2025届高三生物一轮复习课件第49讲 基因工程

第 49 讲 基因工程 考点一 重组DNA技术的工具 考点一 重组DNA技术的工具 一、基因工程的概念 按照人们的愿望，进行严格的设计并通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术 基因工程 操作对象 原理 优点 基本过程 基因 克服远缘杂交不亲和障碍；定向改造生物性状 基因重组 剪切→拼接→导入→表达 考点一 重组DNA技术的工具 理论和技术基础 ①限制酶、DNA连接酶的相继发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件 ②发现在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移 科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流 考点一 重组DNA技术的工具 二、基因工程的工具 限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀” 1 主要来自原核生物 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 专一性 来源： 特性 结果： 产生黏性末端或平末端 一般由6个核苷酸组成，是一段回文序列(即一条链正向读与它的互补链反向读碱基顺序一样) 黏性末端 平末端 注意：将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，会产生四个末端 考点一 重组DNA技术的工具 1.(源于选择性必修3 P71“旁栏思考”) 原核生物中存在限制酶的意义： 2.(源于选择性必修3 P74“拓展应用”) 限制酶不切割原核生物本身DNA分子的原因 3.(源于选择性必修3 P75“拓展应用”) 不同限制酶切割可能产生相同黏性末端的意义： 【教材隐性知识】 当遭受外源DNA(如噬菌体)的入侵时，限制酶可切割外源DNA使之失效，以保证自身安全 原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰 使构建载体时切割位点的选择范围更大 考点一 重组DNA技术的工具 DNA连接酶——“分子缝合针” 2 作用： 类型 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 分子缝合针 E·coli DNA连接酶 T4 DNA 连接酶 来源： 特点： 只能连接互补黏性末端 大肠杆菌 来源： 特点： T4噬菌体 互补黏性末端和平末端 都能连接(但后者效率较低) 考点一 重组DNA技术的工具 与DNA有关的几种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA水解酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对中的氢键 将DNA切成两个或多个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA片段的3’端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 1.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A.能断裂a处的酶为_______ B.能连接a处的酶为_______ C.能断裂b处的酶为_______ ① 　考点训练　 磷酸二酯键 氢键 ③④ ② 考点一 重组DNA技术的工具 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 3 作用： 种类 特点： 将外源基因送入受体细胞，使之能得到复制和进行表达 最常用：质粒 其他：噬菌体、动植物病毒 一种裸露的、结构简单、独立于细胞核或拟核外的并具有自我复制能力的环状双链DNA分子 ①能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制，并且对受体细胞无害 ②有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入其中 ③有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选 天然质粒需进行人工改造才能用于基因工程 考点一 重组DNA技术的工具 标记基因用于检测目的基因是否导入受体细胞的机理 氨苄青霉素 抗性基因 LacZ基因 目的基因 注：LacZ基因表达产物可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色 可在含X-gal和氨苄青霉素的固体培养基形成白色菌落 考点一 重组DNA技术的工具 标记基因用于检测目的基因是否导入受体细胞的机理 (复习资料P360) 考点一 重组DNA技术的工具 三、基因工程操作中限制酶的选择方法 1. 根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①不破坏目的基因原则：应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选切点位于目的基因内部的限制酶 ②确保出现相同黏性末端原则：即切割目的基因和质粒的限制酶要相同，同时为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，确保目的基因和质粒正确连接，通常使用两种限制酶分别切割目的基因和质粒(即双酶切) 如图选择PstⅠ和EcoRⅠ这两种酶 考点一 重组DNA技术的工具 启动子方向 目的基因转录方向 限制酶切割 a b c d DNA连接酶 a、b、c、d四个黏性末端相同 单酶切： 正向连接 反向连接 双酶切： 限制酶a切割 a b DNA连接酶 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 a b a和b黏性末端不同 考点一 重组DNA技术的工具 2. 根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：即所选限制酶不要破坏这些结构 当出现多个标记基因时可以选择破坏其中一个 ②切割位点必需位于启动子和终止子之间 A. 质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B. 质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C. 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D. 质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 1. (2023· 新课标卷·6，6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割点） 和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点 如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( ) C A. 试管1中应加入限制酶和DNA连接酶 B. 试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2+处理大肠杆菌 C. 能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色 D. 试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养 2. 