48 选择性必修3 专题十九 第2讲 基因工程的步骤、应用及其安全性问题-【名师导航】2025年高考生物一轮总复习讲义（浙科版）

课时分层作业(四十八)　基因工程的步骤、应用及其安全性问题 1．(2024·浙江1月选考)关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是(　　) A．试管动物的培育 B．转基因食品的生产 C．治疗性克隆的研究 D．生物武器的发展和生产 2．转基因产品是指利用基因工程技术获得的生物制品，其安全性问题一直是大众关注和争论的热点。下列叙述错误的是(　　) A．通过转基因育种可增加或消除原有生物品种的某些性状 B．转基因食品风险评估时还需考虑标记基因的安全性问题 C．严格选择种植区域可减少转基因作物发生外源基因扩散的可能性 D．转基因作物的长期、大规模种植不利于侵染力更强的害虫的出现 3．纤维素酶广泛应用于医药、食品发酵、造纸、废水处理等领域。研究人员利用蛋白质工程将细菌纤维素酶的第137、179、194位相应氨基酸替换为赖氨酸后，纤维素酶热稳定性得到了提高。下列有关该技术，说法错误的是(　　) A．经改造后的纤维素酶热稳定性提高，这一性状可遗传 B．对纤维素酶的改造是通过直接改造mRNA实现的 C．改造纤维素酶也需要构建基因表达载体 D．改造后的纤维素酶和原纤维素酶不是同一种酶 4．科学家培育了一种可以生产人血红蛋白的转基因烟草。下列叙述正确的是(　　) A．要获得该转基因烟草，首先要从人的成熟红细胞内获取目的基因 B．人血红蛋白基因导入烟草细胞可采用农杆菌转化法 C．PCR不能用于鉴定受体细胞中是否转入了目的基因 D．该基因转到烟草染色体上使烟草发生染色体畸变 5．科学家将苏云金芽孢杆菌中的Bt毒蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗病性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析错误的是(　　) A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原-抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt毒蛋白质，则可能是抗虫基因表达效率低 B．若经A检测确定细胞中无Bt毒蛋白，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的RNA，若测到Bt毒蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译 C．若经B检测确定细胞中无Bt毒蛋白的mRNA，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中 D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能只是载体DNA分子导入受体细胞 6．某转基因植物培育过程如下图所示。 下列叙述错误的是(　　) A．重组Ti质粒的浓度和质量会影响其导入农杆菌的效率 B．与机械法相比，酶解法获得单细胞的效率更高 C．农杆菌的浓度和状态会影响目的基因导入植物细胞的效率 D．前置筛选和后置筛选所依据的指标是相同的 7．(2023·江苏扬州三模)科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L－PG)，可获得乳酸乙酯(白酒香味的主要来源)高产菌株，过程如图。下列分析不合理的是(　　) A．转入的L－PG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性 B．L－PG基因替换质粒上的PD基因是通过同源重组实现的 C．标记基因ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株 D．可以利用PCR技术筛选含有L－PG基因的受体细胞 8．(2021·山东等级考)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 (1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是____________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要__________种酶。 (2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是________________ ____________________________________________________________________。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于________，理由是_________________________ ____________________________________________________________________。 9．(2023·浙江6月选考)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于________。根据这种调节方式，在培养基中添加________________，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为 ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通过检索________获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生__________，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为________。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了________重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至________，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以________为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行________处理，以去除DNA污染，再经反转录形成cDNA，并以此为________，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？