2025届高三生物一轮复习课件PCR及应用

PCR及应用 课程引入 高考真题再现 （2021•湖北）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（　　） A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 答案 【答案】D 【解析】 A. 增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误； BC.延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误； D.非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。 PCR的原理及应用 PCR的原理及应用 利用PCR获取和扩增目的基因： ①含义：聚合酶链式反应简称PCR，是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。 ②原理：DNA半保留复制。 ③反应步骤 变性：在约 高温下，作为模板的双链DNA (变性)为两条单链DNA。 复性：反应体系的温度降至约 ，2条 分别与对应单链DNA上的特定部位配对。 延伸：反应体系的温度回升到约 (Taq酶催化作用的 反应温度)，4种脱氧核苷三磷酸根据 原则，在 的作用下连接到引物 端之后，使引物链 ，并形成互补的DNA双链。 完成上述第一次循环后，PCR仪会按设定接着进行第二次、第三次……循环。 94 ℃ 解旋 55 ℃ 引物 72 ℃ 最适 碱基互补配对 Taq酶 3′ 延伸 PCR的原理及应用 PCR的原理及应用 ④PCR技术所需的基本条件 参与的组分 在PCR中的作用 前提条件 高温 模板DNA 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 引物 一定的缓冲溶液(Mg2＋) 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 已知基因的核苷酸序列 提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活 PCR的原理及应用 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n ⑤PCR中的数量关系 PCR的原理及应用 PCR的原理及应用 PCR的原理及应用 PCR的原理及应用 ⑥PCR技术与细胞内DNA复制的比较 细胞内DNA复制 PCR技术 解旋方式 解旋酶催化，边解旋边复制 高温变性解旋，全部解旋后再复制 场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 引物 RNA 通常是DNA 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） 温度 细胞内温和条件 在不同温度(较高)下进行 合成对象 整个DNA分子 DNA片段或基因 PCR的原理及应用 ①两种引物之间不能存在碱基互补配对的序列 ②每种引物的内部不能存在碱基互补序列 ③引物5'端可以修饰，可以加上限制酶的酶切位点，3'端不可修饰 ④引物长度要适宜，GC含量要适宜（GC含量影响PCR的退火温度） 过短：目的基因之中可能出现该序列，引物与模板链结合的特异性较差 过长：GC含量增加，退火温度提高 ⑤两条引物之间碱基组成（数量、种类）要相近，否则不好控制退火温度 PCR引物设计原则 PCR的原理及应用 课堂练习 研究人员将抗盐基因转入普通烟草培育出抗盐烟草，该过程所用的质粒与含抗盐基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。限制酶BamHⅠ、BclI、Sau3AI、HindⅢ的识别序列和切割位置分别为-G↓GATCC-、-T↓GATCA-、-↓GATC-、-A↓AGCTT-。图3表示该过程中利用含目的基因的农杆菌进行转化并获得转基因抗盐烟草的示意图。回答下列问题： 利用PCR获取和扩增图2含目的基因的DNA片段时，反应体系中除DNA模板外，还应有______、4种脱氧核苷酸、缓冲溶液。每轮循环包含______三个步骤，n轮循环后，理论上可以获得的含目的基因的DNA片段数目为______。 答案 【答案】2种引物、耐高温的DNA聚合酶 变性、复性、延伸 2n 【解析】 利用PCR获取和扩增图2含目的基因的DNA片段时，反应体系中应该有DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、缓冲溶液。每轮循环包含变性、复性、延伸三个步骤，n轮循环后，理论上可以获得的含目的基因的DNA片段数目为2n个。 PCR拓展应用 1.反向PCR测定未知DNA区域 当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 PCR的原理及应用 课堂练习 如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是（ ） A.用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序 B.用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序 C.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序 D.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序 答案 【答案】C 【解析】 A.直接选用引物①、④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误； B、D.用引物②和引物③可实现对已知的T－DNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误； C.用DNA连接酶连接成环状后，用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T－DNA两侧的未知序列，C正确。 2.PCR定点突变技术 该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 PCR的原理及应用 PCR的原理及应用 课堂练习 基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。下图甲是一种 PCR 介导的基因定点突变示意图。图乙是研究人员利用基因 M1 构建基因表达载体的过程。表格是研究人员利用图中相关酶对基因 M 和产物 A、B 进行充分酶切后得到不同的片段。以下正确的是（　　）   基因M A B 长度（kb） 3.24、2.8、0.15、0.13 2.8、0.09 3.24、0.05 课堂练习 A.据图分析，得到中间产物 A、B 需要的引物对分别是引物1和引物3、引物2和引物4 B.图中技术要进行3次PCR C.图中基因敲除片段的长度为0.29kb ，基因 M1 的长度为6.03kb D.为构建基因 M1 与 Ti 质粒的重组质粒，在基因 M1 的 C、D 两端分别加上HindⅢ、PstⅠ的识别序列   基因M A B 长度（kb） 3.24、2.8、0.15、0.13 2.8、0.09 3.24、0.05 答案 【答案】ABD 【解析】 A.DNA复制时子链的合成方向为5‘→ 3’ ，故引物需要与模板的3’端结合，据图可知，使用引物1和3可得到包含片段A的产物，使用引物2和4可得到包含片段B的产物，A正确； B.PCR 介导的定点突变一般需要 4 种引物，进行 3 次 PCR反应。前两次PCR 反应扩增形成两条双链 DNA 片段，这两条双链 DNA 片段经过变性和退火形成具有3’凹末端的异源双链分子，在 Taq 酶的作用下，产生含有重叠序列的双链 DNA 分子，再用两个外侧引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA，然后再构建表达载体进行表达，B正确； C.