大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ 基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是( ) B 考点二 基因工程的基本操作程序 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子 考点二 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的筛选与获取——前提 目的基因： 【小提示】基因按功能可分为结构基因(能转录并翻译)、转录基因(只转录)和调控基因(调控其他基因表达) 筛选目的基因的方法 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选 ③利用PCR获取和扩增目的基因 ②从已构建的基因文库中获取 考点二 基因工程的基本操作程序 获取方法 ①人工合成 逆转录法 主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下： 化学合成法 依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下： 注意：以mRNA为模板逆转录得到的目的基因，是不含有内含子、启动子和终止子等结构的 考点二 基因工程的基本操作程序 利用PCR获取和扩增目的基因 1 原理： 概念： 条件 PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项在体外提供DNA复制的各种组分与反应条件对目的基因进行大量复制的技术 DNA半保留复制 优点:可以在短时间内获得大量目的基因 DNA母链： 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸： 合成DNA子链的原料 一般用dNTP(脱氧核苷三磷酸)代替，其中的高能磷酸键可提供能量 耐高温的DNA聚合酶： 催化合成DNA子链 高温： 代替解旋酶断裂氢键，打开DNA双链 引物(1对 2种)： 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 1.引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，结合到模板链的3’端 考点二 基因工程的基本操作程序 除此之外进行PCR反应还需要一定的缓冲溶液，以提供相对稳定的PH环境，一般为了激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶还会向其中添加Mg2+ 关于引物的认识： 2.引物存在的必要性：DNA聚合酶不具有从头合 成子链的功能，只能催化脱氧核苷酸加至已有核酸链游离 的3′-羟基上 3′ 5′ DNA聚合酶 3′ 5′ 模板链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 子链延伸 引物是决定PCR特异性的关键 关于引物的认识 考点二 基因工程的基本操作程序 3.设计引物的依据： 目的基因两端的核苷酸序列 ①引物的长度一般为20～30个核苷酸，不能太短也不能过长，过长会导致延伸温度太高从而不利于Taq DNA聚合酶发挥作用 4.所用引物的要求： ②引物的GC碱基含量要达到一定的比例，一般为40%～60%，过高或过低都不利于引发反应 ③引物内部及两种引物间都不能发生局部碱基互补配对，前者是防止引物自身折叠，后者是防止引物之间配对导致不能和模板链结合 ④为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶识别序列 考点二 基因工程的基本操作程序 过程： 变性 温度超过90℃，双链DNA解聚为单链 复性 延伸 温度下降到50℃左右，两种引物通过碱 基互补配对与两条DNA单链的3’端结合 温度上升到72℃左右，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 一次PCR一般要经历30次循环 （方向：新链的5’端到3’端） 注意：复性温度过高则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 第一轮 第二轮 3′ 目的基因 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 图1 图2 (1)若像图2那样设计引物，能不能扩增出目的基因片段？ (2)至少经过 次循环后才能扩增出含两条等长脱氧核苷酸链的双链DNA分子；n次循环后这样的双链DNA分子有 个 (3)n次循环后扩增产物中，含引物的DNA有 个，只含一种引物的DNA有 个，含两种引物的DNA有 个 2n-2 2n 2 3 2n-2n (4)n次循环后共消耗引物 个；第n次消耗引物 个 2n+1-2 2n 不能 （复习资料P367） 26 采用PCR技术获取和扩增EPSPS基因时，所需要的两种引物序列分别为(注意标明5'和3'端） 1. 培育抗除草剂玉米可有效降低玉米种植中的劳动总量。草甘膦是目前世界上使用最广泛的除草剂，EPSPS基因是常用的抗草甘膦基因。分析回答下列问题：①EPSPS基因某条链的末端序列如下图： 5'-CTTGGATGAT-3' 5'-TCTGTTGAAT-3' 3’ 5’ 5’ 3’ 与已知序列互补 与已知序列相同 3’ 5’ 3’ 5’ 2. 如图，为保证双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和引物2，其中引物1的序列为 5'-　　　　　 　　　　　　-3' GGTACCGTACCTTTGT 3. 为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因(300bp)的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。 乙、丙 目的基因反向连接 考点二 基因工程的基本操作程序 二、基因表达载体的构建——核心 目的 ①使目的基因在受体细胞中稳定遗传，并且可以遗传给下一代 ②使目的基因能够表达和发挥作用 基因表达载体的组成： 终止子：位于目的基因下游，是使转录终止的一段有特殊序列结构的DNA片段 启动子：是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用 复制原点：复制的起始位点，此处碱基A和T较多 标记基因：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将其筛选出来 目的基因要插入启动子和终止子之间 考点二 基因工程的基本操作程序 【小提示】启动子根据其作用方式及功能可分为三种类型：组成型启动子（在多数或全部组织中保持持续的活性)、组织特异性启动子（可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位）和诱导性启动子（使外源基因在特定条件即诱导物作用时才表达） “启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”的辨析 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 功能 一段DNA，分别位于上、下游 mRNA上三个相邻的碱基，首尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录 决定转录的结束 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) (重组DNA分子) 考点二 