1.2.1 微生物的基本培养技术-2024-2025学年高二生物同步高效教学课件（人教版2019选择性必修3）

1.2 微生物的培养技术及应用 高压蒸汽灭菌 液体培养基 首先酸奶制作所用的容器要进行消毒晾干后使用，避免酸奶制作过程中混入杂菌； 其次，准备好菌种，最好是纯的乳酸菌菌种； 再有就是接种时要在无菌条件下操作，所用搅拌器要经过消毒灭菌等。 从社会中来 在经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。 一般家庭自制酸奶可能会导致肠胃不适，主要原因是有杂菌混入。 那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？ 无菌技术和微生物的培养技术 无细胞结构 原核细胞 真核细胞 真菌：酵母菌、毛霉等； 原生生物：草履虫、变形虫等 RAN病毒：SARS病毒、新冠病毒等； DNA病毒：噬菌体等 细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等； 放线菌：链霉菌等 微生物 个体微小、结构简单 杆菌 球菌 霍乱弧菌 葡萄球菌 螺旋菌 细菌的形态 微生物生长繁殖产生的菌落 沙门氏菌 毛霉 阅读教材P9-11，自主梳理下列问题对应的知识点（4分钟）读薄教材 1.在实验室培养微生物，需要？P9 2.培养基的作用？实验室最常用的培养基？P9 3.从物理性质方面，培养基分为？（二者区别）P9 从功能上分为？ 4.培养基的一般成分包括？P10 牛肉膏蛋白胨培养基中的牛肉膏提供的主 要营养是？蛋白胨提供的主要营养是？ 5.培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。如： 在培养乳酸菌、霉菌、细菌时，分别需要？P10 6.获得纯净的微生物培养物的关键是？消毒的概念、灭菌的概念 P10 7.消毒和灭菌工作主要包括哪两个方面？P10 8.做好消毒和灭菌工作后，要注意？为避免微生物污染，接下来的许多操 作都应该在哪里进行？P10 9.常用的消毒方法及处理对象？常用的灭菌方法及处理对象？P10 一 微生物的基本培养技术 ①要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件； ②要确保其他微生物无法混入。 1、在实验室培养微生物的要求: ——培养基 ——无菌技术 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质 1.概念： 3.分类：按照物理性质不同分为两类。 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 2.作用： 二、培养基 固体 培养基 液体 培养基 有无琼脂 分离、 计数、 鉴定等 扩大培养、 工业生产 长有酵母菌菌落 盛有液体培养基 仅做凝固剂，不能为微生物的生长提供能量和碳源。 固体培养基是实验室中最常用的培养基之一 划分依据 培养基种类 特点 用途 物理性质 化学成分 功能 不加凝固剂 加凝固剂，如琼脂 工业生产 观察微生物的运动、 分类鉴定 微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 培养基成分明确 分类、鉴定 在培养基中加入某种化学物质,依据微生物对某些物质的特殊需求或抗性 （选择性地让某菌生存） 培养、分离出特定微生物 在培养基中加入某种指示剂或化学药品,产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类微生物 选择培养基 液体培养基 半固体培养基 固体培养基 天然培养基 合成培养基 鉴别培养基 培养基的类型及用途 （拓展）选择培养基的类型 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化 伊红-亚甲蓝琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 伊红、亚甲蓝 出现金属光泽的深紫色菌落 刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后出现透明圈 油脂培养基 鉴别产脂肪酶菌株 食用油、吐温、中性红指示剂 由淡红色变成深红色 淀粉培养基 鉴别产淀粉酶菌株 可溶性淀粉 淀粉被分解后出现淀粉水解圈 酚红指示剂 鉴别分解尿素菌株 酚红 产生红色 （拓展）鉴别培养基的类型 培养基中加氨苄青霉素 具有抗氨苄青霉素能力的菌落 没有氨苄青霉素抗性的细菌 选择培养基 培养基+氨苄青霉素 培养基 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等 蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000ml 水 （1）基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐 4.营养组成： 思考：1、培养基中若没加有机碳源能用于培养什么代谢类型的微生物？ 2、没加有机氮源能呢？ 有机碳源： ⑴碳源 （提供碳元素） ⑵氮源 （提供氮元素） 为什么培养基需要氮源？ 氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质的元素。 无机碳源： CO2、CO32-、HCO3- 糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等 异养微生物 无机氮源： NH4＋、NO3-、NH3等 固氮微生物（也可用空气中的N2） 有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 功能：①提供无机营养 ② 调节PH ③ 维持渗透压 功能：①良好的溶剂 ②维持生物大分子结构的稳定 功能：①构成细胞物质和一些代谢产物 ②有机碳既是碳源又是能源 （1）基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐 自养微生物 （4）水 （3）无机盐 （2）特殊需求 额外满足微生物对 、 、 的需求。 特殊营养物质 pH O2 ④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。 ①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ； ②培养霉菌时，需要将培养基调至 ； ③培养细菌时，需要将培养基调至 ； 维生素 酸性 中性或弱碱性 无氧 维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 请思考以下几种微生物的营养和能量来源，并说出判断依据？ 思考讨论 微生物 碳源 氮源 能源 蓝细菌 硝化细菌 根瘤菌 大肠杆菌 CO2 NH4+、NO3-等 光能 CO2 NH3 NH3的氧化 糖类等有机物 N2 有机物 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物 光能自养 化能自养 异养、固氮菌 异养、非固氮 （1）同一种物质不能既做碳源又做氮源（ ） 有机碳源如糖类，可为异养生物提供碳源，也可提供能源 无机碳源如CO2，为自养型微生物提供碳源，但不能提供能量 牛肉膏或蛋白胨，可为异养微生物提供碳源和氮源 还可提供无机盐 （2）碳源都能提供能量（ ） （3）NaHCO3只能提供碳源（ ） （4）无机氮源也能提供能量（ ） NH3：既是硝化细菌的氮源，又是它的能源物质 1.