1.2.2 微生物的选择培养和计数（教学课件）-【上好课】高二生物同步高效课堂（人教版2019选择性必修3）

第一章 发酵工程 第2节 第2课时 微生物的基本培养技术 【本节聚焦】 1.怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理? 2.如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物? 3.测定微生物数量的常用方法有哪些? 本PPT模板部分元素使用了幻灯片母版制作。如果需要修改，点击-视图-幻灯片母版-修改；完成后关闭编辑母版即可。 1 问题探讨 金平——盛产菠萝蜜 金平气候：阳光充足，雨量充沛，霜少无雪，气候温和， 年平均气温在21.6℃左右。 菠萝蜜：喜热带气候、喜光。适生于无霜冻、年雨量充沛的地区。 环境 生物 适应 这给了我们什么启示？ 2 问题探讨 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。 稀释涂布平板法 呈现的杂菌群 去适宜环境中寻找→分离 3 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 美国黄石公园 问题探讨 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 筛选思路： 1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。 筛选原因： 热泉的高温淘汰了绝大多数微生物，而水生栖热菌能生存。 4 问题探讨 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 筛选原则： 耐寒微生物 石油分解菌 被石油污染的土壤 冰川冻土层 实验室筛选微生物原理： 人为提供_______________的条件（包括_____、_____和_____等），同时_______________________ 有利于目的菌生长 抑制或阻止其他微生物的生长 营养 温度 pH 5 一、选择培养基 在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 完全培养基 完全培养基 + 青霉素 长出各种各样的细菌 对青霉素有抗性的细菌 对青霉素无抗性的细菌被淘汰 怎样选择出对青霉素有抗性的细菌? 1. 概念： 6 一、选择培养基 合作探究一：请同学们自主学习教材P16页，小组合作完成思考讨论。 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收 。 细菌利用尿素的原因 因为他们能合成脲酶。 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 NO3-、NH4＋ 被植物吸收 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源 1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 P18探究实践：能分解尿素的细菌都是异养型微生物，不能利用CO2 来合成有机物，可用葡萄糖等有机物作为碳源。 7 仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解 尿素的细菌吗？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 可否直接制备土壤溶液，利用平板划线法接种到选择培养基上，进行培养计数？ 不能。平板划线法最开始的划线细菌可能会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌。 方法: 稀释涂布平板法 8 二、微生物的选择培养 1.概念： 将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 2.主要过程: A.梯度稀释菌液 B.涂布平板 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 聚集的微生物 单个细胞 菌液梯度稀释 单个菌落 涂布平板 生长繁殖 9 二、微生物的选择培养 合作探究二：请同学们自主学习教材P17-18页，观看稀释涂布平板法操作视频，小组合作思考讨论稀释涂布平板法的具体操作过程。 10 二、微生物的选择培养 3. 操作过程 （1）梯度稀释 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 1×10 90mL无菌水 土壤10g 11 二、微生物的选择培养 （2）涂布平板 3. 操作过程 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 1ⅹ107 1ⅹ105 1ⅹ106 1ⅹ103 1ⅹ102 1ⅹ104 1mL 1mL 1mL 1mL 9mL无菌水 1mL 待涂布的菌液被吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中培养1-2d。 12 二、微生物的选择培养 4.稀释涂布平板法和平板划线法的比较 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 13 课堂练习 1. 为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入 A. 较多的氮源物质 B. 较多的碳源物质 C. 青霉素类药物 D. 高浓度食盐 √ 14 课堂练习 2. 能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是（ ） A. CO2和N2 B. 葡萄糖和N2　　 C. CO2和尿素 D. 葡萄糖和尿素 葡萄糖 尿素 √ 15 课堂练习 3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。请据图分析，下列说法错误的是(　　) A.③号试管的稀释倍数为103 B.④号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能为⑤号试管的10倍 C.⑤号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109 D.将涂布器在酒精灯火焰上灼烧冷却后，再进行涂布 104 √ 16 稀释102倍 稀释103倍 稀释105倍 既然稀释涂布平板法可以计算活菌数目，那么是怎么通过稀释涂布平板法统计活菌的数目呢？还有哪些统计活菌的方法呢？ 17 三、微生物的数量测定 思考： （1）为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数呢？ 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 为了保证结果准确，一般选择菌落数为30-300的平板进行计数。 （2）统计菌落数目时，要选择菌落数范围为多少的平板？ （3）在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数求平均值的原因是什么？ 重复实验。 1. 间接计数 — 稀释涂布平板法 18 三、微生物的数量测定 思考： （4）通过此方法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗？ 往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 （5）甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 = 9 ×107个/克 M代表稀释倍数； C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 计数公式： 19 三、微生物的数量测定 2. 直接计数 —计数板计数法 （1）原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积样品中微生物的数量。 血细胞计数板： 细菌计数板： 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 20 三、微生物的数量测定 方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。 中方格 小方格 大方格 边长为1mm，深度为0.1mm 1个计数室的体积为0.1mm3。 1个计数室有400个小方格。 每个小方格的体积是1/4000mm3。 1mL培养液所含菌数＝每小格平均菌数×400×104×稀释倍数 血细胞计数板 21 三、微生物的数量测定 2. 直接计数 —计数板计数法 （2）优缺点： 优点：快速、直观 缺点： ①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 思考: 为了避免上述缺点，我们该如何做？ 可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）后再进行显微镜计数。 22 三、微生物的数量测定 3.两种计数方法的比较 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 计数依据 优点 计算公式 缺点 结果 细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 细菌个数 培养基上菌落数 计数方便、操作简单 计数的是活菌 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400× 10000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 比实际值偏大 比实际值偏小 23 土壤是微生物的天然培养基，下面是有关土壤中分解尿素的细菌的分离和计数的实验过程，请根据下图回答相关问题。 （1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用　　　 　　　　　的选择培养基进行分离。 （2）若取土样5 g，应加入　　　 　 中配制成1×101倍稀释的土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成如上图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前，一定要　　　　　 　　　以减少误差。 稀释倍数 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 平均菌落数 >500 367 248 26 18 以尿素为唯一氮源 45 mL无菌水 摇匀（振荡、混匀） 课堂练习 24 稀释倍数 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 平均菌落数 >500 367 248 26 18 （3）从1×103~107倍稀释的稀释液中分别吸取0.1mL加到固体培养基上，用　　 将其分散，每个浓度稀释液至少接种　　个平板，以减少实验误差。 （4）将接种的培养皿　　　　在30-37℃的　　　 箱中培养1-2 d，观察并统计　 ，结果如上表所示。找出合适浓度，推测出每克土样中的菌落数为　 。 3 倒置 恒温培养 菌落数 2.48×108 涂布器 课堂练习 25 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 2.提出问题: 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。 3.做出假设： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 1.实验原理： 26 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①取样地点要求： （1）土壤取样 酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。 ②取样过程： 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。将样品装入事先准备好的信封中。 ③注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 4.操作步骤： 27 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源 ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用 配方： 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ①碳源 ②提供能量 氮源 ①提供无机盐； ②调节pH。 凝固剂 （2）制备培养基 4.操作步骤： 28 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （3）样品的稀释与涂布平板 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。 测细菌数： 一般用104、105、106稀释液 测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 测真菌数： 一般用102、103、104稀释液 4.操作步骤： 思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 29 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 ①每个浓度至少设置4个平板 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ （3）样品的稀释与涂布平板 4.操作步骤： 为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如：注明组别、培养日期和稀释度。 30 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养条件： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 （细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d） 观察： 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 结果： 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 稀释度 104 105 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 菌落数/平板 （4）微生物的培养和观察 得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 不一定，还需要进一步的鉴定 4.操作步骤： 31 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3 脲酶 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 (5） 鉴定培养基 pH升高，酚红指示剂变红 4.操作步骤： 32 探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 拓展：鉴别培养基 名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化 伊红—亚甲蓝 琼脂培养基 鉴别 大肠杆菌 伊红、亚甲蓝 出现金属光泽的深紫色菌落 刚果红培养基 鉴别 纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后出现透明圈 油脂培养基 鉴别产脂肪酶菌株 食用油、吐温、中性红指示剂 由淡红色变成深红色 淀粉培养基 鉴别 产淀粉酶菌株 可溶性淀粉 淀粉被分解后出现淀粉水解圈 H2S试验培养基 鉴别产H2S菌株 醋酸铅 产生黑色沉淀 33 课堂练习 1.金黄色葡萄球菌是一种具有高度耐盐性的微生物，可引起人类肺炎、肠炎等疾病。金黄色葡萄球菌在血平板（培养基中添加适量血液）上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下图为定性检测鲜牛奶中是否存在金黄色葡萄球菌的操作流程，请回答相关问题。 碳源、氮源、水和无机盐 增加金黄色葡萄球菌的数量 （1）7.5%NaCl肉汤培养基为微生物提供的营养成分包括             ，用7.5%NaCl肉汤培养基进行选择培养的主要目的是                         。 （2）操作中在血平板上的接种方法是                      ，接种操作前后需要对接种工具进行            灭菌。 平板划线法　 灼烧 34 课堂练习 1.金黄色葡萄球菌是一种具有高度耐盐性的微生物，可引起人类肺炎、肠炎等疾病。金黄色葡萄球菌在血平板（培养基中添加适量血液）上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下图为定性检测鲜牛奶中是否存在金黄色葡萄球菌的操作流程，请回答相关问题。 （3）在制备血平板时，待培养基      后，再加入适量血液．按培养基功能分类，血平板属于      培养基． （4）经多次规范操作、重复实验，血平板上均出现           的菌落，初步证明鲜牛奶中存在金黄色葡萄球菌，但鲜牛奶供应商仍认为此菌并非鲜牛奶所携带，因此，要对本操作进行完善，完善的方案是  。 设置不加鲜牛奶但其他操作均相同的对照组 冷却 鉴别 周围存在透明圈 35 课堂总结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 结果分析 36 练习与应用 一、概念检测 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌（ ） √ √ √ 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 37 练习与应用 二、拓展应用 1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。 ①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养； ②创造无氧环境进行培养。 38 练习与应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料， 它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反 应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时， 刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤 维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中 会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。 请回答下列问题。 二、拓展应用 39 练习与应用 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 土壤取样 → 富含纤维素的环境 → 以纤维素为唯一碳源，增加目的菌浓度 （选择培养基） → 制备系列稀释液 筛选产生透明圈的菌落 选择培养 涂布平板 → 将样品涂布到含刚果红的培养基上 （鉴别培养基） 梯度稀释 挑选 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 二、拓展应用 40 练习与应用 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段 时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。 请你评价这一做法。 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 二、拓展应用 41 感谢您的观看！ 本PPT模板部分元素使用了幻灯片母版制作。如果需要修改，点击-视图-幻灯片母版-修改；完成后关闭编辑母版即可。 42 Lavf58.51.100 $$