基因工程的基本操作程序 过程： 注意：若考虑两两连接，则用DNA连接酶连接后会出现三种情况：目的基因与目的基因连接、目的基因与质粒连接、质粒与质粒连接，所以后续需要进行筛选 考点二 基因工程的基本操作程序 三、将目的基因导入受体细胞——关键 只有该步骤没有涉及碱基互补配对原则 受体类型 　　 导入方法 具体操作 植物细胞 动物细胞 原核细胞 花粉管通道法 农杆菌转化法 （最常用） 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，或将DNA溶液滴在花柱切面让目的基因通过花粉管通道进入胚囊 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上 显微注射技术 直接将含有目的基因的表达载体注射进受精卵 Ca2＋处理法 用Ca2+处理细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态） 大多数单子叶植物不适用 繁殖快、遗传物质少、易培养 其他：基因枪法(单子叶)、病毒介导法(动物) 考点二 基因工程的基本操作程序 农杆菌转化法 是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 T-DNA 目的基因 含目的基因的重组Ti质粒 含重组Ti质粒的农杆菌 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 表现出新性状的植物 两次拼接：第一次是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上，第二次(非人工操作)是指插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上 两次导入：第一次是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次(非人工操作)是指含目的基因的T­DNA导入受体细胞　　 第一次拼接 第二次拼接 第一次导入 第二次导入 考点二 基因工程的基本操作程序 四、目的基因的检测与鉴定——保证 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 分子水平的检测 方法1：PCR扩增技术 转基因生物 提取DNA 作为模板 PCR操作 看条带情况 琼脂糖凝胶电泳 方法2：DNA分子杂交技术 考点二 基因工程的基本操作程序 四、目的基因的检测与鉴定——保证 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 分子水平的检测 方法1：PCR扩增技术 方法2：DNA分子杂交技术 检测目的基因是否转录出了mRNA 方法1：RT-PCR扩增技术 方法2：RNA分子杂交技术 从样品里提取出RNA，以此作为模板进行逆转录得到cDNA片段，再进行PCR及电泳鉴定 所用探针为带标记的RNA片段 检测目的基因是否翻译(表达)出蛋白质 方法：抗原—抗体杂交技术 考点二 基因工程的基本操作程序 考点二 基因工程的基本操作程序 四、目的基因的检测与鉴定——保证 个体生物学水平的检测： 检测转基因生物体是否具有相应性状 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 A. 若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B. 构建表达载体时应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶以及DNA连接酶 C. 若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2+处理大肠杆菌 D. 只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受 体细胞 1. 图甲为培育转基因生物时选用的运载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是( ) D (1)图中①过程得到的DNA片段 (填"含有"或"不含有")启动子序列 2.(12月联考21题) 胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如下图所示。请据图回答： 不含有 (2)用图中方法得到的kit基因较少，可以采用PCR技术进行扩增，以 (填限制酶）进行双酶切kit基因与质粒 pET-28a(+)。为了实现目的基因与运载体的连接，则需要在引物的 (填"5'"或"3'"）端添加限制酶识别序列 BamH I 和EcoR I 5’ (3)双酶切kit基因，与质粒pET -28a(+）长度为170bp片段进行置换，构建重组质粒 pET -28a(+)- kit ，上述两种质粒在 Hind III酶切后片段长度如表所示（每种片段各一个）。 则kit基因长度为 bp ，由此判定kit基因上有 个Hind III酶切位点，依据是 320 2 pET-28a(+)原有的2个Hind III位点被目的基因置换1个后，得到的环状的pET-28a(+)-Kit被切割成3段 阐明“pET-28a(+)有2个Hind III酶切位点或酶切片段有2段”得1分，阐明“置换后有3个酶切位点或酶切片段有3段”得1分 (4)为验证基因工程菌是否构建成功，需对上述构建的基因工程菌进行菌落PCR验证（菌落PCR是指直接以微生物菌体热解后的DNA为模板，以目的基因两端序列设计引物进行扩增的方法，其凝胶电泳结果可初步鉴定菌落是否含有目的基因）,根据验证的结果提取大肠杆菌的质粒进行双酶切再验证，结果如图17所示。初步分析可知，基因工程菌的构建 （选填"成功"或"不成功")，理由是 成功 菌落PCR与质粒双酶切均可获得大小约320bp的基因片段 其他答案：①菌落PCR与质粒双酶切的凝胶电泳结果中均含有与Kit基因大小相同的条带 ②通过菌落PCR与质粒双酶切均获得了目的基因 ③菌落PCR扩增出了大小约为320bp的基因片段，大肠杆菌质粒双酶切也获得了大小约为320bp的基因片段 考点三 实验：DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、DNA的粗提取与鉴定 实验原理 1 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等物质在物理和化学性质方面的差异，对其进行提取并去除其他成分 不溶于 2mol/L 二苯胺 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 操作流程 2 取材研磨 取新鲜洋葱切碎于研钵中，加研磨液充分研磨 获取含DNA的滤液 注意事项： ①应选DNA含量相对较高的生物组织，不能用哺乳动物成熟红细胞作为材料，因其没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA，用鸡血细胞时需加入柠檬酸钠防止血液凝固 ②研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 用纱布过滤后4℃冰箱中放置几分钟或直接将研磨液倒入塑料离心管中离心5min，再取上清液 ③过滤时不能用滤纸，因为DNA会被吸附在滤纸上 作用：①抑制核酸水解酶的活性减少DNA降解 ②抑制DNA分子运动，使其易形成沉淀析出 ③增加DNA的柔韧性减少其断裂 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 操作流程 2 在上清液中加入等体积的、预冷的体积分数为95%的酒精，静置2~3min后用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起白色丝状物或离心后取沉淀物 DNA的鉴定 注意事项： ①酒精预冷的作用同4℃冰箱 ②搅拌时轻缓并沿一个方向的目的是：减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 将丝状物或沉淀物用2mol/L的NaCl溶液溶解，然后加入二苯胺试剂，混合均匀后置于沸水中加热5min，冷却后观察颜色变化 ③二苯胺试剂需要现配现用，最后能观察到溶液颜色变蓝，而且颜色深浅跟DNA的量有关 DNA的析出 DNA的纯度则看提取物的颜色 A. 