1.2 微生物的培养技术及应用-【帮课堂】2024-2025学年高二生物同步学与练（人教版2019选择性必修3）

第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用 学习目标 1.概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。 2.阐明微生物选择培养的原理。 3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 学习重点：微生物纯培养的基本操作要求，微生物选择培养的原理；酵母菌的纯培养。 学习难点：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 ～ 1.培养基：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质。其作用是培养、分离、 。 （1）营养物质：水、 （提供碳元素的物质）、 （提供氮元素的物质）和无机盐。 （2）培养基按物理性质分为 培养基：不加凝固剂，常用于 ；半固体培养基：加凝固剂，用于 ； 培养基：加凝固剂，用于微生物的分离、 和 。 （3）按功能分为 ：依据微生物对某些物质的特殊需求或抗性设计。用于培养、分离特定微生物； ：鉴别不同种类的微生物； （4）培养基的配制要求：提供水、无机盐、碳源、氮源等主要营养物质要求，满足微生物生长对 的需求，培养霉菌时，需要将培养基调至 ，培养细菌时，需将培养基调至 ，培养厌氧微生物时，需提供 条件。 2.无菌技术：获得纯净的微生物的关键是 。 （1）消毒和灭菌：消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分 ，灭菌指施用强烈的理化方法杀死物体内外 的微生物，包括 。 （2）消毒和灭菌后，要避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触；为避免周围环境中微生物污染，许多操作都应在 并在 进行。 3.微生物的纯培养：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的特定种类微生物的群体称为培养物。由 繁殖所获得的微生物群体称为 ，获得纯培养物的过程就是纯培养 （1）纯培养的步骤：微生物的纯培养包括 →灭菌→接种→ 等步骤。 （2）酵母菌的纯培养 ①原理：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的，由一定形态的 ，这就是 。采用 和 能将单个微生物分散在 上，之后经培养得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 ②方法步骤：配制培养基→灭菌→倒平板→ →培养酵母菌 ③配制培养基：称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g （也可用蔗糖代替）、15～20g ，用蒸馏水定容至1000mL。 ④灭菌：将配制好的培养基转移到 中，加棉塞，包上 ，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为 、温度为 的条件下，灭菌15～30min。将5～8套培养皿宝成一包，用基层牛皮纸包紧，放入敢惹灭菌箱内，在 灭菌2h。 ⑤倒平板：待培养基冷却至 左右时，在酒精灯火焰附近到平板。拔出锥形瓶的棉塞，将锥形瓶瓶口通过 ，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）导入 ，立即盖上培养皿该。 ⑥接种和分离酵母菌：通过接种环在固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经 后培养，可以分离得到单菌落。 ⑦培养酵母菌：完成划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 左右的恒温箱中培养 。 4.微生物的选择培养（以分解尿素的细菌分离为例） ①铲取土样，将土样装入 中。 ②将 土样加入盛有 无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取 上清液加入盛有 无菌水的试管中，依次等比稀释。 ③取 菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有 的烧杯中。 ⑤将涂布器放在 ，待酒精燃尽，涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀涂布在 。涂布时可转动 ，使涂布均匀。 ⑦待涂布的菌液被 吸收后，将平板倒置，放在 的恒温箱中培养 。 ⑧在涂布有 的平板上观察分离单菌落。 5.微生物的数量测定 ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为 的平板进行计数。 ②在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。 ③统计的菌落数往往比活菌的实际数 ，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用 数而不是 数来表示。 ④利用 进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。 1．为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离和培养等工作，得到下图所示的两种实验结果。请回答下列问题：    (1)该实验中所用到的培养皿、接种环、培养基等均需进行灭菌处理，其中可用灼烧灭菌法进行灭菌的是 ，必须用湿热灭菌法进行灭菌的是 ，它不使用干热灭菌的原因是 、 (2)接种前，为了检测培养基平板灭菌是否合格，可以采用的方法是 。 (3)如果要进行细菌计数，应采用图示 （填编号）的接种方法。将1mL水样稀释1000倍，在3个平板上分别接入0.1mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，则每升水样中的活菌数为 。 (4)采用图示A方法分离水样中的细菌时，为了将聚集的菌体分离获得单个菌落，在第二次及以后的划线时，一定要 。通常情况下，对获得的纯菌种可以依据 对细菌进行初步的鉴定和分类。 (5)将分离得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。原因是振荡培养能提高培养液中 的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。 2．硝基苯酚是工业污水中的重要污染物，某同学欲从污水处理厂的污泥中分离能分解硝基苯酚的细菌。请回答下列有关问题： （1）为了筛选出污泥中可分解硝基苯酚的细菌，在配制培养基时应选择 作为主要碳源。判断培养基灭菌是否合格的思路是 。 （2）纯化菌株时，通常使用的划线工具是 。某个平板经培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他线上有菌落，分析造成第二划线区域第一条线上无菌落的可能原因有：① ；② 。 （3）进行梯度稀释时的一般操作是将1mL菌液移入盛有 mL无菌水的试管中，常用 法进行活菌计数。 （4）实验数据显示，当培养基中加入碳源——葡萄糖时，该细菌降解硝基苯酚的速率明显提高，原因可能是 。 3．纤维素是地球上年产量巨大，但未能得到充分利用的物质，尤其以农作物秸秆为甚，我国年产约6亿吨。对其研究利用的报道较多，能降解纤维素的微生物种类很多，目前的研究以丝状真菌为主。请回答下列问题： （1）食草动物能够消化食物的关键是体内存在能合成 酶的微生物，能够降解纤维素，该酶是一种复合酶，它至少包括 。 （2）目前，研究者多利用以 为唯一碳源的培养基从土壤中分离纤维素分解菌。为检测纤维素分解菌的存在与否还应加入 染料，形成 色复合物，若产生 ，则证明有纤维素分解菌存在。 （3）下图是工业上利用微生物由纤维素生产乙醇的基本工艺流程：上述工艺流程中环节①需要的微生物大多分布在 的环境中。④过程要注意对接种器材进行 。 4．乳酸菌和我们的生活紧密相连，现欲从泡菜滤液中分离乳酸菌。请回答下列相关问题。 （1）要纯化培养乳酸菌，在配制固体培养基时，除了要加入各种营养物质外，一般还要加入琼脂。培养基中的(NH4)2CO3 （能/不能）为乳酸菌提供碳源 ，原因是 。 （2）纯化培养乳酸菌时，可采用 法进行接种。为了能鉴别乳酸菌菌落，往往在配制培养基时加入碳酸钙，原因是 。 （3）甲、乙同学测定泡菜滤液中微生物的浓度。在对应稀释倍数为105的培养基中，得到以下两种统计结果：乙同学在该浓度下涂布了平板，统计的菌落数为49；丙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为43、54、287，然后取其平均值128作为统计结果。 请评价这两位同学的实验结果的有效性。 ①乙同学的结果 ，原因是 。 ②丙同学的结果 ，原因是 。 （4）丁同学采用血细胞计数板计数(规格为16×25，16个中方格，每个中方格有25个小方格，体积为0.1mm3)，统计4个中格中的细菌数，计算出每个小格所含细菌的平均数为3个， 则每毫升样品中的细菌数是(稀释倍数为104) 个。 1.微生物是指那些形体微小、单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚至是没有细胞结构的低等生物的统称。 2.菌落都是由单个细菌形成的细菌集团。这个说法是错误的。 3.培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。 4.没有生物活性的材料都可采用高压蒸汽灭菌。 5.配制培养基时应先灭菌再调pH。 6.倒平板时，应将打开的培养皿盖放在一边，以免培养基溅在培养皿盖上。 7.为防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 8.对细菌进行计数，只能采用稀释涂布平板法。 9.稀释涂布平板法计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数少。 探究一 培养基的配制 1.培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。用于培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。请思考讨论下面的问题。 （1）培养基配制需要遵循什么原则? （2）培养基的营养构成有什么特点？ （3）微生物对主要营养物质的需求有什么特点？ 探究二 选择培养基 2. 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。PCR是一种体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。 （1） 筛选耐高温（93℃）的DNA聚合酶的思路。 （2）寻找耐高温的DNA聚合酶给我们什么样的启示？ （3）土壤中含有分解尿素的细菌，设计一种培养基配方配制培养基筛选分解尿素的细菌。 探究三 倒平板 3.倒平板操作是一项基本的微生物实验技术，操作步骤包括：1.将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。3.