第10单元 第6课时 基因工程的基本工具与操作程序-【优化探究】2025年高考生物一轮复习高考总复习配套课件（人教版2019 双选）

生物技术与工程 第十单元 第6课时　基因工程的基本工具与操作程序 [课标要求]　1.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 内容索引 NEIRONGSUOYIN 重组DNA技术的基本工具 基因工程的基本操作程序 考点二 考点一 课时作业 巩固训练 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 考点三 高考演练 素能提升 课堂落实——10分钟自纠自查 重组DNA技术的基本工具 考点一 归纳 梳理必备知识 1．基因工程的概念 目的基因　 基因重组　 分子　 遗传性状 2．基因工程的诞生和发展 (1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间________。 (2)DNA双螺旋结构的提出和____________的证明。 (3)中心法则的确立。 (4)遗传密码的破译。 转移　 半保留复制 (5)基因转移载体和限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 (6)DNA体外重组的实现。 (7)重组DNA表达实验的成功。 (8)DNA测序和合成技术的发明。 (9)________技术的发明。 (10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 　PCR 3．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 原核生物　 磷酸二酯键　 黏性末端 (2)DNA连接酶 黏性末端　 限制酶 (3)与DNA有关的几种酶的比较 (4)载体 环状双链DNA分子　 一个至多个　 自我复制　 标记 拓展 深挖教材细节 1．(2023·新课标卷，6改编)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。思考回答下列问题。 (1)质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接，能构建重组表达载体吗？为什么？ 提示：不能。酶3切割后得到的是平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端。 (2)质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接，能构建重组表达载体吗？为什么？ 提示：不能。质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者应有相同的黏性末端才能连接。 (3)质粒和目的基因分别用哪种酶切割，再用哪种连接酶连接，构建重组表达载体方案合理且效率最高？ 提示：质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接，既可避免质粒和目的基因的自身环化，又能保证目的基因正确插入质粒，此重组表达载体的构建方案最合理且高效。 2．（选择性必修3 第72页正文）天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程载体？为什么？ 提示：不可以。基因工程的载体具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点，实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 突破 强化关键能力 1．如图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（箭头表示切点，切出的断面为黏性末端）。下列叙述错误的是(　　) A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶具有专一性 B．限制酶2和3识别的序列都包含6个核苷酸 C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同 D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2 D 不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点体现了酶具有专一性，A正确；据图可知，限制酶2和3识别的序列分别是—CCGCGG—和—GGATCC—，均为6个核苷酸，B正确；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均为GATC，C正确；限制酶只能识别特定的DNA序列，因此三种限制酶均不能识别和切割RNA中核糖核苷酸序列，D错误。 2．如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是(　　) A．将含有目的基因的DNA与质粒分别 用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下， 生成的由两个DNA片段连接形成的产物 有两种 B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C．为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因 答案：C 根据题意，目的基因的两端有EcoRⅠ、 BamHⅠ的酶切位点，将含有目的基因 的DNA用EcoRⅠ酶切，会得到目的基 因片段；根据质粒的简图可知，将质粒 用EcoRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长 的链状DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段三种产物，A错误；DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端或平末端连接起来，形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和 切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ 切割，目的基因两端形成的末端不同， 切割后的质粒两端形成的末端不同，再 用DNA连接酶连接，可以防止目的基因 反向连接和质粒自身环化，C正确；导入 普通质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌都能在含青霉素的培养基中生长，因此能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞不一定含有目的基因，D错误。 方法技巧 图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。　 基因工程的基本操作程序 考点二 归纳 梳理必备知识 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期____________等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知________和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 表达产物　 结构 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR获取和扩增目的基因 ⅰ.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据________________的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 ⅱ.PCR反应的条件：一定的缓冲液、DNA模板、2种________、4种___________、___________DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。 DNA半保留复制　 引物　 脱氧核苷酸　 耐高温的　 ⅲ.PCR扩增的过程 90　 50　 72 ⅳ.PCR产物的鉴定：常采用________________来鉴定。 ③通过构建____________来获取目的基因。 [教师独具] 提醒：明辨PCR技术的4个易错点 ①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 琼脂糖凝胶电泳　 基因文库 ②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 ③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 ④PCR的扩增结果：DNA分子以指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环次数）。 (4)拓展：PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A（或B） 的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B 的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21+1－2 6＝22+1－2 14＝23+1－2 2n+1－2 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中____________，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 稳定存在　 上游　 RNA聚合酶　 转录　 下游 (3)构建过程 (4)启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端　 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 3.将目的基因导 入受体细胞 子房　 T-­DNA　 染色体　 受精卵 [教师独具] 提醒：①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-­DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T-­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T-­DNA导入受体细胞。 ②根据Ti质粒的T-­DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取（切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ）。 4．目的基因的检测与鉴定 抗原—抗体 杂交 5．拓展：筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。 (3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 拓展 深挖教材细节 1．（选择性必修3 第77页正文）利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ 提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向（模板链的3′端）开始，所以引物的碱基序列是不同的。 2．（选择性必修3 第80页正文）为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？ 提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。 3．（选择性必修3 第81页“资料卡”）在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上？ 提示：Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。 突破 强化关键能力 1．PCR反应中使用的引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，而5′端则无严格限制，常用于给目的基因两侧添加限制酶切点等序列。下列相关叙述正确的是(　　) A．PCR第3个循环，消耗了7对引物 B．反应体系中游离的脱氧核苷酸作为PCR 扩增的原料会依次连接到引物的5′端 C．耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到双链DNA片段的引物链上 D．用图中引物扩增仅需2个循环后就能获得两端均添加限制酶切点的目的基因 C 该DNA是双链，第一次循环需要1对 引物，第二次需要2对，第三次需要4 对，即PCR第3个循环，消耗了4对引 物，A错误；进行PCR时，扩增是从引物的3′端延伸，因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3′端，B错误；耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到双链DNA片段的引物链上，C正确；由题图可知，第一、二次循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两次循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三次循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即用图中引物扩增至少3个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的基因，D错误。 2．(多选)如图为培育转基因抗植物病毒番茄 的过程示意图。下列叙述正确的是(　　) A．过程A需要限制酶和DNA连接酶的参与 B．过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性 C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达 D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定 AD 题图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；将目的基因导入植物细胞时，不需要CaCl2处理，B错误；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，C错误；转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过接种特定病毒，观察番茄是否被感染来进行鉴定，D正确。 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 考点三 归纳 梳理必备知识 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理 不溶于　 2 mol/L　 二苯胺　 (2)操作流程 95%　 沸水 注意：加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 ①PCR原理：利用了________________原理。 DNA的热变性 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的____________等有关。 相反　 大小和构象 (2)PCR实验操作步骤 底部 (3)DNA的电泳鉴定 拓展 深挖教材细节 1．在DNA的粗提取与鉴定实验中，实验过程要对实验材料充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状物或沉淀物，用二苯胺试剂鉴定不显示蓝色。 2．DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？ 提示：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。 突破 强化关键能力 1．下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　) A．洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量 B．滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质 D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化 D 洋葱研磨液要用纱布过滤，A错误；DNA在酒精中的溶解度很低，蛋白质在酒精中的溶解度较高，故可以利用DNA不溶于酒精的原理，提纯DNA，但提取量不变，B错误；向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液有利于去除杂质，加入2 mol/L的NaCl溶液的作用是溶解粗提取的DNA，C错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热，冷却后再观察颜色变化，D正确。 2．