_____________________________________________ ____________________________________________________________________。 1 / 1 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第2讲　基因工程的步骤、应用及其安全性问题 一、基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性 (一)目的基因的筛选与获取 1．目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 2．目的基因的获取：如果目的基因的序列是已知的，可以用__________合成目的基因，或者通过______(聚合酶链式反应)体外扩增获取目的基因；如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以建立一个包含目的基因在内的________，再从中获取目的基因。 (1)人工合成 人 工 合 成 方法 具体操作 化学 方法 已知核苷酸序列的________，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板 逆转 录法 以mRNA为模板，在________作用下人工合成 PCR 技术 扩增 ①原理：__________ ②条件：模板DNA、____、四种dNTP、_____________ (2)从基因文库中获取目的基因 ①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 ②基因文库的种类：______文库：包含一种生物所有的基因；________文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。 ③cDNA文库与基因组文库的区别 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因数量 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 适用的范围 适合从____基因组中获取目的基因 适合从____基因组中获取目的基因 ④从基因文库中获取目的基因的方法 一是运用________________，从基因文库中提取目的基因。根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之____的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为____。基因文库中变性的DNA片段，如果有一个DNA片段能和探针片段互补结合成杂交链，这一片段即含有所需的目的基因。 二是运用__________杂交技术，从基因文库中提取目的基因。目的基因表达的产物作为抗原，生产出相应的抗体，将该抗体作为__________，诱导基因文库中的所有基因表达，利用抗原-抗体杂交技术，筛选出含目的基因的细胞，从中获取目的基因。 (二)构建基因表达载体 1．基因表达载体的构建是基因工程的____。通常是用____限制性内切核酸酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体，然后用____________将它们连接起来，可完成体外重组，形成重组DNA分子。基因表达载体的构建过程如下图： 2．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中____存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够____。 3．基因表达载体的组成及其作用 基因表达载体模式图 (1)目的基因：人们所需要的外源DNA分子中有遗传效应的片段。 (2)复制起点：一段有特殊序列的DNA片段，是DNA____的起始点。 (3)启动子：位于基因的上游，是一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶____和____的部位，能驱动基因的转录。 (4)终止子：位于基因的下游，一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录的______。 (5)标记基因：为了____或____受体细胞中是否含有目的基因，可将含有目的基因细胞筛选或鉴别出来。 1．通常情况下，使用同一种限制性内切核酸酶处理目的基因和载体，容易导致目的基因在载体中的反向连接或者使分子量较大的目的基因发生自我环化。为解决这一问题，该如何改进操作技术？ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (三)将目的基因导入受体细胞 1．转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持____和____的过程，称为转化。 2．常用的受体细胞：________、枯草杆菌、______、______和动植物细胞。 3．将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和载体的类型不同，所采用的导入方法也不同，见下表： 细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 Ca2+诱导法(CaCl2) 受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 常用原核细胞 转化过程 80%的转基因植物都是通过农杆菌转化法，将重组Ti质粒导入农杆菌，筛选出含目的基因的农杆菌，让转化的农杆菌去感染植物细胞(植物的受伤部位)，携带有目的基因的__________进入植物细胞，将目的基因整合到植物细胞中的____________上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达 单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。操作过程：将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头；然后滴加DNA(含目的基因)至花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→将注射了目的基因的受精卵经早期胚胎培养后移入母体子宫或输卵管→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞，将重组表达载体与______细胞混合→感受态细胞吸收外源DNA分子 (四)检测目的基因及其表达产物 1．