氨基酸容易高温脱氨基 C．DNA氢键容易断裂和恢复 D．DNA和蛋白质可以碱基配对 (3)已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链（作为模板指导RNA合成的链）序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此突变基因编码该氨基酸的模板链序列应设计为 。 (4)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶 和 切开，才能与t-PA突变基因高效连接，在连接时需要用到 酶。 (5)应选择在加入新霉素的培养基中 （能/不能）生存并形成菌落的大肠杆菌作为受体细胞，将目的基因导入受体细胞，放在含新霉素的培养基中培养，选择呈 色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。 【答案】(1)蛋白质 (2)AC (3)AGA (4) XmaI BglII DNA连接 (5) 不能 白 【分析】基因工程的基本操作步骤：获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→得到转基因生物→目的基因检测与鉴定。蛋白质工程可以通过基因修饰或基因合成，对现有的蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】（1）制造该性能优异t-PA突变蛋白的过程涉及基因工程和基因改造，最终得到所需要的蛋白质，属于蛋白质工程的内容。 （2）蛋白质和DNA的空间结构在高温下都会被破坏，但DNA中的氢键断裂后再缓慢降低温度，其氢键可恢复，而蛋白质的空间结构不能恢复，因此可用高温处理的方法去除蛋白质，AC正确。 故选AC。 （3）因为制造性能优异的t-PA突变蛋白，是将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的编码序列(即模板链的互补链序列)为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此突变基因编码该氨基酸的编码序列应设计为AGA。 （4）如图所示，由于目的基因的两端的碱基序列分别是CCGG、CTAG，所以应用Xmal和BglI两种限制酶切割，以便于把目的基因连接到质粒pCLY11上，在连接时需要用到DNA连接酶。 （5）由于质粒上以新霉素抗性基因作为标记基因，所以选择不能在加入新霉素的培养基中生存并形成菌落的大肠杆菌作为受体细胞，以便筛选出导入质粒pCLY11的大肠杆菌。重组质粒的mlacZ序列被破坏，表达产物使细胞呈白色，故在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞需选择呈白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。 学科网（北京）股份有限公司1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第3章 基因工程 （考情速览+考点直击+考试提升） 考情揭秘 素养点击 基本考查点 1.基因工程的基本工具、DNA 的粗提取与鉴定 2.PCR扩增的原理及过程、基因工程的操作程序 3.基因工程的应用 4.蛋白质工程的基本思路 1.考点1：科学思维:学会选择合适的展制酶切割质粒和目的基因；科学探究: DNA 的粗提取与鋈定的原理、过程及结果分析； 2.考点2：科学思维:比较DNA 复制和PCR技术异同,以及受体细胞不同采用不同的导入方法，训练比较与归纳思维；科学探究：不同体系下PCR的最适反应条件以及电泳结果的分析；社会责任：体会实施基因工程操作程序时科学技术的发展带来的社会进步； 3.考点3在高考中的命题情境新颖,大多来自大学教材和最新的论文文献,考查基因工程在科学前沿中的最新应用。试题可能涉及生命观念、科学思维、科学探究以及社会责任等生物学学科素养； 4.考点4经常以最新科研成果为背景,综合考查蛋白质工程与基因工程,体现对生命观念、科学思维、社会责任等核心素养的综合考查。 热点及难点 1.结合基因工程的过程对重组DNA技术的基本工具进行考查既是热点也是难点。另外DNA的粗提取相关过程的操作和目的也是考查热点； 2.以最新科研成果为载体,综合考查基因工程的操作步骤。PCR过程中引物选择和电泳结果过程分析； 4.常与本章第2节内容结合在一起，以基因工程在某方面的应用为背景考查基因工程的操作程序； 5.综合考查蛋白质工程与基因工程的应用。 高考中考查形式及地位 1.高考常以最新科研成果为背景结合基因工程的操作程序与应用,以非选择题的形式呈现,其中限制酶和质粒的相关知识有时也以选择题形式单独考查； 2.在分省命题中考查形式多样,既可单独命题,又可结合其他知识跨章节、跨模块综合命题,如与遗传规律、微生物的培养、细胞工程、胚胎工程、免疫学知识等联系起来,综合考查学生解决实际问题的能力； 3.考点3和4以非选择题为主； 考点一、基因工程的基本工具、DNA 的粗提取与鉴定 1．某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 2．某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 3．下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 4．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 考点二、PCR扩增的原理及过程、基因工程的操作程序 5．（不定项）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 6．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 7．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 8．