专练05 生物技术与工程综合题50题-【尖子生创造营】2025年高考生物总复习高频考点必刷800题（广东专用）

2025年高考生物总复习高频考点必刷800题（广东专用） 专练05 生物技术与工程 (综合题）50题 高频考点预览 考点一 发酵工程 （10题） 考点二 细胞工程与胚胎工程 （20题） 考点三 基因工程（20题） 一、发酵工程 1．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 (2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。 (3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。 2．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 3．（2024·全国·高考真题）合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。 (1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是 。 (2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为 个/mL。 (3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是 ，冷却的目的是 。 (4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是 ，判断依据是 。（答出两点即可） (5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈 色。 4．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 (1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。 (2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。 、 (3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。 (4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。 (5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。 5．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 6．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。 (1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。 (2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。 (3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。 (4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。 7．（2023·全国高考真题）某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆（清水淋洗时菌T不会流失），在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵（酒精发酵）。实验流程如图所示。    回答下列问题。 (1)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是 。 (2)采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 （答出1点即可）。通常，可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。在使用该方法时，为了达到良好的灭菌效果，需要注意的事项有 （答出2点即可）。 (3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是 。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是 。发酵液中的乙醇可用 溶液检测。 (4)本实验收集的淋洗液中的 可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是 。 8．（2023·北京高考真题）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。 (1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素等。 (2)A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明 。 (3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。 (4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证（主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱） 。 9．（2023·湖南高考真题）某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题： (1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。 (2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。 测试菌 抗菌肽浓度/（µg•mL-1） 55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86 金黄色葡萄球菌 - - - - - + + 枯草芽孢杆菌 - - - - - + + 禾谷镰孢菌 - + + + + + + 假丝酵母 - + + + + + + 注：“+”表示长菌，“-”表示未长菌。 (3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 （答出两点即可）。 (4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 （答出两点）等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 （填“是”或“否”）。    (5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。 ①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体   ②MRSA感染的肺类装配体   ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽   ④生理盐水   ⑤青霉素（抗金黄色葡萄球菌的药物）   ⑥万古霉素（抗MRSA的药物） 10．（2022·广东·高考真题）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。 回答下列问题： (1)研究者先制备富集培养基，然后采用 法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用 法。据图分析，拟杆菌新菌株在以 为碳源时生长状况最好。 (2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是 。（答一点即可） (3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是 。 (4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有 。 2、 细胞工程与胚胎工程 11．（2024·广东·高考真题）某些肿瘤细胞表面的PD-L1与细胞毒性T细胞（CTL）表面的PD-1结合能抑制CTL的免疫活性，导致肿瘤免疫逃逸。免疫检查点疗法使用单克隆抗体阻断PD-Ll和PD-1的结合，可恢复CTL的活性，用于肿瘤治疗。为进一步提高疗效，研究者以黑色素瘤模型小鼠为材料，开展该疗法与化疗的联合治疗研究。部分结果见图。    回答下列问题： (1)据图分析， 疗法的治疗效果最佳，推测其原因是 。 (2)黑色素瘤细胞能分泌吸引某类细胞靠近的细胞因子CXCL1.为使CTL响应此信号，可在CTL中导入 基因后再将其回输小鼠体内，从而进一步提高治疗效果。该基因的表达产物应定位于CTL的 （答位置）且基因导入后不影响CTL 的能力。 (3)某兴趣小组基于现有抗体—药物偶联物的思路提出了两种药物设计方案。方案一：将化疗药物与PD-L1 单克隆抗体结合在一起。方案二：将化疗药物与PD-1单克隆抗体结合在一起。你认为方案 （填“一”或“二”）可行，理由是 。 12．（2024·全国·高考真题）某种病原体的蛋白质A可被吞噬细胞摄入和处理，诱导特异性免疫。回答下列问题。 (1)病原体感染诱导产生浆细胞的特异性免疫方式属于 。 (2)溶酶体中的蛋白酶可将蛋白质A的一条肽链水解成多个片段，蛋白酶切断的化学键是 。 (3)不采用荧光素标记蛋白质A，设计实验验证蛋白质A的片段可出现在吞噬细胞的溶酶体中，简要写出实验思路和预期结果 。 13．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究并原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。 14．（2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。 (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。 15．（2023·湖南高考真题）某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题： (1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。 (2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。 测试菌 抗菌肽浓度/（µg•mL-1） 55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86 金黄色葡萄球菌 - - - - - + + 枯草芽孢杆菌 - - - - - + + 禾谷镰孢菌 - + + + + + + 假丝酵母 - + + + + + + 注：“+”表示长菌，“-”表示未长菌。 (3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 （答出两点即可）。 (4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 （答出两点）等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 （填“是”或“否”）。    (5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。 ①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体   ②MRSA感染的肺类装配体   ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽   ④生理盐水   ⑤青霉素（抗金黄色葡萄球菌的药物）   ⑥万古霉素（抗MRSA的药物） 16．（2023·湖北高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。 回答下列问题： (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。 (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。 17．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。    回答下列问题。 (1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。 (2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。 (3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。 (4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。 (5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是 （答出2点即可）。 18．（2023·浙江高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： (1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。 (2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。 (3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？ A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 (4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。 (5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 19．（2022·全国·高考真题）某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊，为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题， (1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是 。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是 ；精子体外获能可采用化学诱导法，诱导精子获能的药物是 （答出1点即可）。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵母细胞达到 时才具备与精子受精的能力。 (2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行，该培养液的成分除无机盐、激素、血清外，还含的营养成分有 （答出3点即可）等。将培养好的良种囊胚保存备用。 (3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是 。 20．（2022·重庆高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。 步骤I： 步骤II： (1)花药培养能缩短育种年限，原因是 。在步骤I的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含 的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I中能用于制造人工种子的材料是 。 (2)步骤II中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是 ；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I中的 ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。 21．（2022·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： (1)取红曲霉菌种斜面，加适量 洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得 菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、 ，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行 处理。 (2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是 。测定时需用 作空白对照。 (3)生产上提取红曲色素后的残渣，经 处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和 处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 (4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用 酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的 ，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 (5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。 (6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和 。 22．（2022·福建高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题： （一）基因工程抗原的制备 (1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。    (2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1所示。用Xho I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。 培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。 （二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示：    (3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。 (4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。 (5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入 ① 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是 ② 。 (6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。 23．（2022·辽宁高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。 Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1 (1)构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 （填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。 (2)质粒在包装细胞内组装出由 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。 Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2 (3)用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用 酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的 中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。 (4)用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行 培养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集 ，提取单克隆抗体。 (5)利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成 ，实现特异性治疗。 24．（2022·海南高考真题）以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。 (1)CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用 处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加 等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 (2)体外获取OSNL的方法有 （答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和 等。启动子是 识别和结合的部位，有了它才能驱动 。 (3)iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是 。 (4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是 。 (5)该实验流程中用到的生物技术有 （答出2点即可）。 25．（2021·重庆·高考真题）为了研究PDCD4基因对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡的影响，进行了相关实验。 (1)取小鼠子宫时，为避免细菌污染，手术器具应进行 处理；子宫取出剪碎后，用 处理一定时间，可获得分散的子宫内膜组织细胞，再分离获得基质细胞用于培养。 (2)培养基中营养物质应有 （填写两种）；培养箱中CO2浓度为5%，其主要作用是 。 (3)在含PDCD4基因的表达载体中，启动子的作用是 。为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为 。经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有 （填“抑制”或“促进”）作用。 26．（2021·江苏·高考真题）根据新冠病毒致病机制及人体免疫反应特征研制新冠疫苗，广泛接种疫苗可以快速建立免疫屏障，阻击病毒扩大。图1为新冠病毒入侵细胞后的增殖示意图，图2为人体免疫应答产生抗体的一般规律示意图。请据图回答下列问题。 (1)图1中，新冠病毒通过S蛋白与细胞表面的ACE2受体结合，侵入细胞释放出病毒的（+）RNA，在宿主细胞中经 合成病毒的RNA聚合酶。 (2)在RNA聚合酶的作用下，病毒利用宿主细胞中的原料，按照 原则合成（-）RNA。随后大量合成新的（+）RNA。再以这些RNA为模板，分别在 大量合成病毒的N蛋白和S、M、E蛋白。 (3)制备病毒灭活疫苗时，先大量培养表达 的细胞，再接入新冠病毒扩大培养，灭活处理后制备疫苗。细胞培养时需通入CO2，其作用是 。 (4)制备S蛋白的mRNA疫苗时，体外制备的mRNA常用脂质分子包裹后才用于接种。原因一是人体血液和组织中广泛存在 ，极易将裸露的mRNA水解，二是外源mRNA分子不易进入人体细胞产生抗原。 (5)第一次接种疫苗后，人体内识别到S蛋白的B细胞，经过增殖和分化，形成的 细胞可合成并分泌特异性识别 的IgM和IgG抗体（见图2），形成的 细胞等再次接触到S蛋白时，发挥免疫保护作用。 (6)有些疫苗需要进行第二次接种，据图2分析进行二次接种的意义是 。 27．（2021·湖南高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： （1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是 ，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的 断开。 （2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是 。 （3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是 。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为 （答出两点即可），功能上具有 。 （4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的 淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路 。 28．（2021·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。 （1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或 法，两种方法均能在固体培养基上形成 。对分离的菌株进行诱变、 和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。 （2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除 ；③检验固定化菌株的 。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是 。 （3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是 。 （二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。 （1）为保护三叶青的 多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用 技术，实现了三叶青的林下种植。 （2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成 和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成 ，再分化形成毛状根。 （3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次 培养，培养基中添加抗生素的主要目的是 。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的 和温度，调节培养基成分中的 ，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 29．（2020·江苏高考真题）新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图1为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题： （1）图1中人体内抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被 细胞表面的受体识别后激活该细胞。 （2）B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的 ，形成 细胞。 （3）为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的 ；采集血液样本主要用于血清学检查，检测 。 （4）据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射 免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得 细胞。因为同一种抗原可能激活 细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。 30．（2020·全国高考真题）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。 回答下列问题： （1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是 。 （2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤： 。 （3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于 ，使用该培养基进行细胞培养的结果是 。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是 。 （4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有 （答出2点即可）。 3、 基因工程 31．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 (2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。 (3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。 32．（2024·广东·高考真题）遗传性牙龈纤维瘤病（HGF）是一种罕见的口腔遗传病，严重影响咀嚼、语音、美观及心理健康。2022年，我国科学家对某一典型的HGF家系（如图）进行了研究，发现ZNF862基因突变导致HGF发生。 回答下列问题： (1)据图分析，HGF最可能的遗传方式是 。假设该致病基因的频率为p，根据最可能的遗传方式，Ⅳ2生育一个患病子代的概率为 （列出算式即可）。 (2)为探究ZNF862 基因的功能，以正常人牙龈成纤维细胞为材料设计实验，简要写出设计思路： 。为从个体水平验证ZNF862基因突变导致HGF，可制备携带该突变的转基因小鼠，然后比较 的差异。 (3)针对HGF这类遗传病，通过体细胞基因组编辑等技术可能达到治疗的目的。是否也可以通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传病？作出判断并说明理由 。 33．（2024·全国·高考真题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。 (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。 (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是 。 氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC 脯氨酸 CCA CCC 亮氨酸 CUG 甘氨酸 GGC GGG 终止 UGA 34．（2024·全国·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。 35．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 36．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究并原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。 37．（2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。 (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。 38．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 39．（2024·江西·高考真题）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题： (1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型（WT，纯合体）。据图判断，突变体Cer1中c基因的突变类型是 。    (2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交．F1全为野生型，F1与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道 （从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。 (3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因（位于另一条染色体上）也发生了突变，产生了基因d1，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是 。 (4)假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因d2。CCDD与ccd2d2个体杂交，F1的表型为野生型，F1自交，F2野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格： F2部分个体基因型 棕榈酸（填“有”或“无”） 16-羟基棕榈酸（填“有”或“无”） 颖壳蜡质（填“有”或“无”） Ccd2d2 有 ① 无 CCDd2 有 有 ② 40．（2024·湖南·高考真题）色盲可分为红色盲、绿色盲和蓝色盲等。红色肓和绿色盲都为伴X染色体隐性遗传，分别由基因L、M突变所致；蓝色盲属常染色体显性遗传，由基因s突变所致。回答下列问题： (1)一绿色盲男性与一红色盲女性婚配，其后代可能的表型及比例为 或 ；其表型正常后代与蓝色盲患者（Ss）婚配，其男性后代可能的表型及比例为 （不考虑突变和基因重组等因素）。 (2)1个L与1个或多个M串联在一起，Z是L上游的一段基因间序列，它们在X染色体上的相对位置如图a。为阐明红绿色盲的遗传病因，研究人员将男性红绿色盲患者及对照个体的DNA酶切产物与相应探针杂交，酶切产物Z的结果如图b，酶切产物BL，CL、DL、BM、CM和DM的结果见下表，表中数字表示酶切产物的量。 BL CL DL BM CM DM 对照 15.1 18.1 33.6 45.5 21.3 66.1 甲 0 0 0 21.9 10.9 61.4 乙 15.0 18.5 0 0 0 33.1 丙 15.9 18.0 33.0 45.0 21.0 64.0 丁 16.0 18.5 33.0 45.0 21.0 65.0 ①若对照个体在图a所示区域的序列组成为“Z+L+M+M”则患者甲最可能的组成为 （用Z、部分Z，L、部分L，M、部分M表示）。 ②对患者丙、丁的酶切产物Z测序后，发现缺失Z1或Z2，这两名患者患红绿色盲的原因是 。 ③本研究表明：红绿色盲的遗传病因是 。 41．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。 (1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生 ，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的 将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。 (2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于 序列所编码的蛋白区段。 (3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由 组成。 (4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。 如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因 。 42．（2024·湖南·高考真题）钾是植物生长发育的必需元素，主要生理功能包括参与酶活性调节、渗透调节以及促进光合产物的运输和转化等。研究表明，缺钾导致某种植物的气孔导度下降，使CO2通过气孔的阻力增大；Rubisco的羧化酶（催化CO2的固定反应）活性下降，最终导致净光合速率下降。回答下列问题： (1)从物质和能量转化角度分析，叶绿体的光合作用即在光能驱动下，水分解产生 ；光能转化为电能，再转化为 中储存的化学能，用于暗反应的过程。 (2)长期缺钾导致该植物的叶绿素含量 ，从叶绿素的合成角度分析，原因是 （答出两点即可）。 (3)现发现该植物群体中有一植株，在正常供钾条件下，总叶绿素含量正常，但气孔导度等其他光合作用相关指标均与缺钾时相近，推测是Rubisco的编码基因发生突变所致。Rubisco由两个基因（包括1个核基因和1个叶绿体基因）编码，这两个基因及两端的DNA序列已知。拟以该突变体的叶片组织为实验材料，以测序的方式确定突变位点。写出关键实验步骤：① ；② ；③ ；④基因测序；⑤ 。 43．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） (1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。 (2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是 （填序号）。 (3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。 