检测目的：目的基因导入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，通过____与____才能知道。 2．检测对象 (1)检测目的基因是否____受体细胞。 (2)检测目的基因是否转录出了________。 (3)检测目的基因是否翻译成______或生物体是否出现相应的____。 3．检测方法 类型 检测方法 方法 结果显示 检测 目的 基因 是否 导入 检测标记基因控制的性状是否出现 一是根据________(如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因)所控制的性状是否出现进行检测 如果在含有某种抗生素的培养基中能存活的细胞(或者出现标记基因所控制的性状)，表明细胞中含有重组DNA __________ 设计好目的基因的____________，利用PCR技术，对受体细胞中待测DNA进行扩增 如果能扩增出相应的基因片段，说明待测DNA中含有目的基因，即已导入受体细胞 核酸(DNA)分子杂交技术 从转基因生物中提取DNA，用标记的目的基因作____，进行DNA分子杂交 如果显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA上 核酸(RNA)分子杂交技术 从转基因生物中提取________，用标记的目的基因作____，进行分子杂交(DNA和mRNA之间杂交) 如果显示出杂交带，表明转录成功 抗原-抗体杂交技术 从转基因生物中提取蛋白质作为抗原，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交 如有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品 目的基因控制的性状是否出现 如抗虫基因(Bt基因)被导入棉花细胞后，棉铃虫食用棉叶后看是否很快死亡 如抗虫基因(Bt基因)被导入棉花细胞后，如果棉铃虫食用棉叶后很快死亡，则目的基因表达成功 二、基因工程及其延伸技术应用广泛 1．基因工程在医药卫生领域的应用 基因 核酸分子杂交和PCR技术常用来检测患者自身携带的缺陷基因。如检测引起____________的基因突变 诊断 灵敏度极高的PCR技术常用于诊断患者是否______________。如根据凝胶电泳结果就可以判断患者是否携带HIV 基因治疗 常以修饰过的病毒为____(如腺病毒和逆转录病毒)，将正常基因导入有________的细胞中，以____或____基因的缺陷，从而达到治疗的目的。如重症免疫缺陷病的基因治疗 转基因 动物可 为研究 疾病机 理提供 模型 可以获得基因、改造基因，还可以“敲除”某些基因。通过在基因中插入__________使该基因永久____，再通过观察转基因生物性状变化，可以推测该基因的功能。如____肠碱性磷酸酶基因的小鼠更容易发胖，从而推测该基因有“保持身材”的作用 法医鉴定 利用__________，进行法医鉴定，能保护受害者权益 生产基 因工程药物 利用转基因微生物 利用大肠杆菌或酵母菌生产干扰素 利用转基因动物 将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组在一起，培育转基因克隆动物作为______________，生产医用蛋白，如人白细胞介素-2等 利用转基植物 利用转基因植物生产药物蛋白，如血红蛋白、小儿麻痹症疫苗等 2．基因工程在农牧业方面的应用 转基因生物 目的基因 优点 转基因抗虫植物 Bt毒蛋白基因 减少虫害、减少农药污染 转基因抗病植物 某些病毒、真菌等的抗病基因 减少病害、减少农药污染 转基因抗除草剂植物 降解或抵抗某种除草剂的基因(如抗草甘膦基因) 抗除草剂、提高农田管理效率 改良植物的品质 必需氨基酸多的蛋白质编码基因；植物花青素代谢有关的基因 提高玉米的营养价值、改良花卉 提高动物的生长速度 外源生长激素基因 提高鲤鱼的生长速率 改善畜产品的品质 乳糖酶基因 使转基因奶牛的乳汁中减少乳糖含量，以利于乳糖不耐受的人食用牛奶 三、蛋白质工程是基因工程的延伸 1．基因工程的局限：目的基因的表达结果有时并不理想，合成的蛋白质不能很好地行使功能。 2．蛋白质工程：是指以蛋白质分子的________及其与________的关系作为基础，通过__________基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上延伸出来的，是涉及多学科的综合科技工程。 3．蛋白质工程的思路 蛋白质工程是通过__________编码蛋白质的基因获得特定功能的蛋白质。 四、生物技术的安全与伦理 (一)转基因产品的安全性引发社会的广泛关注 1．关于转基因食品的安全性 (1)担心转入的________或________是否对人畜有毒。 (2)担心转入了控制______基因的植物产品是否会对过敏人群造成不利影响。 2．转基因作物的环境安全性 (1)由于导入新的外源基因，转基因作物获得或增强了________和________，使其在很多方面都强于亲本或野生种。若被推广种植，可能会影响________。 (2)在自然条件下，栽培作物种内、栽培作物与其近缘野生种间、栽培作物和杂草之间都有可能发生________。 2．如何防止发生基因漂移？ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3．科学的______________，控制转基因生物可能带来的负面影响，我国对生物安全问题始终给予密切关注和高度重视，并陆续出台了一些政策、法规。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (二)我国禁止生殖性克隆人 1．治疗性克隆和生殖性克隆的比较 项目 治疗性克隆 生殖性克隆 不 同 点 概念 是指利用克隆技术产生特定细胞或组织(上皮组织、神经组织或肌肉组织等)和器官，用于治疗性移植的克隆性技术 指利用克隆技术获得胚胎，并将胚胎孕育成为人类个体的克隆性技术 目的 ____________ __________ 操作 水平 细胞、组织、器官水平 个体水平 相同点 都属于无性生殖，产生新个体或新细胞、组织和器官，遗传信息相同 人体克 隆流程 图 2．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 2005年联合国大会法律委员会以决议的形式通过一项政治宣言《联合国关于人的克隆宣言》，要求各国____有违人类尊严的任何形式的克隆人。我国政府坚持____生殖性克隆，______________________________任何生殖性克隆人实验，____治疗性克隆的立场。