1.1 DNA重组技术的基本工具课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

现代生物科技专题 基因工程 的诞生 基因工程的 原理及技术 基因工程 基因工程的应用 蛋白质工程 生物技术中的伦理问题 禁止生物武器 细胞融合与单克隆抗体 植物的组织培养 动物细胞培养 体细胞克隆 细胞工程 生态工程 实例 生态工程建设 生态工程 生态工程原理 动物胚胎发育 胚胎工程 理论基础 胚胎工程 胚胎工程应用 胚胎干细胞移植 转基因生物的安全性 能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？ 普通棉 资料　转基因抗虫棉 　　1993年，中国农业科学院成功培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉。抗虫基因来自苏云金杆菌。 　　苏云金杆菌形成的伴胞晶体是一种毒性很强的蛋白质晶体， 能使棉铃虫等鳞翅目害虫瘫痪致死。科学家将编码这个蛋白质 的基因导入作物，使作物自身具有抵御虫害的能力。如今，科 学家已利用这一基因成功地培育了抗虫的烟草、玉米、水稻和 棉等多种作物。 　　抗虫基因作物的使用，不仅减少了农药的用量，大大降低 了生产成本，而且还减少了农药对环境的污染。 抗虫棉 普通棉 必修2 P106 考 点 别 名 基因拼接技术 或DNA重组技术 操作环境 生物体外 操作对象 基 因 操作水平 DNA分子水平 基本过程 剪切→拼接→导入→表达 结 果 人类需要的基因产物 原 理 基因重组（广义） 基因工程的概念考点解析： 优点： 定向改造生物体的性状（目的性强) 基础理论和技术的发展催生了基因工程 基础理论和技术的发展催生了基因工程 拼接的基础： 1、DNA是生物的主要遗传物质 2、DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸 3、双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋 表达的基础： 1、基因是控制生物性状的独立单位，具有独立性 2、遗传信息的传递都遵循中心法则所阐述的信息流动方向 3、生物界共用一套遗传密码。 小结：基因工程得以实现的基础 基因工程培育抗虫棉的简要过程： 苏云金芽孢杆菌 提取 抗虫基因 普通棉花(无抗虫特性) 棉花细胞(含抗虫基因) 与运载体DNA拼接，导入 棉花植株(有抗虫特性) 表达 转基因抗虫棉 普通棉 抗虫接种实验 鉴定是否具有抗虫特性 第一步 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 第二步 抗虫基因与棉花DNA“连接” 第三步 抗虫基因导入 棉花细胞 基因的“剪刀” 基因的“针线” 基因的运载体 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” ——限制性核酸内切酶 ——DNA连接酶 ——基因进入细胞的载体 DNA分子的结构特点： 温故知新 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 1.元素组成: 2.基本单位: 3.空间结构： ①基本骨架： ②遵循原则： C、H、O、N、P 4种脱氧核苷酸 C 规则的双螺旋结构 磷酸和脱氧核糖交替连接，排列在外侧，构成DNA分子的基本骨架 碱基互补配对原则 碱基对通过氢键连接，排列在内侧 3’端 5’端 3’端 5’端 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 1.本质：__________ 2.分布：主要在__________中 2.作用特点：具有特异性，即识别__________的某种 ________________，切割___________。 3.作用位点：________________。 4.举例： EcoRI限制酶能识别__________序列，并在________ 之间切开，产生的是________。 _______________能识别CCCGGG序列，并在G和C之间切开，产生的是________。 原核生物 特定核苷酸序列 特定切点 磷酸二酯键 GAATTC G和A 黏性末端 SmaI限制酶 平末端 双链DNA 蛋白质 选修3 P4-5 考 点 　 黏性末端　　　　 黏性末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 EcoRI 限制酶的切割 剪切的对象是磷酸二酯键 结果：切开了1个切口，形成了2个黏性末端 不同的限制酶切出的粘性末端 一般是不同的－－专一性 大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列， 并在G和A之间切开。 SmaI 限制酶的切割 平末端 平末端　　　 SmaI 只能识别—CCCGGG—序列，并在C和G之间切开。 中轴线 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 限制酶的识别序列： 注意： 限制酶是一类酶，而不是一种酶。限制酶的成分为蛋白质，其作用的 发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 5. 种类与命名： 现在已经从约300种微生物中分离出了约 4000种限制性内切酶(限制酶)。 EcoRⅠ SmaⅠ 粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens） 大肠杆菌 （Escherichia coli R） 练习：流感嗜血杆菌的d菌株 ( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ 1. 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 寻根问底： 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。 限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 2. 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样一来，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 限制酶在原核生物中的作用 1.限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 2.含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别序列，因此不会切割自身的DNA分子。 