用左手将培养皿滚燃打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。4.等待平板冷却凝固（大约需纯备晌5～10min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。思考下面的问题： （1）到平板时为什么需要使锥形瓶的瓶口过火焰？ （2）培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时才能用来到平板。常用什么方法估计培养基的温度？ （3）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ （4）怎样确定所到平板未被杂菌污染？平板划线时注意事项有哪些？ · 基础过关练 1．下列关于无菌操作的叙述，正确的是（    ） A．煮沸消毒不能杀死微生物的细胞 B．应尽量选择脱脂棉塞住试管口，否则容易造成吸水污染 C．配置培养基时应该先灭菌再调节pH D．对于接种间应采用紫外线或药物熏蒸的方法进行杀菌或消毒 2．下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，不正确的是（    ） A．显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大 B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落 C．采用稀释涂布平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数 D．统计菌落数目时，只要菌落数目在30～300的平板都可以计数，并以它们的平均值作为统计结果 3．实验室常用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，下列相关叙述正确的是（    ） A．放入待灭菌物品后，关闭排气阀，即可打开电源加热 B．一般在压力为100kPa、温度121℃的条件下灭菌10min C．高压蒸汽灭菌法可以杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 D．若压力达到设定要求时，锅内没有达到相应温度，说明灭菌锅的温度计测量有误 4．灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是（    ） A．为了防止杂菌污染，应将配制好的选择培养基分装到培养皿中再进行高压蒸汽灭菌 B．配制培养基、倒平板、接种均需要在酒精灯火焰旁进行 C．为防止蛋白质变性，不能用高压蒸汽灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌 D．可用干热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌 5．下表是培养某种微生物的培养基配方，以下说法正确的是（    ） 成分 NH4NO3 KH2PO4 CaCl2 FeSO4 维生素 蒸馏水 含量 0.5g 3.0g 0.5g 0.5g 少许 定容至1000ml A．该培养基中含有碳源、氮源、水和无机盐四类物质 B．该培养基可用来培养硝化细菌，不能用来培养酵母菌 C．该培养基在培养硝化细菌时，需要密封 D．要用该培养基培养酵母菌，需要加入葡萄糖作为氮源 6．在微生物培养的过程中，需要通过选择培养或鉴别培养的方法来筛选出目标菌种，下列与之相关的叙述中不正确的是（    ） A．纤维素分解菌能够将淀粉分解为葡萄糖 B．尿素分解菌能够将尿素分解为氨，从而使酚红指示剂变红 C．在培养基中加入抗生素能够筛选出具有相应抗性的菌株 D．在含有碳酸钙的培养基上生长的乳酸菌菌落周围会出现“溶钙圈” 7．某同学用下表所示的培养基培养纤维素分解菌。下列叙述正确的是（　　）（青霉素会抑制细菌生长） 成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4 葡萄糖 H2O 青霉素 含量 3g 1g 0．5g 0．5g 0．01g 30g 1L 0．1万单位 A．根据物理性质，该培养基属于固体培养基 B．该培养基可用来筛选抗青霉素的微生物 C．该微生物的培养基适合新冠病毒的培养 D．该培养基用于培养纤维素分解菌，应除去葡萄糖，添加纤维素 8．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃，土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃作为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是（    ） A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用 B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基 C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上 D．在选择培养基上能形成分解圈的可能为所需菌种 · 能力提升练 9.微生物培养过程中，要重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，正确的是(　　) A.煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子 B.将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌 C.加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌 D.家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 10.下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　) A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pH B.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行 C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次 D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要 11.北京冬奥会食堂让各国运动健儿爱上中国味道，其餐余垃圾在垃圾集中点采用生化＋雾化＋膜过滤技术处理后，可以达到无二次污染的标准。为筛选对抗生素有抗性、高效降解淀粉的微生物，提高“生化”处理的效率，研究人员将餐余垃圾机械化处理后加入装有无菌水的锥形瓶中制备餐余垃圾浸出液，然后进行如图所示操作，下列说法错误的是(　　) A.餐余垃圾浸出液在接种前通常需要进行高压蒸汽灭菌处理 B.可用稀释涂布平板法将餐余垃圾浸出液接种在X培养基上 C.X培养基含有淀粉和抗生素，Y培养基是不含琼脂的液体培养基 D.图中降解淀粉最高效的微生物是⑤，可根据菌落特征初步判断微生物类型 12.灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　　) A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行 B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染 C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌 D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌 13.解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　) A.甲菌属于解脂菌 B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力 14.青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是(　　) A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖 B.可用深层通气液体发酵技术提高产量 C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中 D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌 15.培养基是人们按照培养对象对营养物质的不同需求配制的营养基质。下列有关培养基的配制和使用的叙述，正确的是(　　) A.微生物培养基的组成成分必需含有碳源、氮源、水和无机盐 B.用动、植物的体细胞进行细胞培养，均可用固体培养基 C.接种前要了解固体培养基是否被污染可接种蒸馏水来培养检测 D.使用过的微生物培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃 16.为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是(　　) A.采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本 B.培养细菌时，可选有牛肉膏蛋白胨固体培养基 C.土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落 D.鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法 17.在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列相关叙述，错误的是(　　) A.玻璃和金属材质的实验器具可放入干热灭菌箱中干热灭菌 B.接种前后的接种环都要在酒精灯的火焰上进行灼烧消毒 C.没有将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽将影响培养基的灭菌效果 D.喷洒石炭酸同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果 18.餐厨垃圾中具有高效降解能力的微生物，可用于餐厨垃圾高效无害化处理。科研人员取一定量的餐厨样品，制备不同浓度的样品稀释液，并将样品接种于利用蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂配制的培养基表面进行培养并分离。下列分析正确的是(　　) A.牛肉膏主要为微生物提供氮源 B.接种时需用力将菌种接种到培养基内 C.稀释样品获得单个菌落以便判断菌种类型 D.经过培养可筛选出有高效降解能力的微生物 19.某学习小组从富含纤维素分解菌土壤中获取纤维素分解菌并进行了下列操作：称取土样20 g，加入装有30 mL培养基的摇瓶中并完成稀释，在30 ℃下将摇瓶置于摇床上振荡培养；吸取一定的培养液，转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊时，吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，以达到分离纯化培养的目的。下列叙述正确的是(　　) A.