原因如下： (1)现实问题：①人类对动物的克隆技术还未____，成功率还很__。②克隆的动物在遗传上是________，一种特定病毒或其他病原体的感染，可能带来严重灾难。 (2)生殖性克隆人面临诸多________。 3．比较试管婴儿和设计试管婴儿 项目 试管婴儿 设计试管婴儿 不同点 操作 过程 包括a、b、c过程(见流程图) 包括a、b、c、d过程(见流程图) 技术 手段 不需进行________ 胚胎移植前需进行遗传诊断 实践 应用 解决________问题 用于______________等疾病的治疗 相同点 二者都是体外受精，经体外____________，再进行________，在生殖方式上都为有性生殖 流程图 一、筛选出含有目的基因的受体细胞流程图 　(2023·浙江湖州中学模拟测试)组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图1是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(示部分基因及部分限制性内切核酸酶作用位点)，据图1分析回答下列问题。 图1 图2 (1)人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的是：第一，去除质粒上的____________(基因)，保证T-DNA(T-DNA片段能转入整合到植物的基因组中)进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于 ____________________________________________________________________。第三，使质粒大小合适，有利于_________________________________________。 (2)若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒，接下来是_______________________________________________ 的过程，为了促进该过程，应该用________处理土壤农杆菌。 (3)重组Ti质粒导入土壤农杆菌后，将其接种到含卡那霉素的培养基C上培养(如图2)，目的是筛选______________________，能在C中生长的土壤农杆菌有________种。用无菌牙签挑取C上的单个菌落，分别接种到D(含四环素和卡那霉素)和E(含卡那霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如上图2所示。含目的基因的菌落位于________(填“D”或“E”)上，请在D或E中相应的位置上圈出来。 [答案]　(1)tms和tmr　目的基因(或外源DNA)准确插入　提高转化效率　(2)将重组质粒(目的基因)导入土壤农杆菌　CaCl2溶液　(3)含卡那霉素抗性基因的土壤农杆菌　2　E 二、乳腺生物反应器与工程菌的比较 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 含义 让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的微生物 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因 导入方式 显微注射法 Ca2+诱导法 生产条件 不需要严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需要严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 　(2023·北京东城高三期末统考)人凝血酶Ⅲ是一种分泌蛋白，可预防和治疗急慢性血栓。重组人凝血酶Ⅲ是世界上首个上市的动物乳腺生物反应器生产的重组蛋白药物。下列相关叙述错误的是(　　) A．可从人细胞中提取RNA后利用逆转录PCR技术获取目的基因 B．目的基因的上游需连接在乳腺细胞中特异表达基因的启动子 C．用显微注射法将表达载体导入乳腺细胞来获得转基因动物 D．若用大肠杆菌作为受体细胞难以获得活性高的人凝血酶Ⅲ [解析]　可从人细胞中提取RNA后利用逆转录PCR技术获取目的基因，此时获得的目的基因没有启动子、终止子等，A正确；动物乳腺生物反应器需要使目的基因在乳腺细胞表达，目的基因的上游需连接在乳腺细胞中特异表达基因的启动子，B正确；动物受精卵全能性最高，用显微注射法将表达载体导入受精卵来获得转基因动物，在乳腺细胞表达特定的基因是启动子的作用，并非将目的基因导入乳腺细胞，C错误；大肠杆菌是原核生物，不具有加工分泌蛋白的内质网和高尔基体，若用大肠杆菌作为受体细胞难以获得活性高的人凝血酶Ⅲ，D正确。 [答案]　C 三、蛋白质工程与基因工程的区别和联系 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 　(2022·湖南选择性考试)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题： (1)蛋白质工程流程如图1所示，物质a是________________________________， 物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________________________________________。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有__________________________、____________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是_________________________________。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图2所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的____________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是 ____________________________________________________________________。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：____________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________。 [答案]　(1)氨基酸序列　mRNA　密码子的简并性　(2)从基因文库中获取目的基因　通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成　DNA双链复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏　(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间 　(2022·浙江6月选考)回答与植物转基因和植物克隆有关的问题： (1)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制________________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度________________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的_______________________________________________检测。 (2)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的________________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内_________________________________________________ 形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的________________，分析染色体组型是否改变进行判断。 (3)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和________________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为________________时全能性表达能力最高。 [答案]　(1)农杆菌　过低　敏感性　(2)再生　细胞核　形态特征和数量　(3)培养时间　受精卵 　围绕基因工程的基本操作程序，考查科学思维素养 1．(2023·湖北选择性考试)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 2．(2023·温州高三适应性考试)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。 图1 图2 注：XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ为不同限制酶的识别位点；LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；ampr基因为氨苄青霉素抗性基因。 回答下列问题： (1)获取目的基因 提取枣树细胞的__________，经逆转录获得cDNA；为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT基因时应选择的引物组合是________________，并在其____________(填“5′”或“3′”)末端分别添加限制酶______________的识别序列。 (2)构建重组DNA分子 ①启动子是____________识别并结合的部位；基因工程中构建用于原核生物的表达载体时，常用的启动子不包括以下哪一项？__________(A.噬菌体基因启动子　B．乳酸菌基因启动子　C．大肠杆菌基因启动子　D．枣树MT基因启动子)。 ②影响DNA连接反应的主要因素除pH与温度等操作环境、反应时间、DNA连接酶的种类及浓度外，还有_________________________(答出1项即可)等。 (3)导入、筛选和鉴定MT工程菌 ①将得到的混合物导入用____________处理的大肠杆菌完成____________实验。 ②将菌液稀释并涂布在含X-gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后，随机挑取________的单菌落可获得MT工程菌。 ③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与______________分别接种至含____________的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 (4)扩大菌种将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对__________(填“菌体”或“菌落”)进行直接计数，以评估增殖情况。发酵结束后，采用___________________________(答出1项即可)等方法获得所需的发酵产品。 　围绕基因工程的应用，考查社会责任素养 3．基因治疗可用于治疗A型地中海贫血，具体过程是将有功能的珠蛋白基因插入被采集的患者血液干细胞DNA中，再通过化疗去除患者体内原有的造血干细胞，将改造后的造血干细胞注入患者体内，最终可以在患者体内增殖并表达出正常的珠蛋白。下列有关叙述错误的是(　　) A．基因治疗的原理属于基因重组 B．珠蛋白基因插入DNA的过程中需要解旋酶 C．珠蛋白基因在表达的过程中遵循中心法则 D．导入的珠蛋白基因不能遗传给下一代 4．(2024·浙江1月选考)小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其他表型正常。(注：野生型基因用＋＋表示；f杂合子基因型用＋f表示。)回答以下问题： (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生________，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了________而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行________和________。 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第_______泳道和第_______泳道。 (3)g小鼠是长毛隐性突变体(gg)，表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是________________，则g和f是非等位基因；若杂交结果是____________________，则g和f是等位基因。