判一判： × × × √ 2.(2021山东)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲，乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是（ ） A．甲菌属于解脂菌 B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力 B Not 唯一，因为乙能存活并形成菌落 3.下表表示某培养基的配方，下列叙述正确的是( ) A．从用途看，该培养基属于选择培养基 B．培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨 C．该培养基没有提供维生素等营养 D．该培养基调节到合适的pH后就可以接种使用 B 成分 蛋白胨 葡萄糖 <m></m> 伊红 亚甲蓝 蒸馏水 含量 <m></m> <m></m> <m></m> <m></m> <m></m> <m></m> 蛋白胨可以 调PH后灭菌 4．采用下表配方配制的培养液分离果胶酶产生菌时，该表X处的成分应 是________(填“葡萄糖”或“果胶”)，不选另一种成分的原因是 ________________________________________________。 K2HPO4 MgSO4 NaNO3 FeSO4 X H2O 0.1 g 0.5 g 3 g 0.01 g 2 g 加至1 L 大多数微生物以葡萄糖作为碳源，不具有选择作用 果胶 5.(全国Ⅰ，T37（2）)为了筛选可分解尿素的细菌,在配制培养基时,应选择 ______（填“尿素”“ <m></m> ”或“尿素 <m></m> ”）作为氮源,不选择其他 两组的原因是____________________________________________________ __ _____________________________________。 尿素 其他两组都含有 <m></m> ,能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用 <m></m> ,不能起筛选作用 【自主探究】请结合教材P10-11，思考下列问题： 1.获得纯净培养物的关键是什么？ 2.消毒和灭菌的区别是什么？ 3.为了防止杂菌污染，具体措施有哪些？（四个方面） 4.如何针对不同的作用对象选择合适的消毒/灭菌方法？ 讨论：无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？ 无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。 二 无菌技术 防止杂菌污染 消毒 VS 灭菌 ①消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 ②灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 -----与消毒最本质区别 ① 对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行 。 ② 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行 。 ③实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品 。 ④为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在： 。 清洁和消毒 灭菌 超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行 相接触 （1）消毒和灭菌工作主要包括以下几方面： 消毒和灭菌的原理都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。 （2）消毒和灭菌比较： 23 类型 适用范围 操作方法 消 毒 灭 菌 较为温和理化方法，杀死部分微生物。 强烈的理化方法，杀死所有微生物。 煮沸消毒 家庭餐具等生活用品 100℃煮沸5～6min 巴氏消毒 牛奶等不耐高温的液体 62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min 化学药剂 生物活体（皮肤、伤口）、水源等 擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源 紫外线 紫外线照射30min 灼烧灭菌 接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层（外焰）灼烧 干热灭菌 耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱,160～170℃ 加热2～3h 湿热灭菌 培养基及多种器材和物品 高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121 ℃,15～30min 接种室、接种箱，超净工作台 （迅速彻底） 相关信息P10：生物消毒法是指利用生物或其　 　　除去环境中的部分微生物的方法。 代谢物 原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性 优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的 某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。 对象：培养基等 注意：使用后的培养基必须灭菌 后才能丢弃，以免污染环境。 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15-30min 高压蒸汽灭菌锅 (1)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染(　　) (2)灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底(　　) (3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用干热灭菌法进行灭菌(　　) √ √ × 概念诊断 1．(2023·深圳光明区联考)某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的固体培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将5个手指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。下列相关叙述错误的是(　　) A．