3.1基因工程——DNA粗提取与鉴定课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

DNA的粗提取及鉴定 知识目标:理解DNA粗提取和鉴定的原理。 能力目标: (1) 初步掌握DNA粗提取和鉴定的方法; (2) 在对实验原理、步骤的理解和分析过程中培养科学思维; (3) 熟悉粗提取生物大分子的一般性方法。 、情感、态度与价值观目标:在实验过程中培养严谨细致、实事求是的科学态度。 教学重难点:DNA的粗提取和鉴定的方法及原理。 1 一、实验原理： （1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 (1)通过对DNA粗提取和鉴定的原理的学习，能够说明DNA粗提取每一步骤的原因。 (2)能够阐述DNA粗提取和鉴定的流程，总结生物大分子粗提取的一般步骤 2 构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于Nacl溶液中。 Nacl溶液为2mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析生成沉淀，通过过滤，可除去部分蛋白质及不溶于Nacl溶液的杂质 Nacl溶液为0.14mol/L时,DNA析出，过滤可除去溶于Nacl中的部分蛋白质和杂质。 Nacl 蛋白质在Nacl溶液浓度从2mol/L降低的过程中，溶解度逐渐增大 如何DNA溶解在上清液中呢？ 极性蛋白质 解释曲线 三个方法 3 一、实验原理： （1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。 （3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 （鉴定） （现用现配） 沸水浴加热 (1)通过对DNA粗提取和鉴定的原理的学习，能够说明DNA粗提取每一步骤的原因。 (2)能够阐述DNA粗提取和鉴定的流程，总结生物大分子粗提取的一般步骤 4 1.选择适宜的材料 2.破碎细胞 4.提纯 5.验证 3.提取 二、实验思路 1.选材： 新鲜洋葱 为什么用洋葱呢，其他实验材料可以吗？ 三、实验步骤 红细胞 成熟的红细胞 这些生物组织是否适宜用作实验材料？ 选材：新鲜 洋葱，菠菜，菜花，香蕉，草莓 新鲜的猪肝，鱼白（鱼的精巢）？冷藏或冷冻保存 不能选的时成熟的红细胞？ 鱼类的精巢又叫鱼白，是鱼制造和贮存精子的器官。鱼白含有一种特殊的蛋白质，叫鱼精蛋白，是自然界中最简单的一种碱性蛋白质。它是止血的良药 鸡血的保存环境有严格要求,并且实验中去杂质的过程需要反复地进行过滤操作，DNA含量高，血细胞已破碎处理 洋葱易取材，成本低，操作简单且成功率高，但研磨较麻烦，且有刺激性气味；而猕猴桃原料价钱略高，但不用研磨，无辣味、去皮后用纱布挤压即可，较适合开展此实验 菠菜呈现绿色,影响鉴定效果;草莓价格昂贵,成本较高 菜花为实验原料，由于它的硬度较高，容易出现研磨不充分，研磨时间过长产生的热量会影响DNA的提取量，纤维素酶？洋葱，气味刺激，护目镜，通风。植物的叶蛋白 氯仿多糖低温暗处？合成少CTAB，多酚类物质极易被氧化成褐色物质醌类,醌能够形成游离的自由基,这种自由基能够引起磷酸二酯键的断裂,造成基因组DNA完整性的破坏以及序列长度的降低;丹宁，色素提取DNA方法不同 7 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，不含DNA 1.选材： 注意： 操作步骤简便 实验材料是否容易保存等 实验经费 1.选材： 实验试剂：研磨液 2.破碎细胞 实验工具：研钵 EDTA（乙二胺四乙酸）：是一种能与二价金属离子结合的螯合剂，而大多数核酸酶需要镁离子，因此可以作为DNA酶的抑制剂，防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。 Tris-Hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）：缓冲体系，DNA在这个缓冲体系呈稳定状态。（ph=8) SDS(十二烷基硫酸钠）：是一种阴离子去污剂，可以裂解细胞。 常见于洗涤剂 研磨液的成分 使蛋白质变性，染色体解离。 2mol/LNacl: 溶解DNA 直接加水研磨可以吗？溶酶体的酶会释放，所以我们要加一种物质EDTA，它可以和螯合大多数核酸酶所需的辅助因子镁离子， 除此之外呢？稳定的环境 DNA就释放分离出来了吗？染色体形式，还需要把DNA与蛋白质分离 10 董 文惠 (董) - 1.选材： 实验试剂：研磨液 使蛋白质变性与DNA分离，防止细胞破碎后DNA酶降解DNA, DNA在缓冲体系中呈稳定状态 2.破碎细胞 实验工具：研钵 2.破碎细胞 ？ 研磨液 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 直接加水研磨可以吗？溶酶体的酶会释放，所以我们要加一种物质EDTA，它可以和螯合大多数核酸酶所需的辅助因子镁离子， 除此之外呢？稳定的环境 DNA就释放分离出来了吗？染色体形式，还需要把DNA与蛋白质分离 DNA会被吸附到滤纸上，，解释RNA，糖类 上清液有放入DNA，RNA，蛋白质，脂质，糖类只占1% 称取约30g洋葱，切碎，然后研钵中，倒入10ml的研磨液，充分研磨。如果研磨不充分，会对结果造成怎样的影响 在漏斗上垫上纱布？，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4°C冰箱中放置几分钟，再取上清液。也可以直接将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。 12 3.提取DNA(过滤或者离心） ？ 上清液中有什么物质呢？ DNA会被吸附到滤纸上 直接加水研磨可以吗？溶酶体的酶会释放，所以我们要加一种物质EDTA，它可以和螯合大多数核酸酶所需的辅助因子镁离子， 除此之外呢？稳定的环境 DNA就释放分离出来了吗？