3.2基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2 一、实验原理 PCR（聚合酶链式反应）： DNA的半保留复制 PCR利用了DNA的热变性的原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 一、实验原理 琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳是常用的分离、鉴定DNA的方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 4 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 分子筛效应： 分子的大小和形状不同，通过一定分子孔径分离时因受阻的程度不同而表现出不同的迁移速率 DNA分子可发生两性解离。 当电泳缓冲液的pH大于其等电点时，DNA分子带负电； 当电泳缓冲液的pH小于其等电点时，DNA分子带正电。 一般使用的电泳缓冲液的pH为8， DNA分子带负电，向正极泳动 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 一、实验原理 琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳是常用的分离、鉴定DNA的方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构象。 7 1、配置反应体系 课程导入 课程导入 10倍浓缩的扩增缓冲液 5uL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1uL 20umol/L的引物I 2.5uL 20umol/L的引物Ⅱ 2.5uL H2O 28~33ul 1-5U/uL的Taq DNA聚合酶 1~2U 模板DNA(用量为1pg-1ug ) 5~10uL 总体积 50uL U:酶活性单位(在最适温度下，每分钟内催化1umol底物转化为产物所需的酶量定位一个活力单位) （含Mg2+ ) (dNTP) 二、实验步骤 8 微量移液器 课程导入 ————调节轮 ———— 推动按钮 ——-卸尖按钮 ————-容量视窗 ————卸尖器 ————-活塞杆 ————-移液尖（吸头） 强调第一停点，第二停点 9 董 文惠 (董) - 6个步骤 1、容量设定 2、吸液枪头安装 3、预洗吸液枪头 4、吸液 5、放液 6、卸去吸液枪头 2、离心 课程导入 课程导入 离心：所有组分加入完毕后，盖严离心管盖，并将其放入离心机中，离心约10s中，使反应液混匀并集中在离心管底部。 （提高反应速率） 离心？ 离心管的放置遵循的原则 12 3、设置PCR仪的循环程序 13 3、设置PCR仪的循环程序 课程导入 预变性？ 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 使DNA 充分变性以利于引物更好的与模板结合 设置时间，温度的原因，目的 14 课程导入 PCR的循环程序 第一次循环 第二次循环 第三次循环 4、配置琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料（溴化乙锭EB）混匀。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 16 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。 4、配置琼脂糖溶液： jiangwe 5、制备凝胶： jiangwe 制备凝胶： 5、将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，形成加样孔。 6、待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳 7、将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 （检查有无气泡） 电泳指示剂：溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色， 凝胶载样缓冲液作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 8、加样： 一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 21 jiangwe 8、加样： 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合， 留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。 jiangwe 8、加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 jiangwe 9、电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压一般为1~5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。(一般向正极移动) jiangwe 三、观察实验结果： 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 课程导入 琼脂糖凝胶电泳结果 在本实验中，主要考虑DNA 分子的迁移速率与其大小成反比。 课程导入 未出现扩增条带可能原因： 四、实验结果分析 1、模板DNA含有杂蛋白或Taq DNA聚合酶的抑制剂（如蛋白酶K、苯酚、EDTA)?； 2、Taq DNA 聚合酶失活； 3、引物出 现质量问题，浓度不合适; 4、Mg离子浓度过低; 5、变性温度低，变性时间短； 等等。 27 课程导入 出现非特异性扩增条带可能的原因： 四、实验结果分析 1、模板DNA出现污染; 2、Taq DNA 聚合酶出现质量问题; 3、Mg离子浓度过高； 4、退火温度（复性时的温度）过低； 5、PCR循环次数过多； 等等。 课程导入 注意事项 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。  4. 在进行操作时，一定要藏好一次性手套。 避免反复冻融 核酸检测 抗原检测试剂用到了单克隆抗体制备，那么我们所做的核酸检测用到了什么呢？PCR 30 课程导入 新型冠状病毒核酸检测：在进行新型冠状病毒核酸检测时，主要是使用一次性棉签经口腔或鼻腔来采取深处的细胞进行检测。医护人员会将患者的采集标本进行实时荧光RT-PCR检测，如果检测结果为阳性，则代表感染了新型冠状病毒。如果检测结果为阴性，则代表没有感染新型冠状病毒。 RT-PCR：先得到RNA，反转录成DNA，再PCR。 应用 Pcr加入荧光 31 刑事案件中的运用：应用PCR技术对多态DNA位点分型，使犯罪现场生物物证的个人识别鉴定取得了进展，检测灵敏度明显提高。近几年PCR-STR分型成为法医学应用研究的热点。 总结一下pcr的作用 32 33 DNA片段的扩增及电泳鉴定 原理 PCR 琼脂糖凝胶电泳 过程 配置反应体系 离心 PCR仪 鉴定（琼脂糖凝胶电泳） 配置琼脂糖溶液 制备琼脂糖凝胶 加样 电泳 观察实验结果 实验结果分析 应用 THANKS! $$