2025届高三一轮复习生物：基因工程课件

基因工程 课程引入 高考真题再现 （2023•湖北）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 答案 【答案】D 【解析】 A.若只用HindⅢ一种酶切质粒和目的基因，则产生相同的黏性末端，可能导致目的基因正向连接或反向连接，故目的基因转录的产物可能不同，A正确； B.若用PvuⅠ酶切，则会破坏氨苄青霉素抗性基因（AmpR），而重组质粒和空质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； C.若用SphⅠ酶切，则目的基因插入到四环素抗性基因（TetR）中，重组质粒的大小与空质粒不同，故可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； D.若用SphⅠ酶切，则会破坏四环素抗性基因（TetR），氨苄青霉素抗性基因（AmpR）不受影响，则重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 基本工具 基本工具 一、限制性内切核酸酶 —“分子手术刀” 来源： 种类： 主要来自原核生物 特点： 数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶） 能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的 断开。 磷酸二酯键 基本工具 作用部位： 识别序列长度： 结 果： 特定切点上的磷酸二酯键 大多数是6个核苷酸序列 产生 或 5' 3' 5' 3' T A G G T A T C C A 磷酸二酯键 一、限制性内切核酸酶 —“分子手术刀” 黏性末端 平末端 （2021•湖北）限制性内切酶EcoRI识别并切割 ，双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（　　） A.6 B.250 C.4000 D.24000 课堂练习 答案 【答案】 C 【解析】 据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为 1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4096，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。 种类： 基本工具 二、DNA连接酶 —“分子缝合针” ①E.coli DNA连接酶 ②T4 DNA连接酶 从大肠杆菌分离得到 只能连接互补黏性末端的DNA片段 从T4噬菌体分离得到 黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。 平末端 黏性末端 基本工具 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 作用： 二、DNA连接酶 —“分子缝合针” 基本工具 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 几种相关酶的比较 课堂练习 下列各种酶及其作用对应关系不正确的是（ ） A.限制酶——识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 B.RNA聚合酶——与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译 C.DNA连接酶——将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起 D.DNA聚合酶——将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上 答案 【答案】B 【解析】 A.限制酶——识别并在特定位置切断DNA分子中的磷酸二酯键，A正确； B.RNA聚合酶——与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录，B错误； C.DNA连接酶——将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起，形成磷酸二酯键，C正确； D.DNA聚合酶——将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成DNA单链，D正确。 三、基因进入受体细胞的载体 —“分子运输车” 作用：将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制 种类：通常是用质粒、噬菌体、动植物病毒 特点： ① 能在受体细胞中稳定保存并复制 ② 有多个限制酶切割位点，便于插入目的基因 ③ 具有标记基因，便于进行筛选 ④ 对受体细胞无害、易分离 基本工具 课堂练习 作为基因工程中的“分子运输车”——载体，应具备的条件是（ ） ① 必须有一个或多个限制酶的切割位点 ② 必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随之同步复制 ③ 必须带有标记基因 ④ 必须是安全的 ⑤ 大小应合适 A．① ② ③ ④ ⑤ B．① ② ③ ⑤ C．① ② ④ ⑤ D．① ② ③ ④ 答案 【答案】A 【解析】 ① 运载体必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上，进而导入受体细胞，① 正确；　 ② 载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制，进而遗传给下一代，② 正确；　 ③ 运载体必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选，③ 正确；　 ④ 运载体必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去，确保其他生物的安全性，④ 正确； ⑤ 运载体大小应合适，太大则不易操作，⑤ 正确。 基本操作程序 基本操作程序 基因工程的基本操作程序（四个步骤） 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 前提 核心 关键 保证 基本操作程序 一、目的基因的筛选与获取 目的基因获取方法 从基因文库中获取 利用PCR获取和扩增目的基因 基本操作程序 1.从基因文库中直接获取： ①概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 ②种类 基因组文库：含有一种生物的全部基因 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库 ③建立基因文库的目的：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因 基本操作程序 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 的 编码区是 的 相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用的 组成的 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 终止子 原核细胞 真核细胞 编码区 非编码区 连续 间隔的、不连续 基本操作程序 基因组文库和部分基因文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间基因交流 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 基本操作程序 二、基因表达载体的构建 1、目的 (1) 使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代 (2) 使目的基因能够表达和发挥作用。 基本操作程序 2、组成 (1) 启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位， 驱动基因转录出mRNA。