2025届高考生物一轮复习： 百变PCR（结合历年高考题）

一轮 百变PCR 1 基因工程的一般流程 （2024杭州一模） 基因数据 模板 Pdx1/胰岛素/…… 受精卵具有全能性 仅胰岛发出绿色荧光 如何进行PCR？ 2 比较PCR反应与体内DNA复制所需的基本条件 在DNA复制中的作用 体内DNA复制条件 PCR反应条件 DNA母链 DNA母链 解旋酶 高温条件（90℃以上） 4种脱氧核苷酸 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 一小段RNA 一小段DNA 提供DNA复制的模板 打开DNA双链 断裂氢键 合成子链DNA的原料 催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链 使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物） 通常是20~30个核苷酸 四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP 3 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 扩增缓冲液（PCR buffer） Mg2+：激活DNA聚合酶 （2024安徽）扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_________________。 （2022江苏）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 高温条件下普通DNA聚合酶会变性失活，而Taq酶仍具有活性 溶解DNA Taq酶 3‘ PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 4 1）变性： 当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 氢键 单链DNA 待扩增的DNA片段 第一步： 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 变性 90℃ 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 PCR反应的过程 变性 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 5 2）复性： 当温度下降到_______左右时，两种引物通过 原则与两条单链DNA结合。 第二步： 引物1 引物2 DNA引物 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 5’ 5’ 思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？ ①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。 ②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 3’ 3’ PCR反应的过程 复性 50℃ PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 6 3）延伸： 当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的DNA聚合酶 的作用下，根据________________原则合成新的DNA链。 第三步： 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 3’ 5’ 3’ 5’ 脱氧核苷酸 5’ 5’ 72℃ 3’ 3’ 3’ 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 PCR反应的过程 延伸 碱基互补配对 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 7 第 一 次 循 环 90℃以上变性，DNA双链解开 50℃左右复性，引物与DNA结合 72℃延伸，新DNA合成 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 8 延伸 第 二次 循 环 3’ 5’ 进行第三次循环 变性、复性 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 9 第 三次 循 环 3’ 5’ 目的基因 目的基因 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 10 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 【思考】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA 分子中分离出目的基因？ （1）子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：____个 （2）复制过程中共需引物________个 2n-1 2n+1-2 3 每个引物含20个脱氧核苷酸，并分别与DNA片段两端碱基互补。 （3）假如引物都用3H标记，从理论上计算，DNA片段经3次扩增所得的8个DNA分子中，含有3H 标记的DNA分子占________%。 （4）假定DNA片段含200对脱氧核苷酸，经2次扩增，从理论上计算，除需要引物外，还需要游离的脱氧核苷酸________个。 100 1080 11 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。 核酸分子是两性解离分子，在不同酸碱性的溶液中所带电荷不同，DNA在Tris缓冲液（pH7.0-9.0）中磷酸基团解离，所以DNA带负电 （2024.3七彩阳光）在对扩增产物进行电泳时，因DNA含磷酸基团，故使用pH为____________（填“酸性”或“碱性”）的缓冲溶液，DNA在电泳槽内的移动方向为________________移动。 碱性 正极 电泳基本原理 12 PCR流程及电泳分析 PCR相关计算 引物选择 其他应用 13 DNA本身没有颜色，怎么在结果中观察到？ 亚甲基蓝是一种碱性染料，能与DNA结合，形成深蓝色的复合物（最后加） EB是一种核酸染料，可以插入DNA双链相邻碱基之间形成复合物，在紫外线激发下发射出红橙色荧光（做胶前加） 质粒构像：闭环、开环、线性 影响DNA分子迁移速率的因素 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像 电泳试剂成分的作用（P110） EDTA是一种螯合剂，能与Mg2+结合，从而抑制DNA酶活性 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 14 如何监测电泳进程？ 溴酚蓝呈现蓝紫色，与长300bp的双链线状DNA的迁移速率相同，指示终止电泳的时间。溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm时停止电泳。 如何保证加样时DNA不会飘散到缓冲液中？ 样品密度小可能流入附近加样孔，造成交叉污染。缓冲液中含有甘油或蔗糖等成分增加样品密度，保证每个样品都容易沉入各自的加样孔中，防止飘散。 如何确定待测DNA分子的大小和含量？ 大小：图中M泳道为标准对照组（Marker） ，其实质为_______。 含量：条带宽窄或明亮程度 已知不同长度的DNA片段混合物 即问即答：区分溴酚蓝、二苯胺、亚甲基蓝？ PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 15 1 1 电泳结果分析 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 16 A 电泳与遗传系谱图 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 17 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 （1）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式________（能、不能）正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_______________________________。 （2）若用PCR技术扩增HMA3基因，需要在PCR扩增仪中加入_________种引物，其作用是______________________________________。利用PCR技术扩增基因HMA3时，设计引物序列的主要依据是_________________________________________。 HMA3基因两端的部分核苷酸序列 不能 DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸结合到已有的引物链（核酸单链）上 2 使Taq酶从引物的3´端开始连接脱氧核苷酸 需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA 引物的作用 18 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 1.(2023·浙江卷)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。 图甲 图乙 下列叙述正确的是(　　) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子 B 19 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 思维拓展 1.若构建基因表达载体时，基因反接，可抑制相关基因的表达，简述其原理。 2.选择下图中的引物__________组合可扩增出两侧的未知序列。 转录出的mRNA与原mRNA碱基互补配对，抑制基因的翻译过程 ①④ 20 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图),请分别说明理由。 提示 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效,引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 引物的设计要求 ①自身不能有碱基互补配对的序列，避免引物自连 ②两引物之间不能有碱基互补配对的序列，防止两引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率 21 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 ③典型的引物长度为18-30个碱基。短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性 。非常长的引物能提高专一性，但是复性效率 ，从而导致PCR产物量 。如果引物中GC含量较高，可适当 退火温度 引物的设计要求 差 低 低 (2022·山东卷)(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是______________________________________ 　　　　　　　　。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的　　　　(填“3'端”或“5'端”)。  能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、 短单链核酸 5'端 ④引物的延伸是从 端开始的，不能进行任何修饰。 3′ 提高 22 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 若想在DNA两侧添加限制酶识别序列，可利用PCR技术对DNA进行扩增时，在 引物A、B的 端分别添加限制酶识别序列。 5’ 引物A 引物B 3’ 5’ 3’ 5’ 引物A 引物B 5’ 5’ 第1次 第2次 第3次 引物A 引物B 5’ 5’ 引物A 引物B 3’ 3’ 引物A 引物B 引物A 引物B 引物A 引物A 引物B 引物B 23 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 为使甘蓝具有抗除草剂能力,科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株,获得抗草甘膦转基因甘蓝。 (1)草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下,采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因,应选用的引物组合为(　　) A.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3' B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3' C.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3' D.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3' A 引物的选择和互补链的判断 24 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 为保证双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和引物2,其中引物1的序列为 5'-　　　　　 　　　　　　　-3'。  GGTACCGTACCTTTGT 书写碱基序列 25 PCR流程 电泳分析 引物选择 其他应用 培育“超级菌”。对菌株WZ改造后的CD3D基因进行研究,把CD3D基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因,并构建重组基因表达载体,下图为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点,欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端,已知组氨酸的密码子为CAU,终止密码子为UAG。 ①写出His的基因编码链的碱基序列5‘-　　　　　　 　　　　 　　　 　　-3'。 ②为构建融合基因并将其插入载体,科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物,设计时需在引物　　　　(填“A”或“B”)的5'端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列,请写出该引物开头的12个碱基序列:5'-　　　　　　　 　-3'。 CATCATCATCATCATCATTAG B CTCGAGCTAATG 26 PCR流程 电泳分析 引物选择 PCR其他应用 PCR定点突变技术 设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中，可在任何位点引入突变，它又可以分为重叠延伸PCR、大引物PCR等。 重叠延伸PCR 大引物PCR 27 重叠延伸PCR在定点诱变获取突变基因时,PCR1中使用的引物有 　　 ,PCR2中使用的引物有　　　　 。 PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行,原因是  　。 图1 引物A、引物C 引物B、大引物b 引物之间能结合,会干扰引物和模板链的结合,影响PCR过程 PCR流程 电泳分析 引物选择 PCR其他应用 28 PCR流程 电泳分析 引物选择 PCR其他应用 大引物PCR 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段； 第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段 29 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 $$