备课素材：如何从脾脏中获取B淋巴细胞 2023—2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

如何从脾脏中获取B淋巴细胞 2020版高中生物学选择性必修三说，用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的 B 淋巴细胞： 那么，如何从脾脏中获取B淋巴细胞？ 脾脏是机体重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴细胞，占全身淋巴组织总量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，从外周血液中分离大量淋巴细胞较为困难，故经常需要从其鼠脾脏中获取大量的淋巴细胞。传统淋巴细胞方法分离存在诸多不足，比如分离液本身存在细胞毒性，分离者需要自行调节分离液密度梯度，分离所得细胞活率不高、状态不好、纯度不够等。所以提取B淋巴细胞的方法也在不断改进，如分离液也在不断改进。 1.脾脏中获取淋巴细胞的方法步骤 材料准备：选取具有正常免疫功能的成年小鼠（通常一只小鼠脾脏可提取的淋巴细胞数量为2~6×107），快速断颈处死(避免脾梗死，脾动脉及其分支的阻塞，造成局部组织的缺血坏死称为脾梗死)后，浸泡于75%酒精中；准备好已消毒的眼科剪、眼科镊，以及一个装有一定量PBS（一种缓冲液，维持pH和离子浓度的稳定）的无菌皿，分离脾脏后置于皿中，全程无菌操作。 小鼠脾脏处理：脾脏细胞数量较少时，可用两个1mL无菌注射器的针尖将脾脏戳出大量的空洞后，轻轻刮取脾脏表面，将脾脏细胞刮出；数量较多时，可用注射器活塞和细胞滤网进行研磨后离心（并不是我们平时用研磨棒提取细胞内酶的研磨方法，如图所示），也可得到淋巴细胞。 离心：15mL离心管中吸入5mL ficoll分离液（一种淋巴细胞的分离液），倾斜管身，小心吸取含淋巴细胞的PBS缓慢加入ficoll分离液，可见明显液体分层。600rpm梯度离心25分钟。如图所示（其中胎牛血清层可以用其他培养液代替）： 二次离心：得到分为3层的液体, 小心吸取中间层液体（含淋巴细胞+红细胞）并置于新的15mL离心管，补满PBS，600rpm离心5分钟。底层是红细胞可以用血液静置后的分层来理解，密度和大小决定分布在底层。 三次离心：弃上清PBS, 可见黑红色沉淀，加入1~2mL红细胞裂解液（原理是红细胞比淋巴细胞更易吸收裂解液中的离子，细胞内渗透压增大，红细胞吸水胀破），冰上裂解5分钟，补满PBS, 600rpm离心5分钟。 获取淋巴细胞：弃上清PBS, 可见白色沉淀，此为总淋巴细胞。 2.操作过程中的注意事项 （1）所有操作均以无菌试剂、耗材，无菌环境内操作为前提。 （2）由于整个过程需要淋巴细胞长时间处于体外PBS中，所以对PBS的要求比较严格；为保护淋巴细胞，也可以使用专门的淋巴细胞缓冲液。 （3）若小鼠饲养时间较长，或者小鼠脾脏异常肿大，导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时，须将细胞悬液 用小鼠分离液等体积稀释并混匀后，再进行离心操作。 （4）分离液易挥发，每个脾脏的研磨时间应控制在 5min 以内。 （5）分离液开封后，请尽量保存在 2℃-8℃环境，避免因液体挥发造成分离液密度变化，影响分离效果。 （6）推荐使用注射器活塞来研磨脾脏，活塞比较钝不易损伤细胞。推荐使用尼龙网，因为尼龙网更柔韧。利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力度， 将细胞可能受到的机械损伤降低到最小。控制研磨力度，使尼龙网保持悬空，避免在皿底上直接 研磨而造成大批细胞死亡。培养皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹力。镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑动。 例、为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。 回答下列问题: （1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A,该处理的目的是                        。 （2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：                       。 （3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于                     ，使用该培养基进行细胞培养的结果是                    。图中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是                 。 （4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖,可采用的方法有                                (答出2点即可)。 答案：（1）诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞  （2）取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液   （3）选择培养基；只有杂交瘤细胞能够生存；抗原与抗体的反应具有特异性    （4）将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养 解析：(1)实验前给小鼠甲注射病毒A，是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。(2)取小鼠的脾脏，剪碎组织，用胰蛋白酶处理获得单个细胞，加入培养液可以制成单细胞悬液。(3)图中筛选1需要用到选择培养基，只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，该过程要用到抗原抗体杂交，筛选所依据的原理是抗原-抗体反应具有特异性。(4)获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，可以在体外培养液中进行培养，或在小鼠的腹腔中进行培养，使杂交瘤细胞大量增殖。 学科网（北京）股份有限公司 $$