用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液，2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA，3～9号的模板为转基因植株的DNA，10号使用无菌水代替模板DNA。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出的分析不合理的是(　　) A．PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B．3号样品植株导入的目的基因一定能成功 表达 C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B PCR过程中，可以通过设计特定的引物 来扩增特定的DNA片段。3～9号是转基 因植株，理论上应包含目的基因，结合 2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；3号PCR结果包含250～500 bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B不合理；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号放入无菌水，可排除反应体系等对实验结果的干扰，D合理。 高考演练 素能提升 2 3 1 4 1．（2023·湖北卷，4）用氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、四环素抗性基因(Tetr)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) 2 3 1 4 A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的 菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 答案：D 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可 能反向插入，转录的产物可能不同，A正确； 若 用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗 性基因(Tetr)，因此在含Tet（四环素）培养基中的 菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(Ampr)但四环素抗性基因(Tetr)被破坏，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 2 3 1 4 2．（2023·浙江6月卷，19）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-­GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 2 3 1 4 下列叙述正确的是(　　) A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-­GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 2 3 1 4 B 分析图甲可知，启动子在左侧，GFP基因整合到Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3­-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，不容易区分片段，D错误。 2 3 1 4 3.（2023·辽宁卷，8）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ） A. CD163基因中编码起始密码子的序列 B.CD163基因中编码终止密码子的序列 C.RFP基因中编码起始密码子的序列 D.RFP基因中编码终止密码子的序列 2 3 1 4 B 为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意。 4．（2023·江苏卷，22）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题。 2 3 1 4 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有　　　　　　　　　　　　　　　　，扩增程序中最主要的不同是　　　　。 2 3 1 4 模板（片段F1、片段F2）、引物 引物 (1)PCR反应进行的条件有引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。 2 3 1 4 (2)有关基因序列如图2。引物F2­-F、F1­-R应在下列选项中选用　　　　。 EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC－－－－－－－－－－－－GACGAGCTGTACAAG3′ AnBl基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG－－－－－－－－－－－－CCAAAACCACAACCA3′ 图2 A．ATGGTG－－－－－－CAACCA B．TGGTTG－－－－－－CACCAT C．GACGAG－－－－－－CTGCAG D．CTGCAG－－－－－－CTCGTC 2 3 1 4 CD 2 3 1 4 (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有　　　　　。 2 3 1 4 限制酶 (3)传统重组质粒的构建需要使用限制酶切割质粒，使其具有与目的基因相同的末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶。 2 3 1 4 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有　　　　。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 2 3 1 4 ABC (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误；培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，含有重组质粒的大肠杆菌才能形成菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 2 3 1 4 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1­-F和F2-­R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有　　　　　。 2 3 1 4 P3、P4 (5)EGFP为720 bp，AnBl为390 bp，二者的总大小为720＋390＝1 100 bp，用引物F1-­F和F2­-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 2 3 1 4 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是__________________________________________________ ________________________________________。 2 3 1 4 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 课堂落实——10分钟自纠自查 一、易错易混诊断 1．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。 (　　) 2．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。 (　　) 3．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(　　) × × × 4．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(　　) 5．基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。(　　) 6．基因表达载体中含有启动子和密码子。(　　) 7．抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。 (　　) √ × × √ 二、情境长句设问 高温胁迫会造成玉米果穗畸形生长，甚至出现空秆无穗，导致产量降低。研究人员获得了一个耐热相关ZmCIPKHT基因并转入玉米，培育出ZmCIPKHT基因过量表达的耐热玉米。 