67 选择性必修3 第九单元 第51讲 基因工程的基本工具和基本操作程序-【名师导航】2025年高考生物一轮总复习讲义（江苏专用）

课时分层作业(五十一)　基因工程的基本工具和基本操作程序 1．(2021·江苏南通如皋中学校考开学考试)下列有关酶的叙述，正确的是(　　) A．DNA连接酶以DNA的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸连接起来 B．限制性内切核酸酶识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子 C．DNA聚合酶可将两个DNA分子片段间的缝隙从5′到3′端连接起来 D．逆转录酶是以RNA为模板指导核糖核苷酸连接合成DNA的酶 2．(2023·江苏宿迁高二统考期中)野生型的λ噬菌体具有DNA分子量大、限制酶切割位点过多等特点，但经人工改造后可作为载体将目的基因导入大肠杆菌。下列相关说法正确的是(　　) A．改造λ噬菌体时，需除去其全部的限制酶切割位点 B．转化前必须用Ca2＋将大肠杆菌处理成能吸收外源DNA的生理状态 C．λ噬菌体载体可自我复制并含有标记基因 D．人工改造λ噬菌体是获取转基因大肠杆菌的核心工作 3．(2023·江苏淮安高二校考阶段练习)载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述错误的是(　　) A．重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体 B．载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因 C．与重组载体A比较，重组载体B需要有起始密码子和终止密码子序列 D．培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上存在明显差异 4．(2023·江苏扬州高三统考阶段练习)某实验小组进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，如下为实验流程：取材→破碎细胞→获得滤液→去除杂质→进一步提纯→DNA鉴定，相关叙述正确的是(　　) A．取材时可选用猪血、洋葱、香蕉、菜花等富含DNA的材料进行实验 B．在液体培养液中培养的大肠杆菌也可作为实验材料 C．提纯时在滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液后会出现白色丝状物DNA D．DNA鉴定时可通过是否加入二苯胺试剂设置对照实验来观察实验现象 5．(2023·江苏扬州中学高三月考)DNA琼脂糖凝胶电泳是一种分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的技术。下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙述，正确的是(　　) A．mRNA也是核酸，因此可直接用PCR扩增仪扩增 B．PCR反应缓冲液中一般要添加ATP，以激活耐高温的DNA聚合酶 C．带电量相同的情况下，相对分子质量比较大的DNA片段距离加样孔越近 D．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来 6．(2023·江苏南通如皋中学校考阶段练习)人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，改造后的t-PA蛋白能显著降低出血副作用。下图表示构建含t-PA改良基因重组质粒的过程示意图。相关说法错误的是(　　) A．构建重组质粒时，选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ B．需要DNA聚合酶将t-PA改良基因与质粒连接 C．新霉素抗性基因的作用是便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来 D．在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株 7．(多选)(2023·江苏南京师范大学附属中学江宁分校校考期中)研究人员用图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。以下叙述正确的是(　　) A．构建重组质粒的过程应选用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶 B．使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组 C．能在添加四环素的培养基上生存一定是含有重组质粒的大肠杆菌 D．利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙 8．(多选)(2023·江苏扬州统考三模)科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG)，可获得乳酸乙酯(白酒香味的主要来源)高产菌株，过程如图。下列分析合理的是(　　) A．转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性 B．L-PG基因替换质粒上的PD基因是通过同源重组实现的 C．标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株 D．可以利用PCR技术筛选含有L-PG基因的受体细胞 9．(2023·江苏南通高三统考期中)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠，下图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。请回答下列问题。 (1)质粒上ori序列的碱基特点是________比值较高，图示胰岛素基因的转录以________链作为模板。 (2)在设计PCR引物时最好在引物的________端添加限制酶________的识别序列，PCR反应体系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要________(离子)的激活。 (3)生产过程中目的基因是利用胰岛B细胞中的mRNA反转录得到的胰岛素基因，不直接使用细胞中酶切获得的胰岛素基因原因是_______________________ _____________________________________________________________________。 (4)科学家运用大引物PCR定点突变技术对胰岛素第28位氨基酸实现了替换，获得了速效胰岛素类似物产品。相关原理如图所示。 ①第一次PCR至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板，第二次PCR应选用大引物两条链中的________(填“A”或“B”)，若第二次PCR计划循环n次，至少需要大引物________个。 ②β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了________________的培养基上，若观察到菌落呈现白色，则表明________________________。 2 / 4 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第51讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 　1．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。　2．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。　3．实验：DNA的提取和鉴定。　4．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 考点1　重组DNA技术的基本工具 一、基因工程的概念 二、重组DNA技术的基本工具 1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 1．(人教选择性必修3 P71“旁栏思考”)存在于原核生物中的限制酶的作用是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 2．(人教选择性必修3 P71“正文”)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 2．DNA连接酶 3．载体 3．(人教选择性必修3 P72“旁栏思考”)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于_____________________________________________________ _____________________________________________________________________。 4．(人教选择性必修3 P73“正文”)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是______________________ _____________________________________________________________________。 1．基因工程的理论基础 2．限制酶的选择原则 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，防止破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会破坏标记基因)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 (3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 1．基因工程的原理是基因重组，此种变异是定向的。 (　　) 2．重组DNA技术的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 (　　) 3．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 (　　) 4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 (　　) 5．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (　　) 1．限制性内切核酸酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。 2．CRISPR—Cas9基因组编辑系统由向导RNA(也叫SgRNA)和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA，Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，原理如图所示。 