44．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 (1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。 (2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。 、 (3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。 (4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。 (5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。 45．（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可） 46．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 47．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 48．（2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示） 回答下列问题： (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行 和 。 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第 泳道。 (3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示） (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是 。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。 49．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 50．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 2025年高考生物总复习高频考点必刷800题（广东专用） 专练05 生物技术与工程 (综合题）50题 高频考点预览 考点一 发酵工程 （10题） 考点二 细胞工程与胚胎工程 （20题） 考点三 基因工程（20题） 一、发酵工程 1．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 (2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。 (3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。 【答案】 (1)碳源、氮源 (2) PT7、PBAD 和PBAD 基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达 (3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株 (4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素 (5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。 （2）题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。 （4）由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。 （5）由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。 2．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 【答案】 (1)选择 水 无机盐 氮源 (2)基因工程（或转基因） 限制酶 DNA连接酶 载体（或质粒） (3)诱变育种 (4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀 【分析】1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子； 2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。 【详解】（1）方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。 （2）方法2采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的基因表达载体的构建。 （3）除了上述2种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。 （4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和菌落直径的比值作为判断依据。 3．（2024·全国·高考真题）合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。 (1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是 。 (2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为 个/mL。 (3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是 ，冷却的目的是 。 (4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是 ，判断依据是 。（答出两点即可） (5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈 色。 【答案】 (1)前者微生物分散的活菌和死菌一起计数，后者存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌 (2)5000 (3)杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染 防止温度过高杀死菌种 (4) A A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高 (5)黑 【分析】平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。 【详解】（1）显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法计数只计活菌数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故前者的数量多于后者。 （2）从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，1mL细菌原液中细菌浓度=（菌落数÷菌液体积）×稀释倍数=（100÷200 μL）×10个=5000个。 （3）菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。 （4）A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。 （5）大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色。 4．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 (1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。 (2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。 、 (3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。 (4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。 (5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。 【答案】 (1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性 (2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成 (3)乳酸或有机酸 9 (4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量 (5)提取、分离、纯化 【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。 【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。 （2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。 （3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。 （4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。 （5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。 5．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 【答案】 (1)根 解旋酶 磷酸基团 变长 (2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 (3)划线分离 振荡培养 (4)梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量数量多 【分析】由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相近，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。 （2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。 （3）冻存的酵母菌浓度较高，必须稀释后涂布，也可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。 （4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 6．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。 (1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。 (2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。 (3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。 (4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。 【答案】 (1) 酒精/C2H5OH 能量 (2)无氧/无氧 (3)不能，该实验只能证明随着H2O2 浓度的持续上升，酵母菌存活率下降(酵母菌受损程度加深)，但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2 浓度会持续上升；该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到培养基上无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件 (4)过氧化氢酶/H2O2 酶 【分析】（1）在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖； （2）在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳。 【详解】（1）酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精（C2H5OH）和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。 （2）由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。 （3）依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降（酵母菌受损程度加深），但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升；由题意可知，该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到含不同浓度H2O2的培养基上进行无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件，所以不能完全证实上述推测。 （4）过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。 7．（2023·全国高考真题）某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆（清水淋洗时菌T不会流失），在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵（酒精发酵）。实验流程如图所示。    回答下列问题。 (1)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是 。 (2)采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 （答出1点即可）。通常，可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。在使用该方法时，为了达到良好的灭菌效果，需要注意的事项有 （答出2点即可）。 (3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是 。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是 。发酵液中的乙醇可用 溶液检测。 (4)本实验收集的淋洗液中的 可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是 。 【答案】 (1)菌T能够分泌纤维素酶 (2)为合成微生物细胞结构提供原料（微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂） ①把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除；②为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15~30 min；③无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④灭菌完成后，应使锅内蒸气压力缓慢降低，排气时间不少于10一12分钟。 (3)制造无氧环境 排出二氧化碳 酸性的重铬酸钾溶液 (4)葡萄糖 节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广 【详解】（1）菌T能够分泌纤维素酶，纤维素酶能将纤维素最终分解为葡萄糖，因此在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解。 （2）培养基的主要成分：水、碳源、氮源、无机盐，其中氮源主要为合成微生物的细胞结构提供原料（微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂）。 高压蒸汽灭菌法的注意的事项有①把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，如果高压锅内的空气未排除或未完全排除，则蒸汽不能达到饱和，蒸汽的温度未达到要求的高度，结果导致灭菌的失败；②为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15~30 min；③无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④灭菌完成后，应使锅内蒸气压力缓慢降低，排气时间不少于10一12分钟，否则锅内蒸气压力突然降低，液体突然沸腾，冲走瓶盖，使液体喷出或使容器破裂。 （3）果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，将酵母菌接种到灭菌后的培养基中进行酒精发酵，酒精发酵需要在无氧的条件下进行，此时拧紧瓶盖的主要目的是制造无氧环境。酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，在发酵过程中密闭，所以需要根据发酵进程适时拧松瓶盖放出二氧化碳，酒精可用酸性重铬酸钾溶液来检测，该物质与酒精反应呈现灰绿色。 （4）与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，利用纤维素为原料生产乙醇具有节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广等优点。 8．（2023·北京高考真题）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。 (1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素等。 (2)A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明 。 (3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。 (4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证（主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱） 。 【答案】 (1)氮源、碳源 (2)A菌能在培养平板中生长繁殖 (3)稀释 溶菌圈 (4)假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂 【详解】（1）蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。 （2）将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，表明A菌能在培养平板中生长繁殖。 （3）将含菌量较高的湖泊水样稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。　 （4）根据实验实验材料和设备，圆形滤纸小片可用于吸收某种物质，离心机可用于分离菌体和细菌分泌物，为探究P菌溶解破坏A菌的方式，可假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。 9．（2023·湖南高考真题）某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题： (1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。 (2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。 测试菌 抗菌肽浓度/（µg•mL-1） 55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86 金黄色葡萄球菌 - - - - - + + 枯草芽孢杆菌 - - - - - + + 禾谷镰孢菌 - + + + + + + 假丝酵母 - + + + + + + 注：“+”表示长菌，“-”表示未长菌。 (3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 （答出两点即可）。 (4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 （答出两点）等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 （填“是”或“否”）。    (5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。 ①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体   ②MRSA感染的肺类装配体   ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽   ④生理盐水   ⑤青霉素（抗金黄色葡萄球菌的药物）   ⑥万古霉素（抗MRSA的药物） 【答案】 (1)无机盐、淀粉 (2)金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 1.73~3.45 (3)淀粉酶编码基因M发生突变；重组质粒在大肠杆菌分裂过程中丢失 (4)无菌、无毒环境，含95%空气和5%CO2的气体环境 否 (5)②③④⑥ 【详解】（1）由题意可知，根际促生菌具有固氮作用，可利用空气中的氮气作为氮源，因此用于筛选根际促生菌的培养基的主要营养物质包括水、无机盐和淀粉。 （2）由题表可知，在抗菌肽浓度为3.45-55.20 μg·mL-1范围内，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均不能生长，表明该抗菌肽对它们的抑菌效果较好；因为抗菌肽的浓度为1.73μg·mL-1时，它们均能生长，所以要确定抗菌肽抑菌效果的最低浓度，应在1.73~3.45 μg·mL-1的浓度区间进一步实验。 （3）在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M，可能的原因是淀粉酶编码基因M发生突变；或者是重组质粒在大肠杆菌分裂过程中丢失。 （4）肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及无菌、无毒环境，含95%空气和5%CO2的气体环境等基本条件；由图示可知，肺类装配体形成的过程中没有运用动物细胞融合技术，只涉及了细胞的分裂和分化等内容。 （5）科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力，必备实验材料为：②MRSA感染的肺类装配体、 ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽、④生理盐水（设置对照实验使用）、 ⑥万古霉素（抗MRSA的药物，比较解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽的疗效），故选②③④⑥。 10．（2022·广东·高考真题）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。 回答下列问题： (1)研究者先制备富集培养基，然后采用 法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用 法。据图分析，拟杆菌新菌株在以 为碳源时生长状况最好。 (2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是 。（答一点即可） (3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是 。 (4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有 。 【答案】 (1)高压蒸汽灭菌 平板划线 纤维素 (2)某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活） (3)拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行 (4) 耐低温 【详解】（1）培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图12可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。 （2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活），故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。 （3）拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。 （4）深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。 2、 细胞工程与胚胎工程 11．（2024·广东·高考真题）某些肿瘤细胞表面的PD-L1与细胞毒性T细胞（CTL）表面的PD-1结合能抑制CTL的免疫活性，导致肿瘤免疫逃逸。免疫检查点疗法使用单克隆抗体阻断PD-Ll和PD-1的结合，可恢复CTL的活性，用于肿瘤治疗。为进一步提高疗效，研究者以黑色素瘤模型小鼠为材料，开展该疗法与化疗的联合治疗研究。部分结果见图。    回答下列问题： (1)据图分析， 疗法的治疗效果最佳，推测其原因是 。 (2)黑色素瘤细胞能分泌吸引某类细胞靠近的细胞因子CXCL1.为使CTL响应此信号，可在CTL中导入 基因后再将其回输小鼠体内，从而进一步提高治疗效果。该基因的表达产物应定位于CTL的 （答位置）且基因导入后不影响CTL 的能力。 (3)某兴趣小组基于现有抗体—药物偶联物的思路提出了两种药物设计方案。方案一：将化疗药物与PD-L1 单克隆抗体结合在一起。方案二：将化疗药物与PD-1单克隆抗体结合在一起。你认为方案 （填“一”或“二”）可行，理由是 。 【答案】 (1)联合 该疗法既发挥了化疗药物的作用，也增加了活化的CTL数量 (2) CXCL1受体 (细胞膜)表面 杀伤肿瘤细胞 (3)一 方案一的偶联物既可阻断PD-1与PD-L1 结合，恢复CTL的活性，又使化疗药物靶向肿瘤细胞 【分析】根据题图可知，肿瘤细胞表面的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1蛋白特异性结合，抑制T细胞增殖分化，从而逃避免疫系统的攻击。 【详解】（1）由图a可知，联合疗法肿瘤体积最小，再根据图b可知，采用联合疗法时活化的CTL的数目明显高于免疫检查点疗法和化疗等，原因是该疗法既发挥了化疗药物的作用，也增加了活化的CTL数量。 （2）由于黑色素瘤细胞能分泌吸引某类细胞靠近的细胞因子CXCL1，故要进一步提高治疗效果，可以在CTL中导入细胞因子CXCL1受体基因，使CTL表达出细胞因子CXCL1受体，达到治疗的效果。由于细胞因子是一类肽类化合物，故该基因的表达产物应定位于CTL的细胞膜上，且基因导入后不影响CTL杀伤肿瘤细胞的能力。 （3）某肿瘤细胞表面的PD-L1与细胞毒性T细胞（CTL）表面的PD-1结合能抑制CTL的免疫活性，故应该将化疗药物与PD-L1 单克隆抗体结合在一起，即方案一的偶联物既可阻断PD-1与PD-L1 结合，恢复CTL的活性，又使化疗药物靶向肿瘤细胞。 12．（2024·全国·高考真题）某种病原体的蛋白质A可被吞噬细胞摄入和处理，诱导特异性免疫。回答下列问题。 (1)病原体感染诱导产生浆细胞的特异性免疫方式属于 。 (2)溶酶体中的蛋白酶可将蛋白质A的一条肽链水解成多个片段，蛋白酶切断的化学键是 。 (3)不采用荧光素标记蛋白质A，设计实验验证蛋白质A的片段可出现在吞噬细胞的溶酶体中，简要写出实验思路和预期结果 。 【答案】 (1)体液免疫 (2)肽键 (3)实验思路：以蛋白质A的片段为抗原，制备单克隆抗体，利用差速离心法将吞噬细胞中的溶酶体分离，并提取溶酶体中的蛋白质，利用抗原抗体杂交技术进行检测 预期结果：出现杂交带，表明蛋白质A的片段可出现在吞噬细胞的溶酶体中 【分析】非特异性免疫（先天性免疫）：第一道防线：皮肤、黏膜等；第二道防线：体液中的杀菌物质和吞噬细胞；特异性免疫（获得性免疫）第三道防线：由免疫器官和免疫细胞借助血液循环和淋巴循环组成。 【详解】（1）特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫。病原体感染诱导产生浆细胞的特异性免疫方式属于体液免疫。 （2）蛋白酶可将蛋白质A的一条肽链水解成多个片段，因此蛋白酶切断的是肽键。 （3）为验证蛋白质A的片段可出现在吞噬细胞的溶酶体中，可以蛋白质A的片段为抗原，制备单克隆抗体，利用差速离心法将吞噬细胞中的溶酶体分离，并提取溶酶体中的蛋白质，利用抗原抗体杂交技术进行检测，若出现杂交带，则表明蛋白质A的片段可出现在吞噬细胞的溶酶体中。 13．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究并原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。 【答案】 (1)纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素 (2)花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目 (3) HindⅢ、BamHⅠ 交链格孢 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL 【分析】植物体细胞杂交的基本过程是：首先用酶解法获得原生质体，然后通过一定的技术手段如电刺激、离心、振荡、聚乙二醇等诱导，实现原生质体的融合。只要将水解酶去除，融合的原生质体经培养后，能很快再生出新的细胞壁，形成杂种细胞。杂种细胞具有全能性，经过培养能进一步分裂、分化，进而发育成完整的植株。 【详解】（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。 （2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。 （3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中pL基因的启动子pL。 14．（2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。 (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。 【答案】 (1)外植体 过滤 (2)克隆 DNA合成抑制剂 微生物侵害 (3)丙 先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X (4)器官 代谢途径 关键酶 发酵 【分析】1、植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。2、植物组织培养的条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】（1）植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 （2）分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。 （3）由题可知X只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X的方法，是先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X。 （4）由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的收集，可以通过器官培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的代谢途径和关键酶。 15．（2023·湖南高考真题）某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题： (1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。 (2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。 测试菌 抗菌肽浓度/（µg•mL-1） 55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86 金黄色葡萄球菌 - - - - - + + 枯草芽孢杆菌 - - - - - + + 禾谷镰孢菌 - + + + + + + 假丝酵母 - + + + + + + 注：“+”表示长菌，“-”表示未长菌。 (3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 （答出两点即可）。 (4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 （答出两点）等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 （填“是”或“否”）。    (5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。 ①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体   ②MRSA感染的肺类装配体   ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽   ④生理盐水   ⑤青霉素（抗金黄色葡萄球菌的药物）   ⑥万古霉素（抗MRSA的药物） 【答案】 (1)无机盐、淀粉 (2)金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 1.73~3.45 (3)淀粉酶编码基因M发生突变；重组质粒在大肠杆菌分裂过程中丢失 (4)无菌、无毒环境，含95%空气和5%CO2的气体环境 否 (5)②③④⑥ 【详解】（1）由题意可知，根际促生菌具有固氮作用，可利用空气中的氮气作为氮源，因此用于筛选根际促生菌的培养基的主要营养物质包括水、无机盐和淀粉。 （2）由题表可知，在抗菌肽浓度为3.45-55.20 μg·mL-1范围内，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均不能生长，表明该抗菌肽对它们的抑菌效果较好；因为抗菌肽的浓度为1.73μg·mL-1时，它们均能生长，所以要确定抗菌肽抑菌效果的最低浓度，应在1.73~3.45 μg·mL-1的浓度区间进一步实验。 （3）在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M，可能的原因是淀粉酶编码基因M发生突变；或者是重组质粒在大肠杆菌分裂过程中丢失。 （4）肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及无菌、无毒环境，含95%空气和5%CO2的气体环境等基本条件；由图示可知，肺类装配体形成的过程中没有运用动物细胞融合技术，只涉及了细胞的分裂和分化等内容。 （5）科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力，必备实验材料为：②MRSA感染的肺类装配体、 ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽、④生理盐水（设置对照实验使用）、 ⑥万古霉素（抗MRSA的药物，比较解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽的疗效），故选②③④⑥。 16．（2023·湖北高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。 回答下列问题： (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。 (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。 【答案】 (1)不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 (2)未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞 (3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞 (4)④ 【详解】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 （2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 （3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。 （4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。 故选④。 17．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。    回答下列问题。 (1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。 (2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。 (3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。 (4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。 (5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是 （答出2点即可）。 【答案】 (1)脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要 (2)遗传特性 转基因标识 (3)Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 (4)荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 (5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。 【详解】（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。 （2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。 （3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。 （4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。 （5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。 18．（2023·浙江高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： (1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。 (2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。 (3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？ A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 (4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。 (5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 【答案】 (1)再生 叶 (2)纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用 (3)同一个杂种融合原生质体 ABD (4)再分化 根和芽 (5)模板 M1、M2 凝胶电泳 1 【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。 （2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。 （3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。 （4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。 （5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 19．（2022·全国·高考真题）某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊，为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题， (1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是 。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是 ；精子体外获能可采用化学诱导法，诱导精子获能的药物是 （答出1点即可）。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵母细胞达到 时才具备与精子受精的能力。 (2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行，该培养液的成分除无机盐、激素、血清外，还含的营养成分有 （答出3点即可）等。将培养好的良种囊胚保存备用。 (3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是 。 【答案】 (1)冷冻保存 刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力 肝素或钙离子载体A23187 MⅡ中期 (2)维生素、氨基酸、核苷酸 (3)对受体母羊进行发情处理，合适的时间，将保存的囊胚移植入受体母羊的子宫 【详解】（1）精液可以冷冻保存，使用前再将精液解冻离心分离。刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力，故在体外受精前要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有培养法和化学诱导法，化学诱导法是将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能。卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期（MⅡ中期）才能具备与精子受精的能力。 （2）进行早期胚胎培养的培养液中，除了无机盐、激素、血清外，还含有维生素、氨基酸、核苷酸等。 （3）要利用保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料，获得具有该公羊优良性状的后代，主要是利用胚胎移植技术，即对受体母羊进行发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植，对受体母羊进行是否妊娠的检查，一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代。 20．（2022·重庆高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。 步骤I： 步骤II： (1)花药培养能缩短育种年限，原因是 。在步骤I的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含 的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I中能用于制造人工种子的材料是 。 (2)步骤II中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是 ；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I中的 ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。 【答案】 (1) 单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体 (2) cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，基因工程中只需要转录出编码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行 限制酶和 DNA连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA分子杂交技术 【详解】（1）单倍体育种过程中，单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离，所以可以明显缩短育种年限。将水稻花粉进行脱分化处理，可产生单倍体的愈伤组织，秋水仙素能抑制纺锤体的形成，导致染色体不能移向细胞两极，从而引起细胞内染色体数目加倍，故将其培养于含秋水仙素的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可用于制造人工种子。 （2）cDNA文库又叫部分基因文库，是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，而基因组文库包含了本物种全部基因，基因工程中只需转录出编码蛋白质的基因部分就即可，故选cDNA文库。在构建重组Ti质粒时，必须使用限制性核酸内切酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性未端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。该重组的Ti质粒中含有抗生素抗性基因，故应在培养基中添加抗生素，以便对重组质粒进行筛选和鉴定。将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，即用含eu基因的农杆菌侵染愈伤组织，以便将eui基因导入愈伤组织，获得转基因再生植株。检测植株是否含有eui基因，可采取DNA分子杂交技术的方法。 21．（2022·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： (1)取红曲霉菌种斜面，加适量 洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得 菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、 ，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行 处理。 (2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是 。测定时需用 作空白对照。 (3)生产上提取红曲色素后的残渣，经 处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和 处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 (4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用 酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的 ，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 (5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。 (6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和 。 【答案】 (1)无菌水 活化 离心 破碎 (2)其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 70%乙醇溶液 (3)灭菌 资源化 (4)逆转录 核酸探针 (5)抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 (6)脾 动物血清 【详解】（1）防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细胞内的红曲色素释放出来。 （2）用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。 （3）生产上提取红曲色素后的残渣，经灭菌处理残渣后，作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和资源化处理。 （4）RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （5）腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。 （6）单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。 22．（2022·福建高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题： （一）基因工程抗原的制备 (1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。    (2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1所示。用Xho I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。 培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。 （二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示：    (3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。 (4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。 (5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入 ① 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是 ② 。 (6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。 【答案】 (1)5'→3' (2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列） (3) CD14蛋白/CD14抗原 分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞 (4)能在体外无限增殖 (5)CD14蛋白 参与形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类多，有的不能分泌抗CD14抗体 (6)小鼠腹水 【详解】（1）PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3'-OH与加入的脱氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是从5'→3'。 （2）可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）。 （3）步骤①是注射特定抗原，针对本实验目的可知，要获得抗CD14单克隆抗体，故应该注射CD14蛋白/CD14抗原；步骤⑤是将分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞注入小鼠体内培养，以获得大量单克隆抗体。 （4）步骤②所用的SP2/0细胞是骨髓瘤细胞，特点是能在体外无限增殖。 （5）根据抗原—抗体杂交原理，应该用CD14蛋白检测其中是否含抗CD14蛋白的抗体。因为形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类很多，因此有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体。 （6）从制备单克隆抗体的流程可知，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，最终要从小鼠的腹水中提取抗CD14抗体。 23．（2022·辽宁高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。 Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1 (1)构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 （填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。 (2)质粒在包装细胞内组装出由 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。 Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2 (3)用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用 酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的 中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。 (4)用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行 培养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集 ，提取单克隆抗体。 (5)利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成 ，实现特异性治疗。 【答案】 (1)检测目的基因是否成功导入受体细胞 双分子层中 (2)蛋白质外壳和含N蛋白胞外段基因的核酸 (3) 胰蛋白酶或胶原蛋白 CO2培养箱 (4) 克隆化 抗原抗体杂交 细胞培养液 (5)抗体-药物偶联物/ADC 【详解】（1）构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即磷脂双分子层）。 （2）由于目的基因为N蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N蛋白胞外段基因的核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。 （3）进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有95%空气和5%的CO2混合气体的CO2培养箱中培养。 （4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行克隆化培养和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。 （5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治疗。 24．（2022·海南高考真题）以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。 (1)CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用 处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加 等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 (2)体外获取OSNL的方法有 （答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和 等。启动子是 识别和结合的部位，有了它才能驱动 。 (3)iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是 。 (4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是 。 (5)该实验流程中用到的生物技术有 （答出2点即可）。 【答案】 (1) 胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 动物血清 (2) PCR技术、人工合成法 终止子 RNA聚合酶 目的基因转录出mRNA，最终表达出所需要的蛋白质 (3)基因的选择性表达 (4)诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术 (5)基因工程、动物细胞培养 【详解】（1）动物细胞培养时，鸡胚组织剪碎后需用胰蛋白酶处理，以获得单细胞悬液。动物细胞培养时一般需要在合成培养基中添加血清等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 （2）OSNL为目的基因，体外获取目的基因可通过PCR技术大量扩增或通过人工合成法来合成。基因表达载体中除目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点和标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 （3）据图可知，由iPS细胞诱导形成iPGCs细胞经过了细胞分化，该过程遗传物质没有改变，导致其细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是基因的选择性表达。 （4）诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术。 （5）由图可知，该实验流程中将OSNL基因导入鸡胚成纤维细胞利用了基因工程技术，诱导多能干细胞过程利用了动物细胞培养的技术。 25．（2021·重庆·高考真题）为了研究PDCD4基因对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡的影响，进行了相关实验。 (1)取小鼠子宫时，为避免细菌污染，手术器具应进行 处理；子宫取出剪碎后，用 处理一定时间，可获得分散的子宫内膜组织细胞，再分离获得基质细胞用于培养。 (2)培养基中营养物质应有 （填写两种）；培养箱中CO2浓度为5%，其主要作用是 。 (3)在含PDCD4基因的表达载体中，启动子的作用是 。为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为 。经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有 （填“抑制”或“促进”）作用。 【答案】 (1)灭菌 胰蛋白酶或胶原蛋白酶 (2)无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆（填写两种即可） 维持培养液的pH值 (3) RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出相应的mRNA 基质细胞悬浮液、空载体和基质细胞的混合培养液 促进 【详解】（1）为避免细菌污染，手术器具应进行灭菌处理；动物组织取出剪碎后，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一定时间，可获得分散的动物组织细胞。 （2）动物细胞培养时，培养基中营养物质应有无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆等；培养箱中为95%的空气和5%的CO2，其中5%的CO2的主要作用是维持培养液的pH值。 （3）启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出相应的mRNA。为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为基质细胞悬浮液（空白对照）、空载体和基质细胞的混合培养液（排除空载体的作用）。经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有促进作用。 26．（2021·江苏·高考真题）根据新冠病毒致病机制及人体免疫反应特征研制新冠疫苗，广泛接种疫苗可以快速建立免疫屏障，阻击病毒扩大。图1为新冠病毒入侵细胞后的增殖示意图，图2为人体免疫应答产生抗体的一般规律示意图。请据图回答下列问题。 (1)图1中，新冠病毒通过S蛋白与细胞表面的ACE2受体结合，侵入细胞释放出病毒的（+）RNA，在宿主细胞中经 合成病毒的RNA聚合酶。 (2)在RNA聚合酶的作用下，病毒利用宿主细胞中的原料，按照 原则合成（-）RNA。随后大量合成新的（+）RNA。再以这些RNA为模板，分别在 大量合成病毒的N蛋白和S、M、E蛋白。 (3)制备病毒灭活疫苗时，先大量培养表达 的细胞，再接入新冠病毒扩大培养，灭活处理后制备疫苗。细胞培养时需通入CO2，其作用是 。 (4)制备S蛋白的mRNA疫苗时，体外制备的mRNA常用脂质分子包裹后才用于接种。原因一是人体血液和组织中广泛存在 ，极易将裸露的mRNA水解，二是外源mRNA分子不易进入人体细胞产生抗原。 (5)第一次接种疫苗后，人体内识别到S蛋白的B细胞，经过增殖和分化，形成的 细胞可合成并分泌特异性识别 的IgM和IgG抗体（见图2），形成的 细胞等再次接触到S蛋白时，发挥免疫保护作用。 (6)有些疫苗需要进行第二次接种，据图2分析进行二次接种的意义是 。 【答案】 (1)翻译 (2) 碱基互补配对 游离核糖体和粗面内质网上的核糖体 (3) ACE2受体 维持培养液的酸碱度 (4)RNA酶 (5)浆 新冠病毒S蛋白 记忆 (6)激发再次应答在人体内产生更多维持时间更长的抗体,并储备更多的记忆细胞 【详解】（1）结合分析可知，新冠病毒侵入细胞后释放出病毒的（+）RNA，在宿主细胞中经翻译合成病毒的RNA聚合酶。 （2）在RNA聚合酶的作用下，病毒利用宿主细胞中的原料，按照碱基互补配对原则合成（-）RNA；随后再通过复制合成大量新的（+）RNA，再以这些RNA为模板，分别在游离核糖体和粗面内质网上的核糖体大量合成病毒的N蛋白和S、M、E蛋白。 （3）病毒表面的蛋白质可作为抗原激发机体的特异性免疫过程，制备新冠病毒灭活疫苗时，先大量培养能够表达ACE2受体的细胞，再接入新冠病毒扩大培养，经灭活处理后制备疫苗；动物细胞培养时常需通入CO2，其目的是维持培养液的酸碱度。 （4）由于人体血液和组织中广泛存在RNA酶极易将裸露的mRNA水解，另外外源mRNA分子不易进入人体细胞产生抗原，因此，制备S蛋白的mRNA疫苗时，体外制备的mRNA常用脂质分子包裹后才用于接种。 （5）第一次接种疫苗后，刺激B细胞增殖和分化，形成的浆细胞可合成并分泌特异性识别新冠病毒S蛋白的IgM和IgG抗体，并产生记忆细胞；当再次接触到S蛋白时，记忆细胞增殖分化，产生大量浆细胞，分泌大量抗体，发挥免疫保护作用。 （6）进行二次接种的意义：激发再次应答在人体内产生更多维持时间更长的抗体,并储备更多的记忆细胞。 27．（2021·湖南高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： （1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是 ，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的 断开。 （2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是 。 （3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是 。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为 （答出两点即可），功能上具有 。 （4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的 淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路 。 【答案】 （1） 限制性核酸内切酶（限制酶） 磷酸二酯键 （2） 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养 （3） 动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答） 发育的全能性 （4） B 取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交 【详解】（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。 （2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。 （3）由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。 （4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路为：取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交。 28．（2021·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。 （1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或 法，两种方法均能在固体培养基上形成 。对分离的菌株进行诱变、 和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。 （2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除 ；③检验固定化菌株的 。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是 。 （3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是 。 （二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。 （1）为保护三叶青的 多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用 技术，实现了三叶青的林下种植。 （2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成 和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成 ，再分化形成毛状根。 （3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次 培养，培养基中添加抗生素的主要目的是 。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的 和温度，调节培养基成分中的 ，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 【答案】 (1） （1）涂布分离 单菌落 筛选 （2） 未固定的细菌 降解富营养化污水污染物的能力 包埋法和吸附法 （3） 特定介质能为菌株繁殖提供X （2） （1）遗传 间种 （2） DNA聚合酶 愈伤组织 （3）继代 杀灭发根农杆菌 转速 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度 【详解】（一）分析题意可知，本实验目的是从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备固定化菌株。 （1）分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。 （2）固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。 （3）由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。 （二）（1）生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。 （2）分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。 （3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分 29．（2020·江苏高考真题）新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图1为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题： （1）图1中人体内抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被 细胞表面的受体识别后激活该细胞。 （2）B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的 ，形成 细胞。 （3）为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的 ；采集血液样本主要用于血清学检查，检测 。 （4）据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射 免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得 细胞。因为同一种抗原可能激活 细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。 【答案】 （1） T （2） 增殖、分化 浆细胞和记忆 （3） 核酸 抗新型冠状病毒抗体 （4） 棘突蛋白（或S蛋白） 杂交瘤 多种B 【详解】（1）据题图1可知，人体内抗原递呈细胞吞噬新冠病毒，并将新冠病毒的抗原暴露，呈递给T细胞，被T细胞表面的受体识别后激活T细胞； （2）激活的T细胞释放淋巴因子，并将抗原呈递给B细胞，B细胞识别入侵的病毒后，迅速增殖分化成浆细胞和记忆细胞； （3）临床上为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测疑似患者的呼吸道是否有新冠病毒的核酸，采集血液样本主要用于血清学检查，检测血清中是否产生抗新型冠状病毒的抗体； （4）据题中图2所示，结合单克隆抗体制备方法，要研制抗棘突蛋白单克隆抗体，需先注射新冠病毒的棘突蛋白（或S蛋白），以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得融合的、未融合的细胞，用HAT筛选培养基培养，未融合的B细胞不能长期生存而死亡，未融合的骨髓瘤细胞不能合成DNA而死亡，只有杂交瘤细胞能成活；由于同一种抗原可能激活多种B细胞，筛选出的融合的骨髓瘤细胞就可能分泌多种抗体，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞。 30．（2020·全国高考真题）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。 回答下列问题： （1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是 。 （2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤： 。 （3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于 ，使用该培养基进行细胞培养的结果是 。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是 。 （4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有 （答出2点即可）。 【答案】 (1) 诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞 (2) 取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液 (3) 选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的反应具有特异性 (4) 将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养 【详解】（1）实验前给小鼠甲注射病毒A，是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。 （2）取小鼠的脾脏，剪碎组织，用胰蛋白酶处理获得单个细胞，加入培养液可以制成单细胞悬液。 （3）图中筛选1需要用到选择培养基，只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，该过程要用到抗原抗体杂交，故筛选所依据的原理是抗原-抗体反应具有特异性。 （4）获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，可以在体外培养液中进行培养，或在小鼠的腹腔中进行培养，使杂交瘤细胞大量增殖。 3、 基因工程 31．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 (2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。 (3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。 【答案】 (1)碳源、氮源 (2) PT7、PBAD 和PBAD 基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达 (3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株 (4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素 (5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。 （2）题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。 （4）由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。 （5）由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。 32．（2024·广东·高考真题）遗传性牙龈纤维瘤病（HGF）是一种罕见的口腔遗传病，严重影响咀嚼、语音、美观及心理健康。2022年，我国科学家对某一典型的HGF家系（如图）进行了研究，发现ZNF862基因突变导致HGF发生。 回答下列问题： (1)据图分析，HGF最可能的遗传方式是 。假设该致病基因的频率为p，根据最可能的遗传方式，Ⅳ2生育一个患病子代的概率为 （列出算式即可）。 (2)为探究ZNF862 基因的功能，以正常人牙龈成纤维细胞为材料设计实验，简要写出设计思路： 。为从个体水平验证ZNF862基因突变导致HGF，可制备携带该突变的转基因小鼠，然后比较 的差异。 (3)针对HGF这类遗传病，通过体细胞基因组编辑等技术可能达到治疗的目的。是否也可以通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传病？作出判断并说明理由 。 【答案】 (1) 常染色体显性遗传病 （1+p）/2 (2) 将正常细胞分为甲乙两组，其中甲组敲除ZNF862基因，观察甲乙两组细胞表型从而探究该基因的功能 转基因小鼠和正常小鼠牙龈 (3)不可以，违反法律和伦理，且存在安全隐患。 【分析】人类遗传病分为单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病： （1）单基因遗传病包括常染色体显性遗传病（如并指）、常染色体隐性遗传病（如白化病）、伴X染色体隐性遗传病（如血友病、色盲）、伴X染色体显性遗传病（如抗维生素D佝偻病）； （2）多基因遗传病是由多对等位基因异常引起的，如青少年型糖尿病； （3）染色体异常遗传病包括染色体结构异常遗传病（如猫叫综合征）和染色体数目异常遗传病（如21三体综合征） 【详解】（1）由图可知，该病男女患者数量相当，且代代遗传，因此该病最可能的遗传方式为常染色体显性遗传病；假设该病由基因A/a控制，则致病基因A的基因频率为p，正常基因a的基因频率为1-p，Ⅳ2的基因型为Aa，产生配子基因型为1/2A和1/2a，正常人中基因型为AA的概率为p2，基因型为Aa的概率为2p（1-p），基因型为aa的概率为（1-p）2，Ⅳ2与AA生育患病子代的概率为p2，与Aa生育患病子代的概率为2p(1-p)×3/4，与aa生育患病子代的概率为（1-p）2×1/2，故Ⅳ2生育一个患病子代的概率为p2+2p(1-p)×3/4+（1-p）2×1/2=（1+p）/2。（因IV2的基因型为Aa，其遗传A给后代的概率是1/2，此时无论父方如何，子代一定患病，故概率为1/2×1；其遗传a给后代的概率是1/2，在这种情形下，父方遗传A给后代，子代才患病，而其概率就等于A的基因频率即p，故子代患病概率为1/2*p；综上，子代患病概率为1/2+p/2=(1+p)/2。） （2）从细胞水平分析，培养该细胞，敲除ZNF862基因，观察细胞表型等变化，通过比较含有该基因时的细胞表型从而探究该基因的功能，设计思路为：将正常细胞分为甲乙两组，其中甲组敲除ZNF862基因，观察甲乙两组细胞表型从而探究该基因的功能；从个体水平分析，通过比较转基因小鼠和正常小鼠牙龈差异可得出该基因的功能。 （3）一般不通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传，该方式违反法律和伦理，且存在安全隐患。 33．（2024·全国·高考真题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。 (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。 (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是 。 氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC 脯氨酸 CCA CCC 亮氨酸 CUG 甘氨酸 GGC GGG 终止 UGA 【答案】 (1) 变性 氢键 (2) 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶 (3) 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒 (4)甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸 【分析】1、基因工程基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。 2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。 （2）构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4DNA连接酶连接。 （3）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒 （4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。 34．（2024·全国·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。 【答案】(1) 磷酸二酯键 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达 (2)C-G、A-T、U-A (3) N基因的两条链 不能扩增出目的基因 (4)不污染环境、增加土壤养分 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因，且能保证N基因正常发表达。 （2）RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。 （3）用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出DNA片段。 （4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。 35．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达 (2)C (3)其他器官细胞中，G和H两个基因是否转录出相应的mRNA或是否翻译出相应的蛋白质 (4) 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。 （2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确； C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误； C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选C。 （3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA或是否翻译出相应的蛋白质。 （4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，需要将增强子插入到目的基因内部。图如下： 36．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究并原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。 【答案】 (1)纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素 (2)花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目 (3) HindⅢ、BamHⅠ 交链格孢 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL 【分析】植物体细胞杂交的基本过程是：首先用酶解法获得原生质体，然后通过一定的技术手段如电刺激、离心、振荡、聚乙二醇等诱导，实现原生质体的融合。只要将水解酶去除，融合的原生质体经培养后，能很快再生出新的细胞壁，形成杂种细胞。杂种细胞具有全能性，经过培养能进一步分裂、分化，进而发育成完整的植株。 【详解】（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。 （2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。 （3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中pL基因的启动子pL。 37．（2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。 (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。 【答案】 (1)外植体 过滤 (2)克隆 DNA合成抑制剂 微生物侵害 (3)丙 先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X (4)器官 代谢途径 关键酶 发酵 【分析】1、植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。2、植物组织培养的条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】（1）植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 （2）分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。 （3）由题可知X只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X的方法，是先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X。 （4）由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的收集，可以通过器官培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的代谢途径和关键酶。 38．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 【答案】 (1)选择 水 无机盐 氮源 (2)基因工程（或转基因） 限制酶 DNA连接酶 载体（或质粒） (3)诱变育种 (4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀 【分析】1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子； 2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。 【详解】（1）方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。 （2）方法2采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的基因表达载体的构建。 （3）除了上述2种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。 （4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和菌落直径的比值作为判断依据。 39．（2024·江西·高考真题）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题： (1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型（WT，纯合体）。据图判断，突变体Cer1中c基因的突变类型是 。    (2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交．F1全为野生型，F1与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道 （从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。 (3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因（位于另一条染色体上）也发生了突变，产生了基因d1，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是 。 (4)假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因d2。CCDD与ccd2d2个体杂交，F1的表型为野生型，F1自交，F2野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格： F2部分个体基因型 棕榈酸（填“有”或“无”） 16-羟基棕榈酸（填“有”或“无”） 颖壳蜡质（填“有”或“无”） Ccd2d2 有 ① 无 CCDd2 有 有 ② 【答案】 (1)碱基对的缺失 (2) 3 1 1：1 (3)密码子具有简并性 (4) 9：7 有 有 【分析】1、基因分离定律的实质：在杂合的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给子代； 2、基因自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合； 3、电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 【详解】（1）图示为在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物，c基因是C基因突变而来，c基因两侧的碱基序列与C基因相同，PCR扩增也能扩增c基因，由图可知，泳道1是突变体Cer1，则扩增c基因时两引物间的长度为1100bp，泳道2是野生型（WT，纯合体），则扩增C基因时两引物间的长度为2000bp，说明c基因比C基因长度变短，是碱基对的缺失引起的突变。 （2）突变体Cer1为cc，纯合野生型为CC，则F1为Cc，F1与突变体Cer1杂交后代中Cc：cc=1：1，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道3和泳道1中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为1：1； （3）编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是密码子具有简并性； （4）由题意可知，C/c、D/d2基因遵循基因的自由组合定律，因此CCDD与ccd2d2个体杂交，F1为（CcDd2），表型为野生型，F1（CcDd2）自交，F2野生型与突变型的比例为C-D-：（ccD-+C-d2d2+ccd2d2）=9：7；Ccd2d2含有C基因无D基因，有16-羟基棕榈酸，由于不含D基因，因为16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需有D基因，故无颖壳蜡质；CCDd2含有C基因和D基因，有16-羟基棕榈酸，也有颖壳蜡质。 40．（2024·湖南·高考真题）色盲可分为红色盲、绿色盲和蓝色盲等。红色肓和绿色盲都为伴X染色体隐性遗传，分别由基因L、M突变所致；蓝色盲属常染色体显性遗传，由基因s突变所致。回答下列问题： (1)一绿色盲男性与一红色盲女性婚配，其后代可能的表型及比例为 或 ；其表型正常后代与蓝色盲患者（Ss）婚配，其男性后代可能的表型及比例为 （不考虑突变和基因重组等因素）。 (2)1个L与1个或多个M串联在一起，Z是L上游的一段基因间序列，它们在X染色体上的相对位置如图a。为阐明红绿色盲的遗传病因，研究人员将男性红绿色盲患者及对照个体的DNA酶切产物与相应探针杂交，酶切产物Z的结果如图b，酶切产物BL，CL、DL、BM、CM和DM的结果见下表，表中数字表示酶切产物的量。 BL CL DL BM CM DM 对照 15.1 18.1 33.6 45.5 21.3 66.1 甲 0 0 0 21.9 10.9 61.4 乙 15.0 18.5 0 0 0 33.1 丙 15.9 18.0 33.0 45.0 21.0 64.0 丁 16.0 18.5 33.0 45.0 21.0 65.0 ①若对照个体在图a所示区域的序列组成为“Z+L+M+M”则患者甲最可能的组成为 （用Z、部分Z，L、部分L，M、部分M表示）。 ②对患者丙、丁的酶切产物Z测序后，发现缺失Z1或Z2，这两名患者患红绿色盲的原因是 。 ③本研究表明：红绿色盲的遗传病因是 。 【答案】(1) 正常女性∶红色盲男性=1∶1 正常女性∶绿色盲女性∶红色盲男性∶红绿色盲男性=1∶1∶1∶1 红蓝色盲∶绿蓝色盲∶红色盲∶绿色盲=1∶1∶1∶1 (2) 部分Z+M+部分M Z发生突变，导致L、M基因无法表达 L、M基因的共用调控序列发生突变或L、M基因发生基因突变 【分析】伴性遗传是指在遗传过程中的子代部分性状由性染色体上的基因控制，这种由性染色体上的基因所控制性状的遗传上总是和性别相关，这种与性别相关联的性状遗传方式就称为伴性遗传。 【详解】（1）根据题意分析，绿色盲男性的基因型为XLmY，红色盲女性的基因型为XLmXLm或XLmMXlm，若该女性的基因型为XLMXLM，则后代的基因型及比例为XLmXLM∶XLMY=1∶1,表型及比例为正常女性∶红色盲男性=1∶1；若该女性的基因型为XLMXlM，则后代的基因型及比例为XlmXlm∶XlmXlm∶XLmY∶XlmY=1∶1∶1∶1表型及比例为正常女性∶绿色盲女性∶红色盲男性∶红绿色盲男性=1∶1∶1∶1.无论哪种情况，后代的正常个体只有女性，且基因型为XLmXLm，若同时考虑蓝色盲，其基因型为aaXLmXLm，而蓝色盲男性的基因型为SxXLmY，两者婚配，其男性后代的基因型及比例为SsXLmY∶SxXLMY∶ssXLmY=1∶1∶1∶1，表型及比例为绿蓝色盲∶红蓝色盲∶绿色盲∶红色盲=1∶1∶1∶1。 （2）①根据对照组的实验结果可知，对照组的序列组成为Z+L+M+M，患者甲的Z序列的电泳结果和对照组不同，且电泳距离更远，因此片段较小，只具有部分Z片段；患者甲BL、CL和DL均缺失，因此不含L片段；对照组含有两个M片段，其BM、CM和DM的量分别为45.5、21.3和66.1，而患者甲BM、CM和DM的量分别为21.9、10.9和61.4，其BM、CM的量为对照组的一半，而DM的量和对照组相差不大，因此患者甲含有一个完整的M片段和第二个M片段的DM区，因此其序列组成表示为部分Z+M+部分M。 ②患者丙和患者丁的L和M片段的相关结果和对照组无差异，但缺失Z1或Z2，说明Z1和Z2的缺失会影响L和M基因的表达，从而使机体患病，因此其患病的原因是Z发生突变，导致L、M基因无法表达。 ③结合①②的结果并分析甲、乙、丙和丁的检测结果可知，红绿色盲的遗传病因是L、M基因的共用调控序列发生突变或L、M基因发生基因突变。 41．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。 (1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生 ，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的 将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。 (2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于 序列所编码的蛋白区段。 (3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由 组成。 (4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。 如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因 。 【答案】 (1)兴奋 突触 (2)非保守 (3)长度相同但非保守序列不同的DNA片段 (4)少量的气体分子通过活化的G蛋白、活化的C酶，在C酶的催化下合成大量的cAMP使Na+通道打开，Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知 【分析】兴奋在神经元之间的传递：（1）神经元之间的兴奋传递就是通过突触实现的。（2）兴奋的传递方向：单向传递。 【详解】（1）气味分子刺激感受器产生兴奋。嗅觉神经元轴突末端、神经元间隙与下一个神经元组成突触，包括突触前膜、突触间隙和突触后膜。 （2）不同气味受体能特异性识别相应气味分子的关键在于蛋白质中结构不同的部分，由非保守序列编码。 （3）由图可知，PCR产物含保守序列和非保守序列，若非保守序列不同，酶切产物的长度可能不同，导致酶切片段长度之和大于PCR产物长度，因此PCR产物由长度相同但非保守序列不同的DNA片段组成。 （4）由图丙可知，少量的气体分子通过活化G蛋白使得C酶活化，在C酶的催化下，由ATP合成大量的cAMP ，促使Na+通道打开，Na+内流，导致神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知。 42．（2024·湖南·高考真题）钾是植物生长发育的必需元素，主要生理功能包括参与酶活性调节、渗透调节以及促进光合产物的运输和转化等。研究表明，缺钾导致某种植物的气孔导度下降，使CO2通过气孔的阻力增大；Rubisco的羧化酶（催化CO2的固定反应）活性下降，最终导致净光合速率下降。回答下列问题： (1)从物质和能量转化角度分析，叶绿体的光合作用即在光能驱动下，水分解产生 ；光能转化为电能，再转化为 中储存的化学能，用于暗反应的过程。 (2)长期缺钾导致该植物的叶绿素含量 ，从叶绿素的合成角度分析，原因是 （答出两点即可）。 (3)现发现该植物群体中有一植株，在正常供钾条件下，总叶绿素含量正常，但气孔导度等其他光合作用相关指标均与缺钾时相近，推测是Rubisco的编码基因发生突变所致。Rubisco由两个基因（包括1个核基因和1个叶绿体基因）编码，这两个基因及两端的DNA序列已知。拟以该突变体的叶片组织为实验材料，以测序的方式确定突变位点。写出关键实验步骤：① ；② ；③ ；④基因测序；⑤ 。 【答案】 (1) O2和H+ ATP和NADPH (2)减少 缺钾会使叶绿素合成相关酶的活性降低；缺钾会影响细胞的渗透调节，进而影响细胞对Mg、N等的吸收，使叶绿素合成减少 (3)分别提取该组织细胞的细胞核DNA和叶绿体DNA（取突变体叶片，提取DNA） 根据编码Rubisco的两个基因的两端DNA序列设计相应引物 利用提取的DNA和设计的引物分别进行PCR扩增并电泳 和已知基因序列进行比较 【分析】光合作用包括光反应和暗反应阶段： 1、光反应阶段是在类囊体的薄膜上进行的。叶绿体中光合色素吸收的光能将水分解为氧和H+，氧直接以氧分子的形式释放出去，H+与氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）结合，形成还原型辅酶Ⅱ（NADPH）。还原型辅酶Ⅱ作为活泼的还原剂，参与暗反应阶段的化学反应，同时也储存部分能量供暗反应阶段利用；在有关酶的催化作用下，提供能量促使ADP与Pi反应形成ATP。 2、暗反应在叶绿体基质中进行，在特定酶的作用下，二氧化碳与五碳化合物结合，形成两个三碳化合物。在有关酶的催化作用下，三碳化合物接受ATP和NADPH释放的能量，并且被NADPH还原。一些接受能量并被还原的三碳化合物，在酶的作用下经过一系列的反应转化为糖类；另一些接受能量并被还原的三碳化合物，经过一系列变化，又形成五碳化合物。 【详解】（1）植物光反应过程中水的光解会产生O2和H+，H+和NADP+结合产生NADPH。该过程中光能转化为电能，电能再转化为储存在ATP和NADPH中的化学能。 （2）长期缺钾导致该植物的叶绿素含量降低，其原因是钾参与酶活性的调节，缺钾会降低叶绿素合成相关酶的活性；钾参与渗透调节，缺钾会影响细胞渗透压，进而影响细胞对Mg、N等的吸收，而Mg和N是合成叶绿素的原料，因此最终会影响叶绿素的合成。 （3）Rubisco由两个基因编码，这两个基因及两端的DNA序列已知，因此检测其是否突变的基本思路利利用PCR技术扩增突变体的相应基因，测序后和已知序列进行比较。其具体步骤为：①分别提取该组织细胞的细胞核DNA和叶绿体DNA；②根据编码Rubisco的两个基因的两端DNA序列设计相应引物；③利用提取的DNA和设计的引物分别进行PCR扩增并电泳；④基因测序；⑤和已知基因序列进行比较。 43．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） (1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。 (2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是 （填序号）。 (3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。 【答案】 (1) HhG+G- 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加 染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上 (2) HhG+G+、HhG+G- ④ (3)乙 乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控 【分析】由图1可知，H基因条件敲除小鼠，H基因表达受TM试剂调控；由图2可知①只含有h基因，仍正常表达H蛋白，②③都含有H基因，可正常表达H蛋白，④含有h基因和G基因。 【详解】（1）由题干可知，亲本为HhG-G-、HHG+G-，要获得H基因条件敲除小鼠hhG+G-和hhG+G+，则用于繁殖F1的基因型是HhG+G-。近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降。6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上。 （2）由图2可知，③含有基因H、h、G，故其基因型为HhG+G+、HhG+G-。结合图1和图2，①只含有h基因，仍正常表达H蛋白，②③都含有H基因，可正常表达H蛋白，④含有h基因和G基因，TM试剂激活G酶可剪切LX序列，使h基因异常，无法表达H蛋白，故检测H蛋白水平为0的是④。 （3）由题干可知，患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关，由题干和题图可知，乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控，故选择H基因条件敲除鼠乙。 44．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 (1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。 (2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。 、 (3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。 (4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。 (5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。 【答案】 (1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性 (2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成 (3)乳酸或有机酸 9 (4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量 (5)提取、分离、纯化 【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。 【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。 （2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。 （3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。 （4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。 （5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。 45．（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可） 【答案】 (1)在胚乳中特异性表达的 终止转录 HindIII EcoRI (2)农杆菌转化 r2HNmRNA 抗原抗体杂交 (3) 1/4 纯合体自交后代不发生性状分离 (4)体液 细胞 (5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高 【分析】基因工程是一项体外DNA重组技术，需要借助限制酶、 DNA 连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在胚乳中特异性表达的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcoRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HNmRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。 （4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 （5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。 46．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】 (1)低 256 GTTT CAAT (2)卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 【分析】1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 2、PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR可以快速的获取和扩增目的基因。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。 （2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 （3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 47．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 【答案】 (1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接） (3)酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测有DNA分子杂交、RNA分子杂交、抗原-抗体杂交；个体水平上的鉴定有抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 （2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 （3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段； ②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 （4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 48．（2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示） 回答下列问题： (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行 和 。 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第 泳道。 (3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示） (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是 。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。 【答案】 (1) 编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失 (2) 3 2 (3) 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1 (4) 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长 【分析】基因分离定律实质：在杂合子细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；当细胞进行减数分裂，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子当中，独立地随配子遗传给后代。 【详解】（1）依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。 （2）从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。 （3）据题意可知，野生型基因用++表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因型用+f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠（+f/++）与g小鼠（++/gg）杂交，后代为++/+g和+f/+g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠（+f）与g小鼠（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。 （4）据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢失，无法转录出 mRNA，也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。 49．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 【答案】 (1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长 (2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 (3) 划线分离 振荡培养 (4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量数量多 【分析】由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相近，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。 （2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。 （3）冻存的酵母菌浓度较高，必须稀释后涂布，也可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。 （4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 50．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 【答案】 (1)蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等） (2) NV 基因 大于 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列 (3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞 【分析】基因工程，又称基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 【详解】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。 （2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。 （3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！66 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$