研究人员检测了野生型玉米(WT)和转ZmCIPKHT基因的玉米株系(OE-4、OE-6)中ZmCIPKHT基因的相对表达量，并对OE-4进行42 ℃高温胁迫处理，在处理0 h、0.5 h、3 h和6 h时分别取样检测ZmCIPKHT基因的表达量，结果如图所示。实验结果表明，ZmCIPKHT基因对高温胁迫具有响应，理由是_____________________________________________________________ ________________________。 转ZmCIPKHT基因植株OE­4经高温处理3 h内，ZmCIPKHT基因的相对表达水平明显升高 实验结果表明，在一定时间内，随着高温胁迫时间的延长，ZmCIPKHT基因的表达水平上升，即转ZmCIPKHT基因植株OE-­4经高温处理3 h内，ZmCIPKHT基因的相对表达水平明显升高，说明ZmCIPKHT基因对高温胁迫具有响应。 课时作业 巩固训练 90 2 3 5 1 4 一、单选题 1．如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是(　　) A．甲、乙、丙都属于黏性末端 B．甲、乙片段可形成重组DNA 分子，但甲、丙不能 C．DNA连接酶的作用位点在图乙中b处 D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子 14 15 13 C 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 由题图可知，甲、乙、丙都属于黏性末端，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，即图乙中a处，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 2．T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是(　　) A．T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性 B．T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变 C．ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键 D．T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下 14 15 13 C 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 T4 DNA连接酶有专一性，A错误；酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，结合题干信息“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连”可推测，ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；T4 DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 3．大肠杆菌的质粒­环状DNA是基因工程的常用载体结构，如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．①②③共同组成核糖核苷酸 B．质粒中的碱基遵循碱基互补 配对原则 C．DNA连接酶会使化学键④重新连接 D．若某种限制酶在质粒上只有一个酶切位点，则质粒被切为两个片段 14 15 13 B 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 ①②③共同组成DNA的基本单位——脱氧核苷酸，A错误；质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则，A与T配对，G与C配对，B正确；DNA连接酶使DNA片段重新连接，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键是磷酸基团与3号碳原子相连的化学键，图中的④不属于磷酸二酯键，C错误；限制酶识别特定序列并在特定位点切割，环状质粒上若只有一个限制酶切位点，则质粒被切割为1个完整的DNA链状片段，D错误。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 4．基因工程利用某目的基因（图甲）和P1噬菌体载体（图乙）构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是(　　) 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和 Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1 噬菌体载体 B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ 和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体 C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团 D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA 答案：D 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 由图甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 14 15 13 B 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 6．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是(　　) A．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 14 15 13 A 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，A正确；由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，说明四个基因转录时并不都以DNA的同一条单链为模板，B错误；卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误；由题意可知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 7．一种双链DNA分子被两种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记（如图左边一列）。关于该双链DNA，下列说法错误的是(　　) A．呈环状结构 B．分子质量大小为10 kb C．有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切割位点 D．NotⅠ切割位点与EcoRⅠ切割位点的 最短距离为2 kb 14 15 13 D 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 单用EcoRⅠ处理和利用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切时 产生的结果不同，说明DNA含有NotⅠ酶切位点， 因为用NotⅠ处理只产生了一个10 kb的条带，说 明该分子是环状的，且长度是10 kb，A、B正确； 单用EcoRⅠ处理后产生了4 kb和6 kb两个条带， 说明该环状DNA上含有2个EcoRⅠ切割位点，C 正确；用EcoRⅠ处理后产生的4 kb的片段，进一 步被NotⅠ酶切为3 kb和1 kb，可知NotⅠ切割位点与EcoRⅠ切割位点的最短距离为1 kb，最长距离为3 kb，D错误。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 8．如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述错误的是(　　) A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞 B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显 C．图1所示操作的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精 D．