1.2.1微生物的基本培养技术课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第一章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用 人教版·选择性必修3 问题探究 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 如何从自然界中分离出需要的特定微生物？ 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？ 纯培养 配制培养基 灭菌 接种 分离 培养 纯培养物 这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 美国黄石公园 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，科学家布鲁克从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌（Taq细菌），进而提取出耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）。 问题探究 讨论： 1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？ 2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？ 启示：寻找目的菌种时要根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。 一、选择培养基 生存环境 1.在被石油污染的土壤中可以筛选 微生物。 2.在冰川冻土层可以筛选 微生物。 3.以纤维素为唯一碳源培养基 。 分解石油 耐寒 纤维素分解菌 热泉 冰川 石油 落叶 实验室筛选微生物原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。 选择培养基应运而生。 （1）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 （2）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 不加碳源的培养基 分离出自养微生物 分离耐热菌 70～80℃的高温 不加氮源的培养基 分离固氮微生物 加青霉素的培养基 分离真菌 加高浓度食盐 分离金黄色葡萄球菌 改变培养条件 添加某种化学物质 营养缺陷 一、选择培养基 加石油为唯一碳源 分离出分解石油的分解菌 特殊碳、氮源 (青霉素能杀死细菌、放线菌) （3）实例： 酸性环境培养、筛选出耐酸菌 无氧下 选择培养基 培养基中加氨苄青霉素 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌？ 没有氨苄青霉素抗性的细菌能够生长 具有抗氨苄青霉素能力的细菌 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 一、选择培养基 培养基+氨苄青霉素 培养基 问题：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 思考讨论： 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 一、选择培养基 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 问题：如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 尿素的立体结构 CO(NH2)2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 怎样才能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来？ 尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。 一、选择培养基 思考·讨论：选择培养基配方的设计 设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。 这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 尿素 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是 ；该类培养基的主要用途为 。 2.从用途上来讲， 属于选择培养基，目的是为了获得 。 3.两种培养基共有的培养基成分有： 。 培养基一的主要碳源为 ，主要氮源为 ； 培养基二的碳源为 ，氮源为 。 固体 添加了凝固剂琼脂 分离、鉴定、计数、保存 培养基二 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 巩固练习 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 培养基二 现 学 用 现 二、微生物的选择培养 选择培养基 + 稀释涂布平板 单菌落 稀释涂布平板法： 将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。 如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，需要解决哪2个问题？ 选择培养：获得能分解尿素的细菌的纯培养物。 计数：土壤菌液进行充分稀释及科学的微生物数量测定方法—稀释涂布平板法。 二、微生物的选择培养 第1步： 取样并稀释10倍 10 g 90 mL的无菌水 2、稀释涂布平板操作过程 铲取土样，将样品装入纸袋中。 1 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。 2 3 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1◊10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1◊103 1◊104 1◊105 1◊106 1◊107 1◊102 9mL无菌水 第2步： 系列梯度稀释 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。 二、微生物的选择培养 第3步： 涂布平板 5 将涂布器浸入再盛有酒精的烧杯中 取0.1mL菌液， 滴加到培养基表面 4 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 7 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 6 取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽。 涂布结束后，要将涂布器灼烧灭菌。 不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。 2、稀释涂布平板操作过程 二、微生物的选择培养 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。 在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 恒温培养箱 空白对照 稀释104倍 稀释105倍 稀释106倍 注意事项：涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。 3、微生物培养 三、微生物的数量测定 原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测除样品中大约含有多少活菌。 原则 一般选择菌落数在 的平板进行计数。 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取其平均值。 缺点 统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。 因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。 因此，统计结果一般用 而不用活菌数来表示。 减少实验误差，保证实验结果更准确 30~300 低 菌落数 4、稀释涂布平板计数法计数（间接计数） 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 思考：平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 二、微生物的选择培养 不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 二、微生物的选择培养 平板划线法与稀释涂布平板法的比较 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 三、微生物的数量测定 原理 利用特定的 或 ，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 细菌计数板 血细胞计数板 较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 细菌计数板 血细胞计数板 优点 快速、直观、设备简单；能观察微生物的形态特征。 ①不能区分死菌和活菌，统计结果会偏大 ②不适于运动的和个体小的细菌 缺点 也可选择用台盼蓝染色法来区分活菌和死菌。 5、显微镜直接计数（直接计数） 1.油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到油烟污染的环境中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示。下列叙述正确的是（ ） A.图中①～③的过程为梯度稀释 B.在培养基中加入油烟污染物，其作用是为微生物提供碳源和能源 C.④使用的是固体培养基，需加入琼脂作为微生物生长繁殖的营养物质 D.过程④可采用稀释涂布平板法或平板划线法分离菌种并进行计数 巩固提高 B 2.(2022·黑龙江鸡西高二期末)如图为选育高产β-胡萝卜素的布拉霉菌的过程。随β-胡萝卜素含量增加，菌体颜色从黄色加深至橙红色。未突变菌不能在含有β-紫罗酮的培养基上生长。下列有关叙述错误的是( ) A.过程①属于诱变育种 B.过程②可采用平板划线法接种 C.过程③应选择黄色菌株进行富集培养 D.培养基中添加β-紫罗酮起选择作用 C 巩固提高 1.实验目的： （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 2.实验原理： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 CO(NH2)2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 注意 （1）土壤取样 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3.实验设计： ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源。 ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 （2）制备培养基 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml （3）样品的稀释与稀释涂布平板法接种 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。 测细菌数：一般用104、105、106稀释液 测放线菌：一般用103、104、105稀释液 测真菌数：一般用102、103、104稀释液 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 预实验 (4)微生物的培养与观察 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养条件： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 （细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d） 观察： 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 稀释度 104 105 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 菌落数/平板 思考：得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 不一定，还需要进一步的鉴定。 4. 进一步探究 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 资料：细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3 ， NH3会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。 CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3 脲酶 pH升高，酚红指示剂变红 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 几种常用的鉴别培养基 伊红—亚甲蓝琼脂培养基 淀粉培养基 尿路菌群显色培养基 念珠菌群显色培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品（不影响微生物正常生长），使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 鉴别培养基： 伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌 拓展应用 大肠杆菌菌落呈现深紫色 培养基按用途分 混合样品 选择培养基上部分菌种才能生长 普通培养基上所有菌种都能生长 选择培养基 鉴别培养基 目的菌 目的菌周围出现特殊现象 非目的菌 非目的菌周围无明显现象 拓展应用 化学成分：... text has been truncated due to evaluation version limitation. 26 纤维素其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如图所示）。 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 (1)筛选纤维素分解菌的方法 。该方法可以通过________反应直接筛选。 (2)菌落周围 （有/没有）透明圈，说明是纤维素分解菌。 纤维素分解菌的筛选 刚果红染色法 颜色 有 拓展应用 1.筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。 菌种 菌落直径：C(mm) 透明圈直径：H(mm) H/C 细菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2 细菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6 巩固提高 下列有关本实验的叙述，错误的是（ ） A.培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质 B.筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布 C.以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外 D.H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异 C 1.(2021·襄阳五中调研)下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是(　　) A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度 B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照 C.该实验应采用稀释涂布平板法 D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红 B 巩固提高 2. (2021·山东淄博月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述.正确的是(　　) A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 B.统计样品中的活菌数目一般用平板划线法 C.筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质 D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌 3.(2021·四川绵阳期末)某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是(　　) A.可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/L B.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低 C.一般选择菌落数为30～300的平板进行计数 D.显微镜直接计数法统计的是稀释液中的活菌数 A 巩固提高 D 【概念检测】 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 (1) 这种培养基是一种选择培养基。（ ） (2) 利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ） (3) 相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌 （ ） 练习与应用 √ √ √ 2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ） A. 菌落中的细菌数目是恒定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法——稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 ①土壤取样 ②样品的稀释 ③稀释涂布平板法接种 ④微生物的培养与观察 实验结果 课堂小结 $$