（启动子≠起始密码子） ①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。 ②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。 ③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 (2) 终止子：（终止子≠终止密码子） ①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。 ②位置：位于基因的下游。 ③功能：使转录在所需要的地方停下来，终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。 基本操作程序 (3) 标记基因： ①作用：便于重组DNA分子的筛选。 ②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 (4) 目的基因：如Bt基因，能控制表达所需要的特殊性状。 注意：目的基因必须插入到启动子与终止子之间。 (5) 复制原点：DNA复制的起始位点。 3、流程： ①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口； ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因； ③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒）。 基本操作程序 基本操作程序 4、图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 课堂练习 (2023·新课标）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（　　） A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接 答案 【答案】C 【解析】 A.构建基因表达载体时，为避免避免目的基因和质粒自身环化或反向连接，最好应选择两种酶进行切割，A错误； B.据图可知，限制酶3切割后的末端是平末端，而限制酶1切割后的末端是黏性末端，若用两种酶分别切割质粒和目的基因，会导致DNA连接酶无法连接，B错误； C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，可避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，且两者均形成黏性末端，此后再用T4DNA连接酶连接，可构建重组表达载体，效率较高，C正确； D.限制酶4会破坏质粒上的标记基因（抗生素抗性基因），故不能选择该酶进行切割，D错误。 基本操作程序 三、将目的基因导入受体细胞 1、导入植物细胞 (1) 花粉管通道法（多种操作方法） ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； ②在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。 花粉 卵细胞 精子 花粉管 基本操作程序 三、将目的基因导入受体细胞 1、导入植物细胞 (2) 农杆菌转化法 ① 农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物； 内含Ti质粒，其上的T-DNA可转移至受体细胞的染色体DNA上。 ② 农杆菌转化法操作流程 Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色体DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 基本操作程序 三、将目的基因导入受体细胞 基本操作程序 三、将目的基因导入受体细胞 2、导入动物细胞——显微注射技术（注入：受精卵） (1) 转化方法 将含有目的基因的表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵发育 获得具有新性状的生物 33 基本操作程序 三、将目的基因导入受体细胞 3、导入微生物细胞——基因工程中，常用原核生物作为受体细胞。 (1) 优点： ①繁殖周期短 ②体积小易于培养操作 ③多为单细胞，遗传物质相对较少 ④经济实用 (2) 常用菌——大肠杆菌 (3) 转化方法：感受态法 Ca2+处理细胞 感受态细胞 感受态细胞吸收周围环境中DNA分子 重组表达载体与感受态细胞混合 34 基本操作程序 四、目的基因的检测与鉴定 1、分子水平检测 检测目的基因是否插入 检测目的基因是否转录 检测目的基因是否翻译 原理：PCR技术 原理：抗原-抗体杂交 35 基本操作程序 四、目的基因的检测与鉴定 2、个体生物学水平鉴定——抗虫或抗病的接种实验 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 36 课后练习 （2023•乙卷）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 （1）构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 　。 （2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 　 　，②为 　 　，其作用是 　 　；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 　 　。 课后练习 （3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 　 　（答出1点即可）。 （4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 　 　。 答案 【答案】 （1）含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 （2）终止子　启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 （3）密码子的简并性 （4）将含有YFP基因的重组质粒导入酵母菌中，看其能否发出黄色荧光 课后练习 （2023•甲卷）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。 （1）接种乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 　 　。 （2）制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 　 　。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 　 　。 （3）目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 　 　进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 　 　。 （4）若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。 　 　。 答案 【答案】 （1）重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖 （2）便于重组DNA分子的筛选　 RNA聚合酶　 （3）核染色体DNA（核DNA）　 　被标记的目的基因的单链DNA片段 （4）①检测目的基因是否插入：通过基因探针，利用DNA分子杂交技术，检测目的基因是否插入到酵母细胞的染色体上；②检测目的基因是否转录：通过使用基因探针，利用分子杂交技术，检测目的基因是否转录形成mRNA；③检测是否翻译：通过使用相应抗体，利用抗原﹣抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质　。 $$