图2试管1的作用是证明2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色 14 15 13 D 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 选用植物细胞提取DNA时，需将 所选材料切碎，然后放入研钵中， 充分研磨破碎细胞，A正确；图2 所示实验的试管中溶液的液面高 于烧杯中的液面，可能导致加热 不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质，C正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴条件下DNA遇二苯胺试剂出现蓝色，而2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色，D错误。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 14 15 13 9．科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因（抗虫基因）导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析不正确的是(　　) A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因表达效率低 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 14 15 13 B．若经A项检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译 C．若经B项检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中 D．若经C项检测确定细胞中无抗虫基因，则可能只是载体DNA分子导入受体细胞 答案：D 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 由题干信息“鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株”可知，导入受体细胞的是重组DNA分子，D错误。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 二、多选题 10．TALEN是一种靶向基因操作技术，该技术利用了TAL靶向识别单元对靶向基因的识别作用和Fokl蛋白对靶向基因的切割作用，实现了对特定靶向基因的敲除。TAL靶向识别单元为间隔32个氨基酸的双连氨基酸（即两个相连的氨基酸）序列。不同的双连氨基酸分别与靶向基因中的A、T、C、G有恒定的对应关系，根据靶向基因的碱基序列可以设计出双连氨基酸序列。下列说法错误的是( 　　) A．该技术应该先推测出信使RNA序列，再推测出目的基因的核苷酸序列 B．在构建的基因表达载体中，启动子应位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位 C．TALEN是一种靶向基因操作技术，其中Fokl蛋白实质上是一种DNA酶 D．双连氨基酸能够与含氮碱基A、T、C、G之间发生碱基互补配对 14 15 13 CD 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 已知TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和Fokl蛋白的氨基酸序列，可先推测出信使RNA序列，再推测出目的基因的核苷酸序列，利用化学法以单个核苷酸为原料合成目的基因，再通过PCR技术进行扩增，A正确；在构建的基因表达载体中，有启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，B正确；TALEN是一种靶向基因操作技术，该技术利用了TAL靶向识别单元对靶向基因的识别作用和Fokl蛋白对靶向基因的切割作用，实现了对特定靶向基因的敲除，Fokl蛋白实质上是一种限制酶，C错误；只有含氮碱基之间能发生碱基互补配对，而双连氨基酸不含有含氮碱基，D错误。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 11．B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子(n)中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如图实验（Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，融合基因表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能）。下列相关叙述正确的是(　　) 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 A．由于DNA聚合酶不能合成导致B基因在水稻卵细胞中不能转录 B．过程①中T­DNA以双链形式整合到受体细胞的染色体DNA上 C．过程②转化筛选水稻愈伤组织时，需在培养基中加入潮霉素 D．可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光来鉴定B基因是否表达 答案：BCD 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 转录过程不需要DNA聚合酶， 需要RNA聚合酶，A错误；由 题图可知，过程①中T-DNA以 双链形式整合到受体细胞的染 色体DNA上，B正确；T-DNA 上含有潮霉素抗性基因，因此 过程②转化筛选水稻愈伤组织时，需在培养基中加入潮霉素，C正确；由于B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因，因此可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光来鉴定B基因是否表达，D正确。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 12．为研究拟南芥的AtCIPK基因对烟草抗旱能力的影响，科研人员将该基因转入烟草得到甲、乙、丙三个转基因品种，变量处理后的第7天检测AtCIPK基因和抗干旱基因NtLE5的表达量，结果如表所示。下列分析错误的是(　　) 14 15 13 烟草品种 AtCIPK基因 相对表达量 NtLE5基因的表达量 0天 7天 甲 5.31 1.01 1.81 乙 5.52 1.05 1.83 丙 7.05 1.26 3.08 丁 0 0.98 0.95 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 A．丁组与其他实验组在变量处理前都需要提供适宜光照和进行干旱处理 B．基因表达量的分析过程中不存在U—A碱基配对 C．除了检测基因的表达量外，还需进行个体水平的检测 D．AtCIPK基因的表达产物可能促进NtLE5基因的表达，从而提高植物对干旱的适应性 答案：AB 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 丁组与其他实验组在变量处理前都需要提供适宜的光照并浇水使其正常生长，变量处理时，实验组和对照组再停止浇水即进行干旱处理，A错误；检测基因表达量时先提纯RNA，用逆转录的方法得到DNA，定时定量分析特定基因的含量，用于反映转录的情况，此过程中存在U—A碱基配对，B错误；除了检测基因的表达量，实验还需比较转基因烟草植株与普通烟草植株的生长量，用于检测转基因烟草的抗旱能力，C正确；由图中的数据可以看出，AtCIPK基因的相对表达量与抗干旱基因NtLE5的表达量存在正相关关系，说明AtCIPK基因的表达产物可能促进NtLE5基因的表达，从而提高植物的抗旱能力，D正确。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 三、非选择题 13．枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中扩增得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (1)C1酶基因可利用PCR技术进行扩增，扩增时需要根据 　　　　　　　　设计引物，引物的作用是__________________________________________________。 14 15 13 　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (1)利用PCR技术进行扩增C1酶基因需要根据C1酶基因的脱氧核苷酸序列设计引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸。 