为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 (2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。 A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 9．研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 10．大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据上图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeI和XbaI，原因是 。 (3)将重组表达载体转入农杆菌后，需利用 技术在分子水平上检测目的基因转入是否成功。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 11．某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。 (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。 考点三、基因工程的应用 1．新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可） 2．为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 考点四、蛋白质工程的基本思路 1．水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题: (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路 。 2．将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是 。 (2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是 。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是 和 。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 1．研究表明，DNA 连接酶能够封闭DNA双螺旋骨架上的切口（图a），却无法封闭缺口（图b ），下列相关叙述，正确的是（　　） A．DNA 连接酶的封闭是指催化核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成 B．DNA 单链发生缺失，在DNA 聚合酶作用下沿缺口3'→5'方向修复 C．DNA 连接酶可以将来源不同的DNA片段拼接成新的 DNA 分子 D．DNA 连接酶封闭切口时，需要识别DNA 片段特定的核苷酸序列 2．BamHI、MboI、SmaI三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5'-G↓GATCC-3'、5'↓GATC-3'、5′-CCC↓GGG-3'。下图表示某DNA片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（    ） A．若用SmaI完全切割该DNA，则其产物的长度为634bp、896bp、758bp B．若虚线方框内的碱基对被T-A替换，则用SmaI完全切割该DNA可产生3种片段 C．若用MboI和BamHI切割DNA，可形成相同的黏性末端 D．用SmaI切割DNA产生的片段，可用E．coliDNA连接酶重新将其连接 3．某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用a酶切割，把得到的产物用b酶切割，得到的DNA片段大小如下表所示。a酶和b酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法错误的是（　　） a酶切割产物（ bp） b酶再次切割产物（ bp） 2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；300；200 A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列均为3个 B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接 C．限制酶将一个DNA分子切成两个片段需要消耗两个水分子 D．用a酶切割与线性DNA分子具有相同碱基序列的质粒，一定能得到4种切割产物 4．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR 4个基因分别编码4种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述不正确的是（　　） A．OsGLO1启动子启动转录的方向与其他两个基因不同 B．应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 C．可用抗原—抗体杂交技术检测4种酶在转基因水稻中的表达量 D．插入的4个基因以DNA的同一条单链为模板进行转录 5．水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。斑马鱼的肌细胞、生殖细胞等均存在E物质受体，且幼体透明。将绿色荧光蛋白（GFP）基因、Ga14蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是（    ） A．基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵 B．E物质-受体复合物可直接促进GFP基因的转录和翻译过程 C．用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的 D．在被雌激素类物质污染的河水中该种斑马鱼的幼体会显绿色 6．