应选用DNA含量相对较高的材料，如鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜 B. 可利用DNA和蛋白质在不同浓度NaCl溶液中溶解度的不同，将两者分开 C. 研磨材料得到的滤液应在4 ℃冰箱中静置或离心，取沉淀进行后续操作 D. 向经酒精处理得到的白色丝状物中加入蛋白酶，可提高DNA的相对含量 1. (2024·河北沧州高三模拟)下列关于“DNA粗提取”的相关操作，错误的是（　　） C 取上清液 A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量 B.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C.向含DNA的滤液中加入2mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质 D.用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化 2.下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( ) D 纱布 溶解DNA 去除蛋白质，提纯DNA 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 二、DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验原理 1 运用PCR技术可以在体外进行DNA片段的扩增，这利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，而PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器 PCR扩增仪 变性 90˚C 延伸 72˚C 退火 50˚C 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验原理 1 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其原理是：DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下这些基团可以带上正电荷或负电荷(PH= 8左右DNA分子带负电)，在电场的作用下这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，染色后DNA分子可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来 含孔隙，分子越大越难通过 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 操作流程 2 1) PCR实验 微量移液器 微量离心管 实际上是PCR反应的场所 确保所有成分均匀混合，提高反应速率 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR反应体系的配方 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA（用量为1pg-1μg） 5～10μL 储存浓度 酶活性单位 注意：反应体系总体积为50μL，一般按照用量由大到小的顺序来加样，最后才加DNA聚合酶，这样既保证所加各试剂体积的准确性也能保护酶的活性 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min PCR仪参数设计： 使模板DNA充分解旋为单链 注意：可以根据目的基因长度适当调整延伸时间，有时候为了目的基因扩增更充分还会进行后延伸操作 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 操作流程 2 2) DNA片段的电泳鉴定 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液(一般质量分数为0.8%～1.2%)，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子以形成加样孔，溶液完全凝固后小心拔出梳子，将其放入电泳槽内，并向电泳槽内加入电泳缓冲液，以没过凝胶1mm为宜 常用的有TAE(乙酸盐)和TBE(硼酸盐)，PH都为碱性(使DNA带负电)，加有EDTA(一种螯合剂，能与Mg2+结合) 常用EB(溴化乙锭)，可以插入DNA双链相邻碱基之间形成复合物，在紫外线下发射出红橙色荧光 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 操作流程 2 2) DNA片段的电泳鉴定 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，注意留一个孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker，其实质为已知不同长度的DNA片段混合物) 电泳 接通电源(加样孔侧连电源负极)，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm，待指示剂迁移接近凝胶边缘1-2cm时停止电泳 溴酚蓝，有颜色，可以标记样品的位置并帮助监测电泳进程 加样 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 注意事项 3 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 ②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染 ③该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存，使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化 ④加样时DNA可能会飘散到电泳缓冲液或流入附近加样孔造成交叉污染，故可向凝胶载样缓冲液中加入甘油或蔗糖等成分以增加样品密度，保证每个样品都容易沉入各自的加样孔中防止飘散 考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 结果分析与评价 4 ①成功扩增出DNA片段的判断依据是 。 ②PCR结束后产物进行电泳鉴定的结果应该是 条条带。如图所示，该片段大小约为 bp。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带 一 750 A. 琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物 B. 双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C. 凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA 的检测 D. 凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来 1.DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是（　　） B 越小 A. 