取样土壤须在无菌条件下，用蒸馏水稀释 B.为确定所用的固体培养基是否灭菌严格，应选择未接种的牛肉膏蛋白胨培养基进行空白培养 C.摇床上振荡培养的目的是保证纤维素分解菌所需要的有氧环境及提高营养物质的利用率 D.在所用的固体培养基中添加刚果红，若存在纤维素分解菌，则其菌落周围会呈现红色的透明圈 20.双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。在培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至45~48℃，然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，根据噬菌斑的数目可计算原液中噬菌体的数量。下列叙述错误的是（ ） A. 倒平板前需利用不同方法对培养基和培养皿进行灭菌 B. 若利用双层平板法对T2噬菌体进行计数，可选用乳酸菌为敏感指示菌 C. 上层平板中出现噬菌斑的原因是噬菌体侵染宿主细菌使其裂解死亡 D. 若上层平板中琼脂浓度较低，可能形成的噬菌斑较大，有利于计数 · 思维拓展练 21.自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中N2的细菌，将玉米种子用自生固氮菌拌种后播种，可显著提高产量并降低化肥的使用量。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图。回答下列问题： (1)步骤①土样应取自当地表层土壤的原因是_____________________________； 步骤②需充分振荡的主要目的是______________________________________。 (2)下表为两种培养基的配方，步骤④应选其中的________培养基，原因是___________________________________________________________________。 培养基类型 培养基组分 Ashby 培养基 甘露醇(C6H14O6)、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、K2SO4、CaCO3、蒸馏水、琼脂 LB培养基 蛋白胨、酵母提取物、NaCl、蒸馏水、琼脂 (3)步骤④所用的接种工具是________，若在④的平板上统计的菌落的平均数量为126个，则每克土壤中含有的固氮菌为________个。 (4)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48小时，经离心后收集下层细胞并转移至特定培养基中进行固氮能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验，30天后测定土壤微生物有机氮含量，结果如图。 注：CK：对照处理组；N：尿素处理组(每盆土壤中50 mL有氮全营养液：成分为在1 000 mL无氮植物营养液中加入0.12 g尿素)；CM12：自生固氮菌CM12处理组(每盆土壤浇50 mL接种自生固氮菌的无氮植物营养液)。 ①对照组(CK)的处理为_____________________________________________。 ②实验结果表明：施用尿素处理和接种固氮菌CM12处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比，CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了约________%(保留1位小数)。 ③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，原因是_________________________________________________________________。 22.某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了随机取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下： 请分析并回答下列问题： (1)该实验中含有琼脂的培养基从物理性质来说，属于________培养基，培养基中只选择了________作为唯一氮源。 (2)分解尿素的细菌能产生________酶，将尿素分解为____________________________________________________________________。 (3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，需要进行梯度稀释的原因是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (4)实验结果：6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、501、688，7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97，8号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的估算数目是_______________________________________________________________个。 23.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。回答下列问题： (1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________四类，为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)： 酵母膏 无机盐 淀粉 纤维素粉 琼脂 刚果红溶液 水 培养基甲 ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ 培养基乙 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ 注：“＋”表示有，“－”表示无。 (2)据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________________________________________。 (3)据表判断，培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是___________________________________________________。 (4)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。 (5)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_________________________________________________________________。 24.饲养动物常用的植物饲料中含有难溶解的植物钙，很难被动物吸收利用，如在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从土壤中分离产植酸酶细菌菌株的过程示意图。    (1)在实验室培养微生物， 是研究和应用微生物的前提。 (2)为了解土壤中产植酸酶的细菌数量，取1g土壤加入99mL无菌水，制备成细菌悬液，经 后，获得细胞密度不同的细菌悬液。若将最后一个试管中的菌液每次吸取0.1mL涂布到三个培养基。一段时间后，菌落数分别是168、175、167个，则1g土壤中含有此菌的菌体数 个。该方法计数结果往往比实际值偏低，原因是 。 (3)制备产植酸酶的细菌菌株初筛平板是，需要将培养基的pH调至 性。该培养基可采用 法进行灭菌，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌植酸钙粉末，充分混合后到平板，加入植酸钙的目的是 ，达到检测菌种分泌植酸酶的能力。 (4)实验结果显示A~E五种菌株中， 是产植酸酶最理想的菌株。 25．市政污泥堆肥过程中大量释放的含硫臭气不仅会污染周围环境，也会降低堆肥质量。研究人员按下图所示流程从污泥堆肥物料中筛选纯化出一株耐高温硫氧化菌LYH-1。     (1)实验中用到的培养基常用 法进行灭菌，该方法灭菌的原理是 。 (2)③过程配置一系列不同浓度的菌液，若将不同浓度的菌液分别涂布到平板上培养，从中选择出菌落数为 的平板可用于进行计数。 (3)涂布平板后每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目 时的记录作为结果。 (4)⑤过程发现以葡萄糖为碳源时，LYH-1菌株硫氧化产物硫酸盐产量最高，葡萄糖在LYH-1菌株生长代谢过程中的作用是 （答出两点即可）。 (5)将筛选出的LYH-1菌株连续培养多代，将每一代都接种在适宜培养基上，在55℃高温条件下培养，比较硫酸盐的生产量。若每代硫酸盐产量 ，说明其能稳定遗传。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司1 / 15 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用 学习目标 1.概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。 2.阐明微生物选择培养的原理。 3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 学习重点：微生物纯培养的基本操作要求，微生物选择培养的原理；酵母菌的纯培养。 学习难点：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 ～ 1.培养基：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质。其作用是培养、分离、 。 （1）营养物质：水、 （提供碳元素的物质）、 （提供氮元素的物质）和无机盐。 （2）培养基按物理性质分为 培养基：不加凝固剂，常用于 ；半固体培养基：加凝固剂，用于 ； 培养基：加凝固剂，用于微生物的分离、 和 。 （3）按功能分为 ：依据微生物对某些物质的特殊需求或抗性设计。用于培养、分离特定微生物； ：鉴别不同种类的微生物； （4）培养基的配制要求：提供水、无机盐、碳源、氮源等主要营养物质要求，满足微生物生长对 的需求，培养霉菌时，需要将培养基调至 ，培养细菌时，需将培养基调至 ，培养厌氧微生物时，需提供 条件。 2.无菌技术：获得纯净的微生物的关键是 。 （1）消毒和灭菌：消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分 ，灭菌指施用强烈的理化方法杀死物体内外 的微生物，包括 。 （2）消毒和灭菌后，要避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触；为避免周围环境中微生物污染，许多操作都应在 并在 进行。 3.微生物的纯培养：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的特定种类微生物的群体称为培养物。