图中……表示酶切位点，基因M上有三个酶切位点（箭头处），完全酶切产生4个片段，分别为3.24kb、2.8kb、0.15kb、0.13kb，A片段酶切后产生2个片段，分别为2.8kb、0.09kb，B片段酶切后产生2个片段，分别为3.24kb、0.05kb，图中A片段和B片段的……是相同的，因此……处为0.05kb，则基因M1的长度为2.8+0.05+3.24=6.09kb，因此基因敲除片段的长度为6.32-6.09=0.23kb，C错误； D.整合重组质粒可知， 基因M1的C端为HindⅢ、基因M1的D端为PstI，因此需要在基因 M1的 C、D 两端分别加上HindⅢ、PstI的识别序列，D正确。 3.荧光定量PCR（RT-PCR） 先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。 PCR的原理及应用 3.荧光定量PCR（RT-PCR） 荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小 PCR的原理及应用 课堂练习 逆转录PCR是将mRNA逆转录为cDNA并进行扩增的过程：用石蜡将PCR管分隔为上、下两部分，上部分为逆转录体系，下部分为PCR体系。PCR时温度升高后，石蜡熔化，两体系混合。下列说法错误的是( ) A.逆转录体系和PCR体系中的酶不同 B.逆转录体系可为PCR体系提供模板 C.两体系混合后可同时进行逆转录和PCR D.PCR体系中应加入缓冲液及Mg2+ 答案 【答案】C 【解析】 A.逆转录体系中需要用到逆转录酶，而PCR体系中的用到的酶是耐高温的DNA聚合酶，A正确； B.逆转录体系产生的cDNA可为PCR体系提供模板，用于扩增DNA分子，B正确； C.PCR技术需要高温，而高温能使逆转录酶失活，所以两体系混合后不可同时进行逆转录和PCR，C错误； D.PCR体系中应加入缓冲液及Mg2+ ，前者提供稳定的扩增环境，后者能激活DNA聚合酶，D正确。 CRISPR/Cas9技术 sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列 PCR的原理及应用 课堂练习 CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，能够通过“剪切和粘贴”DNA序列的机制来编辑基因组。Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，识别并切割目标DNA双链的特定序列（DNA靶序列）以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。CRISPR/Cas9重组质粒上除了有目的基因（Cas9基因和SgRNA编码序列）和标记基因外，还应该含有 、 等。 课堂练习 (2)SgRNA可识别并特异性结合目标DNA序列，二者结合所遵循的原则是 。Cas9蛋白相当于 酶，可催化 键断裂，可在受体细胞中特定的基因位点进行切割，导致 （填变异类型），改变基因结构。 (3)CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过改变 的碱基序列，从而可以任意编辑基因组上的各种靶序列。若要将目标基因从目标DNA上切除下来，一般需要设计 种不同的SgRNA。 (4)CRISRP/Cas9基因编辑技术中常用的SgRNA长度为20bp左右。某SgRNA因细胞内其他DNA序列也含有与其相对应的序列，造成该SgRNA错误结合而脱靶，解决的具体措施是 。 (5)单细胞生物没有免疫系统，但广泛存在CRISPR/Cas9等系统，这对细菌来说的意义是 。 答案 【答案】 (1) DNA连接酶 启动子 终止子 (2) 碱基互补配对原则 限制/限制性内切核酸 磷酸二酯 基因突变 (3) SgRNA的引导序列（或SgRNA） 2 (4)适当增加SgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性 (5)防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状（遗传信息）的稳定（或抵御病毒、外源DNA的入侵） 电泳 DNA片段电泳鉴定的原理： （1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 （2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。 （3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 DNA片段的电泳鉴定 34 DNA片段电泳鉴定的原理： DNA片段的电泳鉴定 35 课堂练习 在PCR扩增仪中完成DNA分子的扩增后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。实验人员用EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ两种限制酶处理某DNA分子，得到如图所示的电泳图谱，其中1号是标准DNA样品，2号、3号、4号分别是EcoR Ⅰ单独处理、Sma Ⅰ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。据图分析，下列相关叙述错误的是( ) A.该DNA分子可能含1000个碱基对 B.EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ两种限制酶切割位点不同 C.每次PCR扩增DNA分子时均需要引物 D.EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ的切割位点最短相距约800bp 答案 【答案】D 【解析】 A.据图可知，用EcoR Ⅰ单独处理2号或用 Sma Ⅰ单独处理3号都只得到一种大小为1000bp的DNA片段，该DNA分子可能含1000个碱基对，A正确； B.由题知，两种限制酶同时切割时则产生800bp和200bp两种长度的DNA片段，故EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ两种限制酶切割位点不同，B正确； C.每次PCR扩增DNA分子时均需要引物，PCR技术中引物需要和各自互补的DNA单链的3'端结合，C正确； D.由题知，两种限制酶同时切割时则产生800bp和200bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200bp，D错误。 课堂练习 （2024•辽宁）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ） A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 答案 【答案】A 【解析】 A.琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B. 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C.在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D.琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 课后练习 （2024·河北）下列相关实验操作正确的是（ ） A.配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D.将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 答案 【答案】B 【解析】 A.PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，A错误； B.琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B正确； C.将配制的酵母培养基高温灭菌并冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，C错误； D.将接种环烧红，待冷却后（避免菌种被烫死），蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，D错误。 $$