这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有培养皿和培养基等 B．“将手指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的接种 C．从实验结果来看，洗手后的操作不会污染培养基 D．培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的 C 2.(2023·湖北襄阳四校联考)微生物培养过程中，要重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，正确的是(　　) A.煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子 B.将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌 C.加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌 D.家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 B 3.下列有关无菌技术的说法，正确的是（ ） A.无菌技术的关键是杀灭实验室中的所有的微生物 B.培养微生物的试剂和器具都要进行湿热灭菌 C.经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，不能在常温下长期 　保存 D.无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌 C 4.关于消毒、灭菌的方法，下列描述错误的是（ ） A.接种用的无菌操作台要进行灭菌处理 B.用巴氏消毒法处理牛奶是因为高温易破坏牛奶的营养成分 C.煮沸半小时后的凉开水中可能仍含有部分芽孢和孢子 D.先喷洒消毒液，再用紫外线照射可增强消毒效果 A 三 微生物的纯培养 微生物纯培养的步骤 培养物： 纯培养物： 纯培养： 获得 的过程。 配制培养基 灭菌 接种 分离 培养等 在微生物学中，将接种于 内，在合适条件下形成的含 的群体。 由 所获得的微生物群体。 纯培养物 培养基 特定种类微生物 单一个体繁殖 酵母菌的纯培养 一个菌落是一个种群还是一个群落？ 实验原理： 菌落 P12：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。 鉴定菌种的重要依据： 形状、大小、隆起程度、颜色等菌落特征。 如何鉴定哪个菌落是酵母菌？ 问 获得单菌落的方法？ 问 ①平板划线法 ②稀释涂布平板法 微生物群 分散或稀释 单个细胞 单个菌落 繁殖 √ 湿润、黏稠、多为乳白色 目的要求： 1.学会配置培养酵母菌的培养基并倒平板。 2.学会进行无菌操作。 3.尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。 材料用具: 酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸（或报纸）、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。 酵母菌的纯培养 酵母菌的纯培养 接种和分离酵母菌 培养酵母菌 灭菌 倒平板 配制培养基 制备培养基 方法步骤： 方法步骤： 1、制备培养基 （1）配制培养基： 称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。 （2）灭菌： 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。 包器材 倒平板的具体操作如下图（P12，做笔记）： （3）倒平板： 待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 琼脂多糖，98℃以上熔化，44℃以下凝固，倒平板时高于50℃会烫手，低于50℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。锥形瓶底部不烫手时即可倒平板 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 不要完全打开，以免杂菌污染培养基 防止皿盖上的水珠落入培养基；避免培养基中的水分过快地蒸发。 1.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 最好不要用这个平板培养微生物。 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。 2.怎么确定所倒平板未被杂菌污染或灭菌彻底？ 思考： 2、接种和分离酵母菌 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。 (1)原理： 单个细胞 微生物群 单个菌落 连续划线 分散或稀释 生长繁殖 连续划线法 分区划线法 (2)“平板划线”实验操作 ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ③试管口通过火焰 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞 ⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 分区划线的具体操作（P13） 37 ①留意接种环灭菌的注意事项。②划线的注意事项。 1 2 3 4 5 【平板划线法注意事项】 连续划线法 分区划线法 ①接种环蘸取 次菌液，每次划线的菌液均来自 ，能使细菌数目随划线次数的 。 而逐渐 ，最终得到由 繁殖而来的菌落。 ②最后一区不可与 相连，不然将得不到单独的菌落； ③每次划线，均要 接种环，冷却的目的是 。划线后培养皿 培养。 上次划线的末端 增加 减少 单个细菌 第一区 灼烧并冷却 防止温度太高杀死菌种 只分离， 不计数 一 倒置 第1区划线 接种环灭菌 第2区划线 接种环灭菌 第3区划线 接种环灭菌 接种环灭菌 分区划线法 1 2 3 4 5 该平板划线时一共灼烧了几次接种环？ 6次 灼烧时期 目的 第一次灼烧 每次划线 之前 划线结束 杀死接种环上原有的微生物，避免污染培养物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死残存的菌种，避免污染环境、感染操作者 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个 的平板 ，放入 28℃ 左右 (培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异) 的 恒温培养箱中培养 24~48h。 注意：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 划3个平板(重复实验)和1个不划线(空白对照) 3、培养酵母菌 未接种 倒置 共几个？ 1. 在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？ 