由 繁殖所获得的微生物群体称为 ，获得纯培养物的过程就是纯培养 （1）纯培养的步骤：微生物的纯培养包括 →灭菌→接种→ 等步骤。 （2）酵母菌的纯培养 ①原理：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的，由一定形态的 ，这就是 。采用 和 能将单个微生物分散在 上，之后经培养得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 ②方法步骤：配制培养基→灭菌→倒平板→ →培养酵母菌 ③配制培养基：称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g （也可用蔗糖代替）、15～20g ，用蒸馏水定容至1000mL。 ④灭菌：将配制好的培养基转移到 中，加棉塞，包上 ，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为 、温度为 的条件下，灭菌15～30min。将5～8套培养皿宝成一包，用基层牛皮纸包紧，放入敢惹灭菌箱内，在 灭菌2h。 ⑤倒平板：待培养基冷却至 左右时，在酒精灯火焰附近到平板。拔出锥形瓶的棉塞，将锥形瓶瓶口通过 ，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）导入 ，立即盖上培养皿该。 ⑥接种和分离酵母菌：通过接种环在固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经 后培养，可以分离得到单菌落。 ⑦培养酵母菌：完成划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 左右的恒温箱中培养 。 4.微生物的选择培养（以分解尿素的细菌分离为例） ①铲取土样，将土样装入 中。 ②将 土样加入盛有 无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取 上清液加入盛有 无菌水的试管中，依次等比稀释。 ③取 菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有 的烧杯中。 ⑤将涂布器放在 ，待酒精燃尽，涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀涂布在 。涂布时可转动 ，使涂布均匀。 ⑦待涂布的菌液被 吸收后，将平板倒置，放在 的恒温箱中培养 。 ⑧在涂布有 的平板上观察分离单菌落。 5.微生物的数量测定 ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为 的平板进行计数。 ②在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。 ③统计的菌落数往往比活菌的实际数 ，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用 数而不是 数来表示。 ④利用 进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。 【答案】1.营养物质 生长繁殖 鉴定、保存微生物或其代谢物 （1）碳源 氮源 （2）液体 工业生产 观察微生物的运动 固体 鉴定、计数 菌种保藏 （3）选择培养基 鉴别培养基 （4）pH、特殊营养物质及O2 酸性 中性或弱碱性 无氧 2.防止杂菌污染 （1）微生物 所有 芽孢和孢子 （2）超净工作台 酒精灯火焰附近 3.单一个体 纯培养物 （1）配制培养基 分离和培养 （2）①子细胞群体 菌落 平板划线法 稀释涂布平板法 固体培养基 ②接种和分离酵母菌 ③葡萄糖 琼脂 ④锥形瓶 牛皮纸 100kPa 121℃ 160～170℃ ⑤50℃ 酒精灯火焰 培养皿 ⑥连续划线 数次划线 ⑦28℃ 24～48h 4.①纸袋 ②10g 90mL 1mL 9mL ③0.1mL ④酒精 ⑤酒精灯火焰上灼烧 ⑥培养基表面 培养皿 ⑦培养基 30～37℃ 1～2d ⑧合适浓度菌液 5.①一个活细菌 30～300 ②3 平均值 ③少 菌落 活菌 ④显微镜 1．为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离和培养等工作，得到下图所示的两种实验结果。请回答下列问题：    (1)该实验中所用到的培养皿、接种环、培养基等均需进行灭菌处理，其中可用灼烧灭菌法进行灭菌的是 ，必须用湿热灭菌法进行灭菌的是 ，它不使用干热灭菌的原因是 、 (2)接种前，为了检测培养基平板灭菌是否合格，可以采用的方法是 。 (3)如果要进行细菌计数，应采用图示 （填编号）的接种方法。将1mL水样稀释1000倍，在3个平板上分别接入0.1mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，则每升水样中的活菌数为 。 (4)采用图示A方法分离水样中的细菌时，为了将聚集的菌体分离获得单个菌落，在第二次及以后的划线时，一定要 。通常情况下，对获得的纯菌种可以依据 对细菌进行初步的鉴定和分类。 (5)将分离得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。原因是振荡培养能提高培养液中 的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。 【解析】（1）灼烧灭菌法一般用于接种环、接种针或其他金属工具的灭菌，所以可用灼烧灭菌法进行灭菌的是；常采用高压蒸汽灭菌对培养基进行灭菌，而高压蒸汽灭菌是湿热灭菌法的一种。干热灭菌法针对需要保持干燥的物品，若选干热灭菌法会使培养基中的水分蒸发，且干热灭菌温度过高导致培养基营养成分被破坏，因此对液体培养基进行灭菌时不选择干热灭菌法。 （2）为验证培养基灭菌是否合格，应随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，观察是否有菌落产生，若无菌落出现即为合格。 （3）B稀释涂布平板法才能用于对细菌计数。由题意知1ml水样中的菌落数是（39+38+37）÷3÷0.1×1000=3.8×105个，每升水样中的活菌数为3.8×105×103=3.8×108。 （4）平板划线法在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐渐稀释分散以便获得由单个细胞繁殖而来的菌落。不同的微生物形成的菌落不同，对获得的纯菌种可以依据菌落的形状、大小、颜色等菌落特征对细菌进行初步的鉴定和分类。 （5）振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快，这是因为振荡培养能提高培养液中溶解氧的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，从而达到扩大培养。 【答案】(1)接种环 培养基 干热灭菌法会使培养基中的水分蒸发 干热灭菌温度过高导致培养基营养成分被破坏 (2)随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，观察是否有菌落产生 (3)B 3.8×108 (4)从上一次划线的末端开始划线 菌落的形状、大小、颜色等菌落特征 (5)溶解氧/氧气/O2 营养物质 2．硝基苯酚是工业污水中的重要污染物，某同学欲从污水处理厂的污泥中分离能分解硝基苯酚的细菌。请回答下列有关问题： （1）为了筛选出污泥中可分解硝基苯酚的细菌，在配制培养基时应选择 作为主要碳源。判断培养基灭菌是否合格的思路是 。 （2）纯化菌株时，通常使用的划线工具是 。某个平板经培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他线上有菌落，分析造成第二划线区域第一条线上无菌落的可能原因有：① ；② 。 （3）进行梯度稀释时的一般操作是将1mL菌液移入盛有 mL无菌水的试管中，常用 法进行活菌计数。 （4）实验数据显示，当培养基中加入碳源——葡萄糖时，该细菌降解硝基苯酚的速率明显提高，原因可能是 。 【解析】（1）在配置培养基时应选择硝基苯酚作为主要的碳源，进而筛选污泥中可分解硝基苯酚的细菌，如果培养基中含有其他碳源，不能保证筛选出可分解硝基苯酚的细菌。判断培养基灭菌是否合格时可将未接种的培养基和接种菌液的培养基一同放入适宜条件下培养，观察未接种的培养基上是否有菌落生长。 （2）纯化菌株时，通常使用接种环进行平板划线，划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其它划线上有菌落，可能原因有接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始。 （3）进行梯度稀释时，需要将1mL菌液移入盛有9mL的无菌水中，以使其稀释10倍。稀释涂布平板法常用来进行微生物的计数，其原理是培养基表面的一个菌落来源于（稀释液中的）一个活菌。 （4）实验数据显示，当培养基中加入碳源—葡萄糖时，该细菌降解速率明显提高，是因为葡萄糖是主要的能源物质，此时能源充足，细菌代谢加快。 【答案】 硝基苯酚 将未接种的培养基和接种菌液的培养基一同放入适宜条件下培养，观察未接种的培养基上是否有菌落生长 接种环 接种环灼烧后未充分冷却 划线未从第一区域末端开始 9 稀释涂布平板 能源充足，细菌代谢加快 3．纤维素是地球上年产量巨大，但未能得到充分利用的物质，尤其以农作物秸秆为甚，我国年产约6亿吨。对其研究利用的报道较多，能降解纤维素的微生物种类很多，目前的研究以丝状真菌为主。请回答下列问题： （1）食草动物能够消化食物的关键是体内存在能合成 酶的微生物，能够降解纤维素，该酶是一种复合酶，它至少包括 。 （2）目前，研究者多利用以 为唯一碳源的培养基从土壤中分离纤维素分解菌。为检测纤维素分解菌的存在与否还应加入 染料，形成 色复合物，若产生 ，则证明有纤维素分解菌存在。 （3）下图是工业上利用微生物由纤维素生产乙醇的基本工艺流程：上述工艺流程中环节①需要的微生物大多分布在 的环境中。④过程要注意对接种器材进行 。 【答案】（1）纤维素 C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 （2）纤维素 刚果红 红色 透明圈 （3）富含纤维素（答案合理即可） 灭菌 【解析】（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖；正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人粪所利用。 （2）一般利用添加了纤维素的选择培养基分离纤维素分解菌，利用刚果红染色法筛选纤维素分解菌，这种方法能够通过在培养基中加入刚果红，看是否产生透明圈直接对微生物进行筛选。 （3）能产纤维零酶的微生物应多分布于富含纤维素的环境。接种前要对接种器材进行灭菌处理。 4．乳酸菌和我们的生活紧密相连，现欲从泡菜滤液中分离乳酸菌。请回答下列相关问题。 （1）要纯化培养乳酸菌，在配制固体培养基时，除了要加入各种营养物质外，一般还要加入琼脂。培养基中的(NH4)2CO3 （能/不能）为乳酸菌提供碳源 ，原因是 。 （2）纯化培养乳酸菌时，可采用 法进行接种。为了能鉴别乳酸菌菌落，往往在配制培养基时加入碳酸钙，原因是 。 （3）甲、乙同学测定泡菜滤液中微生物的浓度。在对应稀释倍数为105的培养基中，得到以下两种统计结果：乙同学在该浓度下涂布了平板，统计的菌落数为49；丙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为43、54、287，然后取其平均值128作为统计结果。 