C1酶基因的脱氧核苷酸序列 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (2)对扩增到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列相同，这是因为___________________________________________________。C1酶基因在　　　　　　酶的作用下可与质粒进行体外连接，C1酶基因能与质粒重组并在受体细胞中表达的遗传学基础是__________________________ _____________________________________________________。 14 15 13 由于密码子的简并，碱基改变后仍然编码同一种氨基酸 DNA连接 目的基因与质粒具有相同的组成单位和双螺旋结构，且不同生物所用密码子相同 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (2)由于密码子的简并，碱基改变后仍然能编码同一种氨基酸，故这两个基因虽然有两个碱基对不同，但可编码出氨基酸序列相同的蛋白质。C1酶基因在DNA连接酶的作用下可与质粒进行体外连接，由于基因与质粒具有相同的组成单位和双螺旋结构，且不同生物所用的密码子相同，故C1酶基因能与质粒重组并在受体细胞中表达。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (3)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，扩增C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是___________________________________。 14 15 13 BamHⅠ、SmaⅠ（顺序不能调换） 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (3)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，再结合质粒中启动子的方向可知，图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是BamHⅠ、SmaⅠ。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2接种　　　　　　　　　　　　　　　　。在相同条件下培养96小时，结果如图2，说明工程菌降解纤维素的能力最强。预期该工程菌在处理废弃物及保护环境方面可能的应用是_______________________________________（举一例）。 14 15 13 等量B菌或适量纤维素酶（C1酶） 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (4)分析题意及图2可知，对照组2应接种等量B菌或适量纤维素酶。工程菌具有很强的降解纤维素的能力，因此该工程菌在处理废弃物及保护环境方面可能的应用是降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 14．基因X的表达产物可保护损伤的神经细胞。科学家构建了含X的基因表达载体（图1），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请据此回答下列问题。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (1)构建含X的基因表达载体时，应选择图1中的　　　　限制酶。 14 15 13 BamHⅠ (1)根据题意和图1分析可知，基因X两边都有BamHⅠ限制酶识别序列，所以构建含基因X的表达载体时，需选择图1中的BamHⅠ限制酶进行酶切。 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (2)酶切后的载体和基因X进行连接，可产生3种连接产物：单个载体自连，基因X与载体正向连接、基因X与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种产物，选择EcoRⅠ酶和HindⅢ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图2中1、2、3泳道分别对应的载体的连接方式是　　　　　　、　　　　　　、 　　　　　　　。 14 15 13 载体自连　 反向连接　 正向连接 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (2)由分析可知，图2中1、2、3泳道分别对应的载体的连接方式是载体自连、反向连接、正向连接。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (3)在培养大鼠神经干细胞的过程中，可使用　　　　　　　　　　酶将细胞分散开。分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为　　　　　　。 14 15 13 胰蛋白酶或胶原蛋白 　细胞贴壁 (3)进行动物细胞培养时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将从动物体内取出的组织块分散成单个细胞。在适宜环境中培养，细胞悬液中的细胞很快贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (4)当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行　　　　　培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。 14 15 13 传代 (4)当培养的神经干细胞达到一定密度时产生接触抑制，换瓶后进行传代培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 15．普通番茄成熟后，细胞中的多聚半乳糖醛酸酶（简称PG）能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐储存。科研人员将抗PG基因导入番茄细胞，成功培育出了转基因番茄，能有效避免以上情况发生。如图表示抗PG基因的作用原理，请回答相关问题。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (1)据图可知，抗PG基因转录形成的RNA阻止了　　　　　　　　　过程，使细胞不能合成PG。据此判断，抗PG基因和PG基因的序列是　　　　　。 14 15 13 PG基因表达的翻译 相同的 (1)分析题图可知，抗PG基因转录形成的mRNA2与PG基因转录形成的mRNA1互补结合，导致PG基因表达的翻译过程受阻。抗PG基因和PG基因的mRNA能够互补配对，说明两个基因的序列相同。 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (2)科研人员获取抗PG基因，可从成熟番茄果实中获取____________________，通过逆转录最终得到PG基因。在PG基因和Ti质粒构建抗PG基因表达载体时，利用的酶是　　　　　　　　　　　，拼接过程中要注意的事项是　　　　　　　　　　　　　　。 14 15 13 PG基因转录的mRNA DNA连接酶和限制酶 将PG基因与Ti质粒反向拼接 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (2)获取抗PG基因可用成熟番茄细胞的PG基因的mRNA，通过逆转录获得PG基因。在构建抗PG基因表达载体时，需要将PG基因反向插入Ti质粒中，这个过程需要DNA连接酶和限制酶参与。 14 15 13 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (3)将构建好的基因表达载体导入农杆菌的过程，影响导入效率的因素，除了温度、溶液pH等环境因素外，还有　　　　　　　、 　　　　　　　、　　　　　　　。 14 15 13 农杆菌的种类 　农杆菌的浓度　 处理的时间 (3)将重组质粒导入微生物的方法是钙离子处理法，影响重组DNA导入农杆菌效率的因素，除了温度、溶液pH等环境因素外，还有农杆菌的种类、农杆菌的浓度、处理的时间等。 6 7 8 11 12 9 10 2 3 5 1 4 (4)利用转化的农杆菌侵染的番茄细胞，经脱分化得到　　　　　　，再分化形成胚状体，最终得到转基因番茄。 14 15 13 愈伤组织 (4)培养农杆菌转化的番茄细胞，脱分化形成愈伤组织，再分化产生胚状体后再萌发形成完整的转基因番茄。 6 7 8 9 11 12 10 $$