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 阅读课本，填写下表： 类型 来源 功能 相同点 差别 E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 磷酸二酯键 只能连接黏性末端 T4DNA连接酶 T4噬菌体 能连接黏性末端和 平末端(效率较低) 选修3 P5-6 考 点 GGCATCTTAA AATTCCGTAG 二、DNA连接酶——“分子缝合针” （1）本质: （2）作用对象： （3）作用部位: （4）种类 蛋白质 CTTCATG GAAGTACTTAA AATTCCCTAA GGGATT GGCATCTTAA AATTCCGTAG E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 磷酸二酯键 注意： DNA连接酶连接双链DNA片段中互补的黏性末端缺口 片段1 片段4 连连看： 片段6 片段5 片段3 T A T A 片段2 两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来 不能。因为一般基因有上千个碱基对。 可能是剪切位点或连接位点选得不对。 典例1： 下图为四种限制酶BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列：  其中哪两种限制酶所切割出来的 DNA片段末端，可以互补结合（ ） A．BamHⅠ和EcoRⅠ； B．BamHⅠ和HindⅢ； C．BamHⅠ和BglⅡ； D．EcoRⅠ和HindⅢ； C 判断能否连接的关键点： 切割后的DNA片段是否产生相同的黏性末端。 2.细菌本身的DNA分子中不具备这种限制酶的识别序列。 2 7 …ACGT… …TGCA… 4和8能连接形…GAATTC… …CTTAAG… 1 5 …CTGCAG… …GACGTC… 3和6能连接形成…GCGC… …CGCG… 3.不能。因为天然DNA分子并不完全具备作为载体的条件，都要进行人工改造后才能用做基因工程载体。 4.迄今为止，还没有发现。 DNA聚合酶的作用 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ A A T T G A A A T T 不是，连接的对象不同 A DNA聚合酶 A DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 VS DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 1.作用位点：都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键 2.化学本质：都是蛋白质 3.特性：都具有酶的基本属性和特点（高效性、专一性、需要适宜的温度、PH等） 不 同 点 模板 不需要 需要，以DNA的一条链为模板 作用对象 DNA片段 将两个缺口同时连接起来 单个脱氧核苷酸连接到 已有的核酸片段的3'末端上 作用结果 形成完整的DNA分子 形成与模板互补的一条DNA链 用途 基因工程 DNA复制 导学案P3 知识点二 区分清楚那些与DNA有关的、让我们迷糊和掉坑的酶 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子 DNA分子 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 磷酸二酯键 作用结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA 形成新的DNA分子的一条链 （子链） 解开螺旋, 形成单链DNA 将DNA水解成单个脱氧核苷酸 导学案P3 知识总结 C 载体的种类： 1）质粒(最常用) 2）λ噬菌体的衍生物 3）某些动、植物病毒 1.使用载体的目的： ①用它将外源基因送入受体细胞中； ②利用它在受体细胞内进行大量的复制。 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 选修3 P6 考 点 1. 使用载体的目的？常用的载体？最常用的载体？ 2. 天然质粒都能充当载体吗？ 3. 具备什么条件才能充当载体? 不能。都要进行人工改造后才能用。 存在于许多细菌以及酵母菌等生物的细胞中 是拟核或细胞核外能够自主复制的很小的 环状DNA分子 1. 使用载体的目的？常用的载体？最常用的载体？ 2. 天然质粒都能充当载体吗？ 3. 具备什么条件才能充当载体? 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 选修3 P6 不能。都要进行人工改造后才能用。 ⑴作为分子运输车——载体， 如果没有切割位点将会怎样？ ①有一个或多个限制酶切割位点， 供外源基因(目的基因)插入。 ⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点， 你会用它来做分子运输车吗？ ②必须是安全的，不会对受体细胞有害。 ⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制 或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？ ③具备自我复制能力，或整合到受体染色体 DNA上，能随染色体DNA的复制而同步复制。 ⑷目的基因有没有进入受体细胞， 如何去发现？ ④有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (5)载体如果太大了，容易提取和进入 受体细胞吗？太小了呢？ ⑤大小应适合，以便提取和体外操作。 载体必需满足以下条件： 有切割位点 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有标记基因 B A 抗病基因 ... ... ... ... — G A A T T C— — C T G CA G— — C T T A A G— — G A C G T C— 抗病基因 ... ... ... ... — C T G CA G— — G A C G T C— — C T G CA G— — G A C G T C— DNA聚合酶的作用 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ A A T T G A A A T T 不是，连接的对象不同 A DNA聚合酶 A DNA聚合酶 DNA聚合酶 A A T T G C A A T T A A T T DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶的作用 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ 不是，连接的对象不同 只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段的3'末端上， 形成磷酸二酯键 A A T T G C A A T T A A T T DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶的作用 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ 不是，连接的对象不同 只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段的3'末端上， 形成磷酸二酯键 $$