请评价这两位同学的实验结果的有效性。 ①乙同学的结果 ，原因是 。 ②丙同学的结果 ，原因是 。 （4）丁同学采用血细胞计数板计数(规格为16×25，16个中方格，每个中方格有25个小方格，体积为0.1mm3)，统计4个中格中的细菌数，计算出每个小格所含细菌的平均数为3个， 则每毫升样品中的细菌数是(稀释倍数为104) 个。 【解析】（1）由于乳酸菌为异养生物，只能利用含碳有机物，因此培养基中的(NH4)2CO3不能为乳酸菌提供碳源。 （2）纯化培养乳酸菌时，可采用平板划线法或稀释涂布平板法进行接种。由于乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙，形成透明圈，因此为了能鉴别乳酸菌菌落，往往在配制培养基时加入碳酸钙。 （3）①甲同学的实验结果是无效的，因为其只涂布了一个平板，没有设置重复实验，结果不具有说服力。 ②乙同学的实验结果也是无效的，因一个平板上的菌落计数结果与另外两个相差太大，不能简单的用其平均数。 （4）根据题干提供的数据进行计算，每毫升样品中的细菌数(稀释倍数为104)=3×16×25÷0.1×1000×104=1.2×1011。 【答案】（1）不能 乳酸菌为异养生物只能利用含碳有机物 （2）平板划线法或稀释涂布平板法 乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙，形成透明圈 （3）①无效 没有设置重复实验，结果不具有说服力 ②无效 一个平板上的菌落计数结果与另外两个相差太大 （4）1.2×1011 1.微生物是指那些形体微小、单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚至是没有细胞结构的低等生物的统称。 2.菌落都是由单个细菌形成的细菌集团。这个说法是错误的。 3.培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。 4.没有生物活性的材料都可采用高压蒸汽灭菌。 5.配制培养基时应先灭菌再调pH。 6.倒平板时，应将打开的培养皿盖放在一边，以免培养基溅在培养皿盖上。 7.为防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 8.对细菌进行计数，只能采用稀释涂布平板法。 9.稀释涂布平板法计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数少。 【答案与提示】 1、3、9√ 2.× 如果一个菌落是由一个细菌菌体生长、繁殖而成，则称为纯培养。 4.×高压蒸气灭菌法:用高温加高压灭菌，不仅可杀死一般的细菌，对细菌芽胞也有杀灭效果，是最可靠、应用最普遍的物理灭菌法。主要用于能耐高温的物品，不耐高温的化纤织物不能用高压蒸汽灭菌。 5.× 培养基配置的步骤为：计算→称量→溶化→调pH→灭菌→倒平板。 6.× 倒平板时，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）导入培养皿，立即盖上培养皿该。 7.× 接种环灼烧后，要冷却后才能接触菌落，以免温度太高杀死菌种。 8.× 细菌计数可采用间接计数法（稀释涂布平板法），也可采用直接计数法（显微计数法） 探究一 培养基的配制 1.培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。用于培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。请思考讨论下面的问题。 （1）培养基配制需要遵循什么原则? （2）培养基的营养构成有什么特点？ （3）微生物对主要营养物质的需求有什么特点？ 【答案】 （1）配制培养基需要遵循以下原则：①目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。 ②营养要协调：配制培养基要注意营养物质的浓度和比例。 ③pH要适宜：不同微生物所需pH不同，要根据培养微生物的种类确定培养基的pH。如真菌为5.0～6.0，细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5。 （2）不同微生物需要的营养构成存在差异，配制培养基要根据培养微生物的营养需求特点。 ①各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、无机盐、碳源和氮源。 ②不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及O2的要求。 （3）要考虑不同微生物对主要营养物质的需求特点 ①自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2；氮源可由无机盐提供，如硝酸盐等。 ②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，碳源由含碳有机物提供，如糖类等；氮源也主要由有机物提供，如尿素、牛肉膏等；不分异养型微生物也可以利用无机氮源。 探究二 选择培养基 2. 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。PCR是一种体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。 （1） 筛选耐高温（93℃）的DNA聚合酶的思路。 （2）寻找耐高温的DNA聚合酶给我们什么样的启示？ （3）土壤中含有分解尿素的细菌，设计一种培养基配方配制培养基筛选分解尿素的细菌。 【答案】（1）含有耐高温的DNA聚合酶的生物应能够在高温条件下生存，要筛选耐高温的生物应在高温环境生存，而绝大多数生物在高温条件下不能生存，因此，应在高温环境如热泉、火山口等地方生存的生物筛选出耐高温的生物，进而筛选耐高温的酶。 （2）寻找目的菌种时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 （3）用尿素作为唯一氮源，其他营养成分与普通培养基基本相同。 探究三 倒平板 3.倒平板操作是一项基本的微生物实验技术，操作步骤包括：1.将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。3.用左手将培养皿滚燃打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。4.等待平板冷却凝固（大约需纯备晌5～10min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。思考下面的问题： （1）到平板时为什么需要使锥形瓶的瓶口过火焰？ （2）培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时才能用来到平板。常用什么方法估计培养基的温度？ （3）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ （4）怎样确定所到平板未被杂菌污染？平板划线时注意事项有哪些？ 【答案】（1）在倒平板的过程中，为了避免外界环境中杂菌的污染，需要对整个操作区域进行适当的无菌处理。具体来说，当打开装有培养基的锥形瓶时，瓶口会暴露在空气中，这可能会导致空气中的微生物进入瓶中，从而污染培养基。为了防止这种情况发生，需要在火焰旁取下装有培养基的瓶塞，并在倒平板前让锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。 （2）用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 （3）平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染，以及避免培养基中的水分过快的挥发。 （4）一般来说，未受污染的菌落会呈现出其特有的形态、大小、颜色和边缘特征。而受到污染的菌落可能会出现杂乱无章的其他菌落，或者原本应该均匀一致的菌落特征变得多样化。例如，如果平板上原本应该生长的是单一类型的细菌菌落，但出现了不同大小、颜色或形态的其他菌落，这就可能是受到了污染。平板划线时注意事项有：划线时力度不能过大，以免划破培养基；划线的线条宜平行、密集、整齐，以充分利用平板面积；需要分区的时候，划完一个区后必须烧去接种环上的残菌，待冷却后再划另一个区。 · 基础过关练 1．下列关于无菌操作的叙述，正确的是（    ） A．煮沸消毒不能杀死微生物的细胞 B．应尽量选择脱脂棉塞住试管口，否则容易造成吸水污染 C．配置培养基时应该先灭菌再调节pH D．对于接种间应采用紫外线或药物熏蒸的方法进行杀菌或消毒 【解析】D 煮沸消毒法100℃煮沸5-6分钟只能杀死部分生活状态的微生物细胞，不能杀死芽孢、孢子，A错误；由于脱脂棉吸水后容易引起污染，所以制作棉塞应该使用普通棉花，而不能使用医用的脱脂棉，B错误；为避免杂菌污染，应先调节pH再灭菌，C错误；紫外线能破坏DNA结构，对于接种间应采用紫外线或药物熏蒸的方法进行杀菌或消毒，以营造无菌环境，D正确。 2．下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，不正确的是（    ） A．显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大 B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落 C．采用稀释涂布平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数 D．统计菌落数目时，只要菌落数目在30～300的平板都可以计数，并以它们的平均值作为统计结果 【解析】D 由于显微镜直接计数无法区分死菌和活菌，故采用显微镜直接计数统计的结果比实际活菌数多，A正确；当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落，因而可用稀释涂布平板法进行微生物分离和计数，B正确；采用稀释涂布平板计数法获得的菌落有可能是由多个细胞聚集在一起繁殖形成的，所以往往少于实际的活菌数，C正确；为了保证结果准确，一般采用菌落数在30-300的平板进行计数，且要求在同一个稀释倍数下，且空白对照的菌落上没有菌落出现，D错误。 3．实验室常用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，下列相关叙述正确的是（    ） A．放入待灭菌物品后，关闭排气阀，即可打开电源加热 B．一般在压力为100kPa、温度121℃的条件下灭菌10min C．高压蒸汽灭菌法可以杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 D．若压力达到设定要求时，锅内没有达到相应温度，说明灭菌锅的温度计测量有误 【解析】C 放入待灭菌物品后，加热灭菌锅，打开排气阀，排除锅内冷空气，A错误；为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100KPa，温度为121℃的条件下，维持15-30min，B错误；高压蒸汽灭菌法是常用的湿热灭菌法之一，可以杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，C正确；若压力达到设定要求，而锅内没有达到相应温度，最可能的原因是未将锅内冷空气排尽，D错误。 