呈环状结构 B. 分子质量大小为10 kb C. 有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切点 D. 其NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短 距离为2kb 2.一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(下图左边一列)。关于该双链DNA，下列说法错误的是（ ） D 1kb A. 该载体最可能为环形DNA 分子 B. 两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C. 限制酶R1与R2的切割位点最短相200bp D. 限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂 3.在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶 (R1和R2) 处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是( ) D 蛋白质中连接两个氨基酸的化学键 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 一、基因工程的应用 农牧业方面 培养抗 性植物 转基因抗虫植物 转基因抗病植物 转基因抗除草剂植物 改良植物的品质 将某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量 将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响 提高动物的生长速率： 导入外源生长激素基因 改良畜产品的品质 将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高它的观赏价值 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 基因改造 显 微注射 抗原决定基因 克隆 免疫排斥 细胞因子(如干扰素，用于抗病毒药物)、抗体、疫苗和激素等 生产抗凝血酶、生长激素、血清白蛋白等 让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 食品工业方面 利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等 科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶 加工转化糖浆需要的淀粉酶、加工烘烤食品要用到的脂肪酶等也可以通过构建基因工程菌后用发酵技术大量生产 用基因工程的方法使外源基因得到高效表达的菌类 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别 比较项目 乳腺(房)生物反应器 基因工程菌 基因结构 基因产物 受体细胞 导入方式 生产条件 产物提取 哺乳动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异 合成的药用蛋白与天然蛋白质完全相同 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的药物蛋白可能不具有生物活性 哺乳动物的受精卵 微生物细胞 显微注射法 Ca2+处理法 不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 从动物乳汁中提取，相对简单 (一般经过工业发酵后)从微生物细胞(或发酵液)中提取， 相对复杂 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 膀胱生物反应器 是指将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组，从而使目的基因的表达产物出现在转基因动物的尿液中，再从其中分离得到相应的药用蛋白 优点： 周期短、不受性别和生长发育时期的限制，易收集 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 二、蛋白质工程 是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求 1. 概念： 2. 基本思路： ——第二代基因工程 从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 获得所需要的蛋白质 → → → → 逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反 经常需要借助计算机建立蛋白质的三维结构模型；制备蛋白质晶体后要通过X射线衍射技术分析晶体的结构；还要用到基因的定点突变技术来进行碱基的替换。最困难的一步是设计新蛋白质的空间结构 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 3. 应用 医药工业方面： 研发药物，如速效胰岛素类似物、延长干扰素体外保存时间；降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应 其他工业方面： 开发新的工业用酶和改进酶的性能 农业方面： 改造某些参与调控光合作用的酶和设计优良微生物农药 问题: 为什么蛋白质工程改造的是基因而不是直接改造蛋白质？ ①蛋白质的空间结构十分复杂，直接改造难度大 ②改造后的基因可以遗传给下一代，但被改造的蛋白质无法遗传 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程 蛋白质工程与基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 起点 过程 实质 结果 联系 预期蛋白质功能 预期蛋白质功能→设计蛋白质 结构→推测氨基酸序列→找到 并改变脱氧核苷酸序列或合成 新的基因→表达出所需蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 目的基因 通过改造相应的基因达到对蛋白质进行改造的目的 基因重组 可以创造出自然界中不存在的蛋白质 原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质 蛋白质工程获得目的基因后需要通过基因工程获得预期蛋白质 A.基因工程在农牧业上的应用主要目的是培养体型巨大品质优良的动物 B.用基因工程方法培育的抗虫植物也能抗病毒 C.转基因绵羊操作过程中生长激素基因的受体细胞最好采用乳腺细胞 D.在农业方面，蛋白质工程可用于改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食产量 1.基因工程蓬勃发展，下列有关基因工程的说法正确的是( ) D 受精卵细胞 不属于主要目的 不能 A.新的胰岛素的产生是依据基因工程原理完成的 B.新的胰岛素生产过程中不涉及中心法则 C.新的胰岛素产生过程中最困难的一步是由 胰岛素分子结构推测氨基酸序列 D.若用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2＋ 处理大肠杆菌 2.胰岛素用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，有关叙述正确的是(　　) D $$