(注：不考虑交叉互换；野生型基因用＋＋表示；g杂合子基因型用＋g表示。) (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型(＋＋)、g杂合子(＋g)和g小鼠(gg)的mRNA，反转录为cDNA后用(2)小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是__________________ ____________________________________________________________________。 组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用为 ____________________________________________________________________。 　围绕蛋白质工程的原理和应用，考查科学探究素养和社会责任素养 5．(2023·广东广州联考模拟)蛋白质的空间结构是生命科学研究领域的热点内容。某科研团队利用人工智能AI开发的AlphaFold2程序对大部分蛋白质结构的预测极为精准。下列叙述错误的是(　　) A．依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列 B．蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础 C．预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程 D．结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制 6．(2021·辽宁选择性考试)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　) A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境 7．胰岛素可用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，有关叙述错误的是(　　) A．新的胰岛素的预期功能是构建新胰岛素模型的主要依据 B．新的胰岛素生产过程中不涉及中心法则 C．若用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2+处理大肠杆菌 D．新的胰岛素功能的发挥必须依赖于蛋白质正确的高级结构 　围绕生物技术的安全性与伦理问题，考查社会责任素养 8．(2021·北京等级考)社会上流传着一些与生物有关的说法，有些有一定的科学依据，有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是(　　) A．长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素 B．转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒 C．消毒液能杀菌，可用来清除人体内新冠病毒 D．如果孩子的血型和父母都不一样，肯定不是亲生的 9．(2023·湖州、衢州、丽水三地市高三教学质量检测)生物技术的安全与伦理问题是社会关注的热点。下列叙述错误的是(　　) A．克隆人的出现会增加社会不稳定因素 B．转基因作物可能对生物多样性造成严重影响 C．生殖性克隆不会产生伦理、道德和法律等方面的问题 D．生物武器会对人类造成严重威胁和伤害 【精读课本】 自主诊断 一、（一）2.化学合成法　PCR　基因文库　(1)较小基因 逆转录酶　半保留复制　引物　耐高温的Taq DNA聚合酶　引物　耐高温的Taq DNA聚合酶　(2)基因组　部分基因　简单　复杂　核酸分子杂交技术　互补　探针　抗原-抗体　特异性探针 （二）1.核心　同种　DNA连接酶　2.稳定　表达　3.(2)复制　(3)识别　结合　(4)结束点　(5)筛选　鉴别 （三）1.稳定　表达　2.大肠杆菌　农杆菌　酵母菌　3.T-DNA　染色体DNA　感受态 （四）1.检测　鉴定　2.(1)导入　(2)mRNA　(3)蛋白质　性状　3.标记基因　PCR技术　特异性引物对　探针　mRNA　探针 二、1.镰刀形贫血症　感染某种病原体　载体　基因缺陷　纠正　补偿　DNA片段　失活　敲除　DNA指纹　乳腺生物反应器 三、2.结构规律　生物功能　改造或合成　3.设计和改造 四、（一）1.(1)外源基因　基因产物　(2)过敏源　2.(1)生存竞争　繁殖能力　生态平衡　(2)基因漂移 （二）1.治疗人类疾病　繁殖新个体　2.禁止　反对　不赞成、不允许、不支持、不接受　支持　(1)成熟　低　完全相同　(2)伦理问题　3.遗传诊断　不孕不育　白血病、贫血症　早期胚胎发育　胚胎移植 1 / 1 学科网（北京）股份有限公司 第2讲　基因工程的步骤、应用及其安全性问题 精读课本·盘点基础知识 问题与思考 1．提示：使用两种不同的限制性内切核酸酶同时切割目的基因与载体，再用DNA连接酶催化连接。 2．提示：(1)可以借助一定的手段使花粉失去活性，从而防止发生基因漂移。(2)将目的基因转入叶绿体或线粒体DNA中，因为在受精时，叶绿体与线粒体不会随花粉被扩散出去，所以可以防止基因污染。 3．提示：检测和管理 延伸迁移·实现融会贯通 1．D　[若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。] 2．(1)mRNA　引物Ⅱ和引物Ⅲ　5′　KpnⅠ和XhoⅠ　(2)①RNA聚合酶　D　②酶浓度、载体浓度、目的基因浓度、载体和目的基因的比例　(3)①Ca2+　导入(或转化)　②白色　③普通大肠杆菌　(一定浓度的重金属)镉　(4)菌体　过滤、沉淀、离心、静置(答出1项即可) 3．B　[基因治疗过程中将有功能的珠蛋白基因插入被采集的患者血液干细胞DNA中，其原理属于基因重组，A正确；珠蛋白基因插入DNA的过程中需要限制性内切核酸酶，不需要解旋酶，B错误；珠蛋白基因的表达包含转录和翻译，遵循中心法则，C正确；导入的珠蛋白基因在体细胞中，不能遗传给下一代，D正确。] 4．(1)编码序列错位　氨基酸序列　替换　缺失(位置可换)　(2)3　2　(3)子代全部为野生型　野生型∶突变型＝1∶1 (4)基因突变丢失了启动子，导致无法转录mRNA；反转录没有产物，检测不出结果　抑制毛发生长 5．