4．灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是（    ） A．为了防止杂菌污染，应将配制好的选择培养基分装到培养皿中再进行高压蒸汽灭菌 B．配制培养基、倒平板、接种均需要在酒精灯火焰旁进行 C．为防止蛋白质变性，不能用高压蒸汽灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌 D．可用干热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌 【解析】D 配制好的选择培养基应先进行高压蒸汽灭菌然后再进行倒平板操作，即分装到培养皿，A错误；配置好的培养基需要灭菌，故配制培养基不需要在酒精灯火焰旁进行，倒平板、接种均需要在酒精灯火焰旁进行，B错误；一般用高压蒸汽灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，防止杂菌污染，C错误；可用高压蒸汽灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，也可用干热灭菌法进行，D正确。 5．下表是培养某种微生物的培养基配方，以下说法正确的是（    ） 成分 NH4NO3 KH2PO4 CaCl2 FeSO4 维生素 蒸馏水 含量 0.5g 3.0g 0.5g 0.5g 少许 定容至1000ml A．该培养基中含有碳源、氮源、水和无机盐四类物质 B．该培养基可用来培养硝化细菌，不能用来培养酵母菌 C．该培养基在培养硝化细菌时，需要密封 D．要用该培养基培养酵母菌，需要加入葡萄糖作为氮源 【解析】B 分析题表可知，该培养基中不含有碳源，A错误；由A分析可知，该培养基中不含有碳源，而酵母菌是异养生物，硝化细菌是自养生物，其可以利用空气中CO2来合成有机物，因此该培养基可用来培养硝化细菌，不能用来培养酵母菌，B正确；硝化细菌需要利用空气中的CO2来合成有机物，因此该培养基在培养硝化细菌时，不能密封，C错误；要用该培养基培养酵母菌，需要加入葡萄糖作为碳源，D错误。 6．在微生物培养的过程中，需要通过选择培养或鉴别培养的方法来筛选出目标菌种，下列与之相关的叙述中不正确的是（    ） A．纤维素分解菌能够将淀粉分解为葡萄糖 B．尿素分解菌能够将尿素分解为氨，从而使酚红指示剂变红 C．在培养基中加入抗生素能够筛选出具有相应抗性的菌株 D．在含有碳酸钙的培养基上生长的乳酸菌菌落周围会出现“溶钙圈” 【解析】A 纤维素分解菌可以产生纤维素酶将纤维素分解为葡萄糖，根据酶的专一性可推测，纤维素分解菌应该不能够分解将淀粉分解为葡萄糖，A错误；尿素分解菌能够将尿素分解为氨，从而使培养基的pH上升，酚红指示剂变红，B正确；在培养基中加入抗生素能够正常生长的是具有相应抗性的菌株，进而可将其筛选出来，C正确；在含有碳酸钙的培养基上生长的乳酸菌菌落周围会出现“溶钙圈”，因为乳酸菌产生的乳酸可以和碳酸钙反应并将其溶剂，表现出溶钙圈，D正确。 7．某同学用下表所示的培养基培养纤维素分解菌。下列叙述正确的是（　　）（青霉素会抑制细菌生长） 成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4 葡萄糖 H2O 青霉素 含量 3g 1g 0．5g 0．5g 0．01g 30g 1L 0．1万单位 A．根据物理性质，该培养基属于固体培养基 B．该培养基可用来筛选抗青霉素的微生物 C．该微生物的培养基适合新冠病毒的培养 D．该培养基用于培养纤维素分解菌，应除去葡萄糖，添加纤维素 【解析】B 该培养基不含琼脂，根据物理性质，该培养基属于液体培养基，A错误；该培养基中加入了青霉素，具有抑制细菌生长的作用，可用来筛选抗青霉素的微生物，B正确；病毒必须依赖于活细胞才能生存，而培养基是没有生命的有机物或无机物，病毒在上面不能生存，C错误；青霉素能抑制细菌生长，故该培养基中除去（CH2O）和青霉素，添加纤维素才可进行培养纤维素分解菌，D错误。 8．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃，土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃作为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是（    ） A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用 B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基 C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上 D．在选择培养基上能形成分解圈的可能为所需菌种 【解析】C 筛选能够利用多环芳烃为碳源的菌种，应在被原油污染的土壤中获取，所以应配制来源于被原油污染的土壤稀释液作为菌液进行接种，A正确；配制选择性培养基，该培养基与通用培养基成分的主要区别应该是以原油（多环芳烃）为唯一碳源，这样在该培养基上只有能分解原油的微生物能在该培养基上生长，而其他微生物的生长被抑制，B正确；在无菌环境下，将土壤稀释液接种到选择培养上，若将土壤稀释液灭菌后会杀死原有菌种，导致实验失败，C错误；题意显示，有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈”，据此可知，在选择性培养基上能形成分解圈的即为所需菌种，D正确。 · 能力提升练 9.微生物培养过程中，要重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，正确的是(　　) A.煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子 B.将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌 C.加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌 D.家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 【解析】B　煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢，而灭菌能杀灭环境中一切微生物，包括孢子和芽孢，A错误；指示剂和染料可能混有微生物，因此加入培养基中的指示剂和染料也需要灭菌，C错误；家庭制作葡萄酒时，要将容器进行灭菌或消毒，但是葡萄不能灭菌，因为发酵用的酵母菌来自葡萄，D错误。 10.下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　) A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pH B.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行 C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次 D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要 【解析】B　步骤①表示倒平板，培养基需要先调节pH后灭菌，冷却后倒平板，A错误；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以完成步骤③到步骤④的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，步骤③到步骤④的过程中共需灼烧接种环6次，C错误；步骤④操作结束后需在培养皿的底上做好标记并倒置后放入培养箱中进行培养，D错误。 11.北京冬奥会食堂让各国运动健儿爱上中国味道，其餐余垃圾在垃圾集中点采用生化＋雾化＋膜过滤技术处理后，可以达到无二次污染的标准。为筛选对抗生素有抗性、高效降解淀粉的微生物，提高“生化”处理的效率，研究人员将餐余垃圾机械化处理后加入装有无菌水的锥形瓶中制备餐余垃圾浸出液，然后进行如图所示操作，下列说法错误的是(　　) A.餐余垃圾浸出液在接种前通常需要进行高压蒸汽灭菌处理 B.可用稀释涂布平板法将餐余垃圾浸出液接种在X培养基上 C.X培养基含有淀粉和抗生素，Y培养基是不含琼脂的液体培养基 D.图中降解淀粉最高效的微生物是⑤，可根据菌落特征初步判断微生物类型 【解析】A　餐余垃圾浸出液中含有要筛选出的目的微生物，在接种前进行高压蒸汽灭菌处理，会将所有的微生物都处理掉，包括我们想要的目的微生物，A错误；微生物常见的接种方法有2种：平板划线法和稀释涂布平板法，两种方法都能得到单个菌落，后者还能计数统计微生物的数目。所以可用稀释涂布平板法接种，B正确；目的菌是对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的微生物，则X培养基应含有淀粉和抗生素；Y培养基应是液体培养基，用来增加菌种的数量，不应含凝固剂琼脂，C正确；淀粉遇碘变蓝，加入碘液后能分解淀粉的菌落周围会出现清晰的透明圈，所以降解能力越强，透明圈越大，图中降解淀粉最高效的是⑤，D正确。 12.灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　　) A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行 B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染 C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌 D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌 【解析】D　动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养一般不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。 13.解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　) A.甲菌属于解脂菌 B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力 【解析】B　根据题意，甲、乙两种菌分别接种在醇溶青琼脂平板上，二者都能生存，甲周围呈现深蓝色，说明培养基的脂肪被分解为脂肪酸，使平板呈现深蓝色，脂肪的分解需要脂肪酶的催化，说明甲能够分泌脂肪酶，属于解脂菌，A正确；乙周围不变色，说明乙不能分泌脂肪酶分解脂肪，没有脂肪酸的产生，不能利用脂肪，但由于乙能在该培养基上生存，说明该培养基中除了脂肪作为碳源外，还存在别的碳源，否则乙不能在该培养基上生存，B错误；为了便于比较结果，可以将两种菌接种到同一平板的不同区域，C正确；菌落周围深蓝色的直径越大，说明解脂菌分泌脂肪酶的能力越强，D正确。 14.青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是(　　) A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖 B.