结果分析与评价： 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。 2. 在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状 和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？ 如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。 P14【思维训练】 如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？ 所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质, 食用后可能会危害人体健康。因此,“吃水果‘酵素’可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。 一、概念检测 1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。 (1) 培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。( ) (2) 消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。( ) (3) 微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。 ( ) × × √ 2. 日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？ 日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。 拓展应用变形：“掌心对掌心，手心压手背，十指交叉摩，手握关节搓，拇指围轴转，指尖掌心揉，手腕别放过。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是预防新冠病毒感染的有效措施之一、某生物实验小组设计了“比较洗手前后手上细菌分布情况”的探究活动：各小组成员分别将拇指在甲组培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将洗净后的拇指在乙组培养基上轻轻按一下。将这两组培养基放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养24小时后，统计两组培养基中菌落数目。 (1)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以为微生物的生长提供_________________等营养物质，为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入_____。为了防止外来杂菌的入侵，可以将培养基放入盛有适量水的 内灭菌15～30min。 (2)实验中“将拇指在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养操作中的_____，该操作应该在酒精灯火焰附近进行，原因是 __________________________________。 琼脂 高压蒸汽灭菌锅 碳源、氮源和维生素 接种 避免周围环境中的微生物污染培养基 (3)统计甲乙两组培养皿中的菌落，乙组中菌落数比甲少得多，实验结果说明肥皂洗手不能彻底清除手上的微生物。为避免手上微生物在无菌操作中污染培养基，洗过的手还应进行__________________________________等处理（至少写出1种）。 (4)有同学认为乙中也有菌落产生，是因为培养过程受到杂菌污染，请你在本实验的基础上设计一个简单的方案验证他的猜想是否正确。_____。 酒精棉球擦拭双手、戴消毒手套 再加一个不接种的相同培养基（空白培养基），与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生长菌落，说明培养过程未被杂菌污染，猜想错误；若该培养基上生长菌落，则猜想正确 1.(2023·江苏南京调研)下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　) B A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pH B.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行 C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次 D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要 2.(2023·河北衡水金卷)丁草胺是一种有机除草剂，主要用于水稻田杂草的防除，具有潜在的致畸变和致突变性。而在水稻种植过程中农田有一段很长的淹水期，淹水会导致水稻田深层土壤处于厌氧状态。因此研究丁草胺厌氧降解菌对于水稻田土壤中丁草胺的降解具有重要意义。研究人员要对丁草胺厌氧降解菌进行分离、鉴定和扩大培养(如图)，请回答下列问题： (1)你认为研究小组应该在哪里取样？________________________________ (2)配制选择培养基时，研究人员先加入了K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgCl2、NH4Cl、CaCl2、NaCl、微量元素复合液、维生素复合液等，他们还需要加入一定量的________。对培养基灭菌通常采用______________法。灭菌结束后，应趁热将适量培养基分装于锥形瓶中，充入氮气，塞住胶塞并用铝帽固定，这样操作的目的是____________________。 频繁使用丁草胺的水稻田深层土壤 丁草胺 湿热灭菌　 创造无氧的培养环境 (3)步骤③中，应将平板放入厌氧罐中，置于培养箱中恒温培养，对长出的菌落进行初步鉴定。菌落是初步区分微生物类型的重要特征，这些特征包括_____________________________________________ (至少答出2点)等。 (4)步骤④中，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，其原因是_____________________________________________________________ ____________________________________________________________________ __________________。 菌落的形状、大小、颜色、隆起程度、边缘特征 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，从上一次划线的 末端开始，能使细菌的数目随划线次数的增加逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落 Lavf55.33.100 Lavf58.12.100 Tencent APD MTS $$