常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列叙述错误的是（    ） A．启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游 B．细胞分化与组织特异性启动子的调控有关，与组成型启动子无关 C．乳腺生物反应器的构建需要将组织特异性启动子与目的基因连接 D．盐诱导型启动子在高盐环境中被激活，可增加农作物的抗逆性 7．T4溶菌酶耐热性差，若将该酶的第3位氨基酸进行改造（如图所示），并使第3位氨基酸和第97位氨基酸之间形成1个二硫键，可以大大提高其耐热性。下列叙述错误的是（    ） A．根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可推测出多种脱氧核苷酸序列 B．T4溶菌酶耐热性提高的原因是其氨基酸的种类和数量均发生改变 C．改造T4溶菌酶可利用基因定点突变技术，对相关基因进行改造 D．改造后的T4溶菌酶需要进行功能鉴定才能应用于生产实践 8．胰岛素在高浓度时以二聚体的形式存在，若将其B链第28位的脯氨酸改为赖氨酸，第29位的赖氨酸改为脯氨酸，通过对胰岛素结构的这种“小改”可以获得单体速效胰岛素。用蛋白质工程设计速效胰岛素的过程如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．蛋白质工程可生产出自然界从来没有过的蛋白质 B．构建新的胰岛素模型的主要依据是胰岛素的预期功能 C．可通过改变基因的局部碱基序列对胰岛素结构进行“小改” D．新的胰岛素基因直接导入大肠杆菌中即能表达出速效胰岛素 9．抗体的结构可分为可变区和恒定区，其中可变区决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。根据这一结构特点，研究人员通过改造获得了一种“人鼠嵌合抗体”，其结构如图所示，这一技术可减弱人对小鼠单克隆抗体的免疫反应。下列有关叙述错误的是（    ） A．通过对抗体进行改造以生产人鼠嵌合抗体，属于蛋白质工程 B．人鼠嵌合抗体基因由人抗体的恒定区基因与鼠抗体的可变区基因组成 C．为获得结构正确的嵌合抗体，通常不宜选用大肠杆菌作为受体细胞 D．获得人鼠嵌合抗体的过程中，难度最大的是找到并改变相对应的基因 10．研究人员利用农杆菌转化法将海岛棉中抗草铵膦除草剂基因 Bar导入陆地棉中，经培养筛选获得抗草铵膦除草剂的棉花。回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因的前提是 。扩增Bar基因，需要设计 种引物，扩增3次需要 对引物。 (2)图1质粒中TetR基因的作用是 ，与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是 （答出两点）。 (3)Bar 基因缺少限制酶的识别序列，为确保目的基因正确连接到质粒上，需要在引物的 端添加限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，Bar 基因的碱基序列和限制酶的识别序列如图1所示，则扩增 Bar基因时所用的引物碱基序列为 （写出引物5'端的前8个碱基）。 (4)培育转基因棉花的过程中，除了利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，还可利用 法。检测 Bar基因是否在陆地棉细胞中翻译常利用 技术。 (5)提取 T₁ 代转基因棉花的基因组 DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的 DNA样品进行检测，结果如图2所示。在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与 （答出两点）有关。为筛选出符合育种目标的植株，还需检测编号为 的转基因棉花的草铵膦除草剂的抗性。 注：M：Marker；1：水对照；2： Bar基因阳性对照；3：野生型对照；4~11：T₁代转基因棉花样品。 (6)将抗草铵膦除草剂的某转基因植株自交一代，发现其后代大约有 1/4的个体不具有草铵膦除草剂的抗性，其原因是 。 11．某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。 12．人体内的t-PA蛋白能高效降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程t-PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与血纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。 (1)制造该性能优异t-PA突变蛋白的过程称为 工程。 (2)高纯度的DNA模板是成功扩增目的基因的前提条件之一，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除蛋白质，原因是_____。 A．蛋白质空间结构容易破坏 B．氨基酸容易高温脱氨基 C．DNA氢键容易断裂和恢复 D．DNA和蛋白质可以碱基配对 (3)已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链（作为模板指导RNA合成的链）序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此突变基因编码该氨基酸的模板链序列应设计为 。 (4)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶 和 切开，才能与t-PA突变基因高效连接，在连接时需要用到 酶。 (5)应选择在加入新霉素的培养基中 （能/不能）生存并形成菌落的大肠杆菌作为受体细胞，将目的基因导入受体细胞，放在含新霉素的培养基中培养，选择呈 色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。 学科网（北京）股份有限公司1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$