可用深层通气液体发酵技术提高产量 C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中 D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌 【解析】D　青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。 15.培养基是人们按照培养对象对营养物质的不同需求配制的营养基质。下列有关培养基的配制和使用的叙述，正确的是(　　) A.微生物培养基的组成成分必需含有碳源、氮源、水和无机盐 B.用动、植物的体细胞进行细胞培养，均可用固体培养基 C.接种前要了解固体培养基是否被污染可接种蒸馏水来培养检测 D.使用过的微生物培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃 【解析】D　微生物培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中不需加入氮源，A错误；动物的体细胞进行细胞培养用液体培养基，而植物的体细胞进行细胞培养用固体培养基，B错误；检测培养基是否被污染的方法是：将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生，C错误；使用过的微生物培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃，以防止微生物污染环境和感染操作者，D正确。 16.为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是(　　) A.采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本 B.培养细菌时，可选有牛肉膏蛋白胨固体培养基 C.土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落 D.鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法 【解析】C　采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机采样，A正确；牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等，可用于细菌的培养，B正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，C错误；不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借助生物化学的方法进行鉴定，D正确。 17.在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列相关叙述，错误的是(　　) A.玻璃和金属材质的实验器具可放入干热灭菌箱中干热灭菌 B.接种前后的接种环都要在酒精灯的火焰上进行灼烧消毒 C.没有将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽将影响培养基的灭菌效果 D.喷洒石炭酸同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果 【解析】B　在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌，一些金属材质的实验器具也可以灼烧灭菌，A正确；为了防止杂菌污染和感染操作者，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B错误；若未将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽，会因达不到规定温度而影响灭菌的效果，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭空间常采用紫外线照射消毒，喷洒石炭酸同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果，D正确。 18.餐厨垃圾中具有高效降解能力的微生物，可用于餐厨垃圾高效无害化处理。科研人员取一定量的餐厨样品，制备不同浓度的样品稀释液，并将样品接种于利用蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂配制的培养基表面进行培养并分离。下列分析正确的是(　　) A.牛肉膏主要为微生物提供氮源 B.接种时需用力将菌种接种到培养基内 C.稀释样品获得单个菌落以便判断菌种类型 D.经过培养可筛选出有高效降解能力的微生物 【解析】C　牛肉膏主要为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素等，A错误；在培养基接种菌种时，应将菌种接入培养基表面，有利于其生长，如果用力接种会划破培养基，从而会影响菌株的生长，不能形成正常的特征形态，影响对菌落形态的观察及特征鉴别，B错误；该培养基为基本培养基，不能选出有高效降解能力的微生物，经过培养、筛选后还需要进行鉴定，才能选出有高效降解能力的微生物，D错误。 19.某学习小组从富含纤维素分解菌土壤中获取纤维素分解菌并进行了下列操作：称取土样20 g，加入装有30 mL培养基的摇瓶中并完成稀释，在30 ℃下将摇瓶置于摇床上振荡培养；吸取一定的培养液，转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊时，吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，以达到分离纯化培养的目的。下列叙述正确的是(　　) A.取样土壤须在无菌条件下，用蒸馏水稀释 B.为确定所用的固体培养基是否灭菌严格，应选择未接种的牛肉膏蛋白胨培养基进行空白培养 C.摇床上振荡培养的目的是保证纤维素分解菌所需要的有氧环境及提高营养物质的利用率 D.在所用的固体培养基中添加刚果红，若存在纤维素分解菌，则其菌落周围会呈现红色的透明圈 【解析】C　取样土壤须在无菌条件下，用无菌水稀释，这样可以避免杂菌污染，A错误；为检测所用的固体培养基是否灭菌严格，应选择未接种的上述培养基进行空白培养，若无菌落出现，则说明配制的固体培养基合格，B错误；摇床上振荡培养不仅能保证纤维素分解菌所需要的有氧环境，而且还可以使菌体和营养液充分接触，进而提高营养物质的利用率，C正确；在所用的固体培养基中添加刚果红，随着纤维素被分解利用，若存在纤维素分解菌，则其菌落出现透明圈，D错误。 20.双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。在培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至45~48℃，然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，根据噬菌斑的数目可计算原液中噬菌体的数量。下列叙述错误的是（ ） A. 倒平板前需利用不同方法对培养基和培养皿进行灭菌 B. 若利用双层平板法对T2噬菌体进行计数，可选用乳酸菌为敏感指示菌 C. 上层平板中出现噬菌斑的原因是噬菌体侵染宿主细菌使其裂解死亡 D. 若上层平板中琼脂浓度较低，可能形成的噬菌斑较大，有利于计数 【解析】B 对培养基进行灭菌，常用高压蒸汽灭菌法，而对培养皿进行灭菌，常用干热灭菌，A正确；T2噬菌体是专门寄生在大肠杆菌中的病毒，故T2噬菌体的宿主细菌是大肠杆菌，不能用其他细菌代替，B错误；噬菌体寄生于宿主细菌内，二者混合培养一段时间后，在上层平板上出现一些噬菌斑，这是噬菌体侵染宿主细菌使其裂解死亡所致，C正确；与底层平板相比，上层平板中琼脂浓度较低的好处是形成的噬菌斑较大，有利于计数，D正确。 · 思维拓展练 21.自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中N2的细菌，将玉米种子用自生固氮菌拌种后播种，可显著提高产量并降低化肥的使用量。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图。回答下列问题： (1)步骤①土样应取自当地表层土壤的原因是_____________________________； 步骤②需充分振荡的主要目的是______________________________________。 (2)下表为两种培养基的配方，步骤④应选其中的________培养基，原因是___________________________________________________________________。 培养基类型 培养基组分 Ashby 培养基 甘露醇(C6H14O6)、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、K2SO4、CaCO3、蒸馏水、琼脂 LB培养基 蛋白胨、酵母提取物、NaCl、蒸馏水、琼脂 (3)步骤④所用的接种工具是________，若在④的平板上统计的菌落的平均数量为126个，则每克土壤中含有的固氮菌为________个。 (4)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48小时，经离心后收集下层细胞并转移至特定培养基中进行固氮能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验，30天后测定土壤微生物有机氮含量，结果如图。 注：CK：对照处理组；N：尿素处理组(每盆土壤中50 mL有氮全营养液：成分为在1 000 mL无氮植物营养液中加入0.12 g尿素)；CM12：自生固氮菌CM12处理组(每盆土壤浇50 mL接种自生固氮菌的无氮植物营养液)。 ①对照组(CK)的处理为_____________________________________________。 ②实验结果表明：施用尿素处理和接种固氮菌CM12处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比，CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了约________%(保留1位小数)。 ③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，原因是_________________________________________________________________。 【答案】　(1)在富含有机质的土壤表层，有更多的固氮菌生长　使土壤中的微生物充分释放到无菌水中　(2)Ashby　该培养基不含氮源，具有选择作用，自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，LB培养基中的蛋白胨可以提供氮源，不具有选择作用　(3)涂布器　1.26×107　(4)①每盆土壤浇50 mL无氮植物营养液 ②83.3　③自生固氮菌能在土壤中独立固氮，不受宿主的限制 22.某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了随机取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下： 请分析并回答下列问题： (1)该实验中含有琼脂的培养基从物理性质来说，属于________培养基，培养基中只选择了________作为唯一氮源。 (2)分解尿素的细菌能产生________酶，将尿素分解为____________________________________________________________________。 (3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，需要进行梯度稀释的原因是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (4)实验结果：6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、501、688，7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97，8号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的估算数目是_______________________________________________________________个。 【解析】　(1)琼脂可作为凝固剂，故从物理性质来说，含琼脂的培养基属于固体培养基。筛选分解尿素的细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源。(2)分解尿素的细菌产生的脲酶能将尿素分解为NH3和CO2。(3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大，所以需进行梯度稀释，取菌落数为30～300个的平板进行计数，实验结果最准确。(4)由于平板计数的适宜值在30～300之间，所以应选择7号试管涂布的平板进行计数，其平均菌落数为(58＋73＋97)/3＝76个，据图可知，10 g土壤样品经梯度稀释至7号试管，稀释度为108倍，而不是107倍，因为在锥形瓶处已经稀释10倍，所以利用公式计算每克土壤样品中的菌落数：(C÷V)×M＝(76÷0.1)×108＝7.6×1010个，但要特别注意，此时求出的是1 g土壤中的微生物数量，所以该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的数目是7.6×1010×10＝7.6×1011个。 【答案】(1)固体　尿素　(2)脲　NH3和CO2 (3)只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大。进行梯度稀释时，取菌落数为30～300个的平板进行计数，所得的实验结果最准确(合理即可) (4)7.6×1011 23.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。回答下列问题： (1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________四类，为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)： 酵母膏 无机盐 淀粉 纤维素粉 琼脂 刚果红溶液 水 培养基甲 ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ 培养基乙 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ 注：“＋”表示有，“－”表示无。 (2)据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________________________________________。 (3)据表判断，培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是___________________________________________________。 (4)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。 (5)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_________________________________________________________________。 【解析】(1)实验室培养微生物需要配制培养基，培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。 (2)分析表格可知，培养基甲的配方中无琼脂，为液体培养基，不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，纤维素分解菌鉴别培养基属于固体培养基。 (3)培养基乙没有纤维素粉，因此也不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。 (4)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成红色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。 (5)接种时常用接种环，平板划线法操作时要求将灼烧后的接种环冷却后再划线，否则会灼伤菌株甚至导致菌株死亡，划线时要从上一次划线的末端开始，这样接种环上才有菌株，因此若第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，而第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，可能的原因有接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始。 【答案】　(1)氮源和无机盐　(2)不能　纤维素分解菌选择培养基属于液体培养基，纤维素分解菌鉴别培养基属于固体培养基(培养基中没有琼脂)　(3)不能　培养基中没有纤维素粉 (4)红　透明圈　(5)接种环　①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始 24.饲养动物常用的植物饲料中含有难溶解的植物钙，很难被动物吸收利用，如在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从土壤中分离产植酸酶细菌菌株的过程示意图。    (1)在实验室培养微生物， 是研究和应用微生物的前提。 (2)为了解土壤中产植酸酶的细菌数量，取1g土壤加入99mL无菌水，制备成细菌悬液，经 后，获得细胞密度不同的细菌悬液。若将最后一个试管中的菌液每次吸取0.1mL涂布到三个培养基。一段时间后，菌落数分别是168、175、167个，则1g土壤中含有此菌的菌体数 个。该方法计数结果往往比实际值偏低，原因是 。 (3)制备产植酸酶的细菌菌株初筛平板是，需要将培养基的pH调至 性。该培养基可采用 法进行灭菌，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌植酸钙粉末，充分混合后到平板，加入植酸钙的目的是 ，达到检测菌种分泌植酸酶的能力。 (4)实验结果显示A~E五种菌株中， 是产植酸酶最理想的菌株。 【解析】（1）防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提。 （2）接种前进行的一系列操作，目的是在固体培养基表面形成单菌落，一般用等比稀释（系列梯度稀释）的方法获得细胞密度不同的细菌悬液；微生物培养计数时应选择菌落在30-300之间的进行计数，一段时间后，菌落数分别是168、175、167个，此时稀释倍数是105倍，则1g土壤中含有此菌的菌体数=（168+175+167）÷3×105÷0.1=1.7×108个；由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只有一个菌落，所以该方法计数结果往往比实际值偏低。 （3）制备产植酸酶的细菌菌株初筛平板时，需要将培养基的pH调至中性或微碱性；该培养基可采用湿热灭菌（或湿热灭菌中的高压蒸汽灭菌）；由题干信息可知，固体培养基中加入植酸钙会导致培养基不透明，微生物发酵产生的酸能溶解植酸钙形成透明圈，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌植酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入植酸钙的目的是使培养基不透明，从而使经培养形成的产植酸酶菌落的周围形成透明圈，达到检测菌种分泌植酸酶的能力。 （4）实验结果显示A～E五种菌株中，E菌种周围的透明圈最大，则E是产植酸酶最理想的菌株。 【答案】(1)防止杂菌污染获得纯净的微生物培养物 (2) 等比稀释 1.7×108 当2个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只有一个菌落 (3) 中性或弱碱性 湿热灭菌 使培养基不透明，从而培养形成的产植酸酶菌落的周围形成透明圈 (4)E 25．市政污泥堆肥过程中大量释放的含硫臭气不仅会污染周围环境，也会降低堆肥质量。研究人员按下图所示流程从污泥堆肥物料中筛选纯化出一株耐高温硫氧化菌LYH-1。     (1)实验中用到的培养基常用 法进行灭菌，该方法灭菌的原理是 。 (2)③过程配置一系列不同浓度的菌液，若将不同浓度的菌液分别涂布到平板上培养，从中选择出菌落数为 的平板可用于进行计数。 (3)涂布平板后每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目 时的记录作为结果。 (4)⑤过程发现以葡萄糖为碳源时，LYH-1菌株硫氧化产物硫酸盐产量最高，葡萄糖在LYH-1菌株生长代谢过程中的作用是 （答出两点即可）。 (5)将筛选出的LYH-1菌株连续培养多代，将每一代都接种在适宜培养基上，在55℃高温条件下培养，比较硫酸盐的生产量。若每代硫酸盐产量 ，说明其能稳定遗传。 【解析】（1）实验中用到的培养基常用高压蒸汽灭菌，该方法能灭菌的原理是：高温破坏了构成菌体的蛋白质结构，使蛋白质变性失活，从而达到杀死细菌的目的。 （2）稀释涂布之前要先进行一系列梯度的稀释，③过程配制一系列不同浓度的菌液，若将不同浓度的菌液分别涂布到平板上培养，从中选择出菌落数为30～300的平板可用于进行计数，通过计算获得平均值得到相应的数据。 （3）涂布平板后每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 （4）⑤过程发现以葡萄糖为碳源时，LYH-1菌株硫氧化产物硫酸盐产量最高，葡萄糖在LYH-1菌株生长代谢过程中的作用表现为既可以作为能源物质为LYH-1菌株生长提供能量，代谢过程中的中间物质也可以为其他有机物的合成提供原料。 （5）将筛选出的LYH-1菌株连续培养多代，将每一代都接种在适宜培养基上，在55℃高温条件下培养，比较硫酸盐的生产量。若每代硫酸盐产量基本一致，说明其能稳定遗传，可作为生产用菌种。 【答案】(1)高压蒸汽 高温破坏了构成菌体的蛋白质结构，使蛋白质变性失活 (2)30～300 (3)稳定 (4)提供能量、为其他有机物的合成提供原料 (5)基本一致 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北 1 / 24 学科网（北京）股份有限公司 $$