染色体形式，还需要把DNA与蛋白质分离 DNA会被吸附到滤纸上，，解释RNA，糖类 上清液有放入DNA，RNA，蛋白质，脂质，糖类只占1% 称取约30g洋葱，切碎，然后研钵中，倒入10ml的研磨液，充分研磨。如果研磨不充分，会对结果造成怎样的影响 在漏斗上垫上纱布？，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4°C冰箱中放置几分钟，再取上清液。也可以直接将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。 13 DNA不溶于酒精，但有些蛋白质，脂质溶于酒精。 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中会出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 预冷的酒精： 一是抑制核酸水解酶的活性，防止DNA 降解； 二是降低分子运动，易于形成沉淀析出； 三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂 4.纯化 14 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物晾干。 搅拌时应轻缓、并沿一个方向： 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 4.纯化 无水乙醇昂贵 蛋白质还有什么去除方法 糖类低温，昏暗 15 用高浓度盐溶液溶解DNA，可以去除在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。 因此，通过反复溶解和析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 还有什么方法去除杂质？ 可以补充一下蛋白酶和高温 16 二苯胺 试管编号 A组（对照组） B组（实验组） 步骤1 物质的量浓度为2mol/L的Nacl溶液5ml 步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物 步骤3 加4ml二苯胺试剂，混匀 步骤4 沸水浴加热5min 实验现象 4.鉴定（定性） 如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 溶液不变蓝 溶液逐渐变为蓝色 微溶解于水,易溶解于酒精、冰乙酸等有机溶剂 17 了解—鉴定（定量） 原理： DNA溶液与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系，可用比色法测定。 分光光度计 使用步骤 20 入射光强度 Io 透射光强度 I 样品池 （吸收池） 检测器及仪表 单色器 光源 工作原理 21 1.标准曲线的绘制 取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂: 混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。 0 1 2 3 4 5 DNA标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 二苯胺试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 方法步骤 绘制一下简单的标准曲线 22 2.样品测定 吸取DNA样液1ml,加入二苯胺溶液2.0ml，加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。 方法步骤 了解—鉴定(紫外吸收法） 原理：核酸类物质含有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基具有共轭双键，在紫外区260nm处有最高吸收峰。紫外吸收法是实验室中最常用的定量测定DNA或RNA的方法。对待测样品的纯度也可用紫外分光光度法进行鉴定。 纯DNA的A260/A280应大于等于1.8，样品中如含有杂蛋白， A260/A280即明显 。 定量测定时，通常以A260值为1相当于50μg/ml 双螺旋DNA，或40μg/ml 单链DNA（或RNA）进行换算。 降低 25 粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 进一步纯化 例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。 CTAB 去除蛋白，多糖，酚类 四.结果分析 27 DNA的粗提取与鉴定 实验原理 DNA不溶于乙醇，蛋白质溶于乙醇 DNA在不同浓度的Nacl溶液中溶解度不同 DNA与二苯胺呈现蓝色反应 DNA的粗提取 选择适宜材料 破碎细胞 DNA的溶解和析出 DNA的纯化 鉴定DNA 与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应 应用 亲子鉴定 应用 核酸检测 应用 精准医疗 传统癌症主要是手术，放疗，化疗，使用其他的抗癌药物，但副作用大，创伤大，不一定完全清除，且在杀死癌细胞的过程的杀死正常细胞， 分析患者的基因信息的基础上精准选择靶向药物 主要就是采集患者生物样本，通过基因测序平台测得患者DNA等分子层面的信息，利用生物信息学进行整合分析，找到与疾病相关的基因突变，形成精确的临床诊断报告 但是面临着问题，生物伦理 30 香蕉中DNA的粗提取实验 ①取一段长约2cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中。 ②加入10mL温水，2g食盐，5滴洗洁精，充分研磨。 ③用双层纱布过滤研磨液，收集滤液。 ④向滤液中加人2g嫩肉粉，混合均匀。 ⑤将滤液置于55~60°C(木瓜蛋白酶作用的最适温度)的水浴中加热5~10min。 ⑥冷却，加入等体积、预冷的体积分数为95%的酒精。 ⑦静置2~3min,用玻璃棒(或筷子)挑取白色絮状析出物。 小实验 31 思考每一步加了什么物质，目的是什么 32 THANKAS Lavf58.20.100 $$