A　[由于一种氨基酸可能有多种密码子，因此新蛋白质的氨基酸序列推出的基因序列不止一种，A错误；氨基酸脱水缩合形成多肽，多肽盘曲折叠形成具有一定空间结构的蛋白质，因此蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础，B正确；蛋白质工程能通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，因此预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程，C正确；人工智能程序AlphaFold2对大部分蛋白质结构的预测极为精准，接近真实的蛋白质结构，因此结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制，D正确。] 6．D　[在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。] 7．B　[新的胰岛素生产过程中涉及中心法则，B错误；若要利用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2+处理法提高导入的成功率，C正确；根据结构与功能相适应的原理分析，新的胰岛素功能的发挥必须依赖于蛋白质正确的高级结构，D正确。] 8．A　[维生素会受到高温破坏，加热、光照、长时间储存等都会造成维生素的流失和分解，A正确；转基因抗虫棉对非靶标生物无毒性，B错误；消毒液只能杀死表面的病毒细菌，但无法清除体内的病毒，C错误；如果孩子的血型和父母都不一样，也可能是亲生的，如A型血和B型血的父母也可以生出O型血的孩子，D错误。] 9．C　[人具有不可重复的特性，克隆人违背了伦理学的平等原则，同时，在法律方面，克隆人使遗产继承、法律地位都很难处理，将会增加社会的不稳定因素，A正确；很多转基因作物具有较强的生存能力或抗逆性，这样的作物一旦进入环境中，将会取代原来的作物，造成物种灭绝，故转基因作物可能对生物多样性造成严重影响，B正确；生殖性克隆会产生伦理、道德和法律等方面的问题，C错误；生物武器具有传染性、危害时间久、不易被发现和鉴定等特点，所以生物武器会对人类造成严重威胁和伤害，D正确。] $$ 课时分层作业(四十八) 1．D　[试管动物的培育可用于培育优良动物、用于解决不孕不育等问题，不属于我国明令禁止的项目，A不符合题意；转基因食品的生产虽然具有一定的争议，但不属于我国明令禁止的项目，B不符合题意；治疗性克隆可用于疾病的治疗，不属于我国明令禁止的项目，C不符合题意；生物武器危害性大，为了国家安全，应在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散，D符合题意。] 2．D　[基因工程是指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术；转基因产品是指利用基因工程技术而获得的生物制品，故通过转基因育种，按照人们的需要，可增加或消除原有生物品种的某些性状，A正确。在基因表达载体上，除了有目的基因、启动子、终止子等外，还需要标记基因，故转基因食品风险评估时还需考虑标记基因的安全性问题，B正确。转基因作物所携带的外源基因在使得作物高产的同时，也可能会向自然界扩散，从而打破自然界原有的物种平衡，严格选择种植区域可减少转基因作物发生外源基因扩散的可能性，C正确。转基因作物的长期、大规模种植，可能使目标害虫或非目标害虫对转基因作物的适应在群体水平上产生抗性，有可能产生侵染力更强的“超级害虫”，造成更大的危害，D错误。] 3．B　[蛋白质工程是对基因进行修饰改造或重新合成，然后进行表达，改造后的蛋白质的性状能遗传给子代，A正确；对纤维素酶的改造需要以基因工程为基础，是通过修改基因或创造合成新基因来实现的，B错误；蛋白质工程是对基因进行修饰改造或重新合成，然后进行表达，需要构建基因表达载体，C正确；改造后的纤维素酶和原纤维素酶不是同一种酶，D正确。] 4．B　[人的成熟红细胞内没有细胞核和细胞器，因此不含基因，A错误；为使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，再采用农杆菌转化法使目的基因整合到烟草细胞中的染色体DNA上，B正确；筛选鉴定时，通过PCR技术可以检测目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上，也可以检测目的基因是否转录出了mRNA，C错误；该基因转到烟草染色体上，使控制不同性状的基因重新组合，属于基因重组，D错误。] 5．D　[抗原与抗体能特异性结合，可提取细胞中的蛋白质，采用抗原-抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt毒蛋白，说明抗虫基因能表达，但棉花植株并无抗病性状，则可能是抗虫基因表达效率低，合成的Bt毒蛋白太少，A正确；核酸分子杂交技术的原理是碱基互补配对，检测细胞中的RNA，若测到Bt毒蛋白的mRNA，说明抗虫基因能转录，但细胞中无Bt毒蛋白，说明抗虫基因不能正常翻译，导致棉花植株并无抗病性状，B正确；核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，而抗虫基因又不能表达，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中，C正确；由题干信息可知，“鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株”，D错误。] 6．D　[重组Ti质粒的浓度、质量和农杆菌的浓度都会影响其导入农杆菌的效率，A正确；与机械法相比，酶解法的优点是不会伤害原生质体，获得的原生质体数量多，获得单细胞的效率更高，B正确；农杆菌的浓度较高、状态好，会提高基因导入植物细胞的效率，C正确；前置筛选是分子水平检测，以便确定目的基因是否导入受体细胞，后置筛选是看植株是否有相对应的性状，D错误。] 7．C　[目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L－PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A合理；由图可知，通过基因工程技术实现酵母菌的PD基因被替换为L－PG基因，基因工程的实质是基因重组，B合理；标记基因ampr可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C不合理；PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L－PG基因的受体细胞，D合理。] 8．(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 9．(1)负反馈调节　过量赖氨酸类似物　(2)①基因数据库　②融合　③核受体细胞　激活　④囊胚　⑤转基因的BEF　DNA酶　PCR的模板　构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达 1 / 1 学科网（北京）股份有限公司 $$