CRISPR－Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，脱靶最可能的原因是_______________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 　基因工程工具酶的应用 1．(2023·江苏淮安高三统考阶段练习)基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是(　　) A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可以通过E.coli DNA连接酶相互连接 B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C．限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断两个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端 D．若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接 　基因工程载体的应用 2．(2023·湖北选择性考试)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 考点2　基因工程的基本操作程序 一、目的基因的筛选与获取 1．筛选合适的目的基因 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变____________或获得____________等的基因。主要是指__________的基因。 (2)筛选目的基因的方法：从相关的已知__________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 2．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理：DNA半保留复制。 (2)条件：DNA模板、2种引物、____________________和4种脱氧核苷酸。 (3)PCR反应过程 (4)PCR产物的鉴定：常采用______________来鉴定。 1．(人教选择性必修3 P78“图3-5”)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是_______________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 二、基因表达载体的构建——基因工程的核心 1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中________，并且可以遗传给下一代。 (2)使目的基因能够____和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别 3．基因表达载体的构建过程 三、将目的基因导入受体细胞 1．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入： (1)两次拼接：第一次拼接是______________________________________，第二次拼接(非人工操作)是指________________________拼接到受体细胞的_________ ___上。 (2)两次导入：第一次导入是将____________________导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指______________________导入受体细胞。 2．导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 四、目的基因的检测与鉴定 2．(人教选择性必修3 P82“正文”)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有______________、_____________________________。 PCR技术 (1)PCR过程： ①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 ②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 ③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 ④PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA 分子数 2 4 8 2n 含引物A(或 B)的DNA 分子数 1 3 7 2n－1 同时含引 物A、B的 DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的 引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1 －2 2n＋1－2 (2)PCR技术和DNA复制的比较 1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 (　　) 2．Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 (　　) 3．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (　　) 4．PCR扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 (　　) 5．随着转化方法的研究，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 (　　) 6．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 (　　) 1．设计引物是PCR技术成功的关键步骤之一。下图为某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，请判断是否合理并说明理由。 (1)第1组：___________________________________________________________ _____________________________________________________________________； (2)第2组：____________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 2．URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型酵母菌，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。 实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。 实验设计思路：________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 　PCR技术及应用 1．(多选)(2023·江苏扬州高三统考期中)聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。某DNA片段的PCR反应程序如图所示。下列叙述错误的是(　　) A．预变性可促进模板DNA边解旋边复制 B．复性是让解旋状态模板DNA恢复双螺旋 C．延伸结束后，新片段中的引物将被切除 D．终延伸可使目的基因的扩增更加充分 2．(多选)(2023·江苏南通高三统考阶段练习)交错PCR能实现同源基因的重组(如图，仅示单链)。第一轮延伸15 s，获得短产物①②。在第二轮开始时(95 ℃)产物①②与原来模板分开，然后(55 ℃)随机地与不同模板交错结合，延伸15 s，合成交错产物③④。每一轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物—模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基因产物。相关叙述正确的是(　　) A．交错PCR原理是DNA半保留复制 B．交错PCR延伸温度设定为55 ℃可增加交错次数 C．上一轮交错产物需与模板链严格配对才能继续下一轮扩增 D．温度设定为95 ℃时，进行的是复性过程 　基因工程的基本操作程序 3．(2022·江苏淮安高三校联考期中)在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。下图为花粉管通道法的一般原理示意图。相关叙述正确的是(　　) A．外源DNA进入胚囊最终获得的种子均含有目的基因 B．植物生长各个时期均可通过花粉管通道法导入外源DNA C．花粉管通道法最大的优点是无需植物组织培养，技术简单 D．含外源DNA的种子发育成植株后均具有相应性状 考点3　(探究·实践)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、DNA的粗提取与鉴定 1．实验原理 2．实验步骤 二、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．实验基础 (1)PCR原理：利用了______________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 (2)DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷____的电极移动，这个过程就是电泳。 (3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__________等有关。 2．实验步骤 (1)DNA片段的扩增 (2)DNA片段的电泳鉴定 ①根据待分离DNA片段的大小，用__________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在______或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的________混匀。 ②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入______内。 ④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶__________为宜。 ⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用__________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 ⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 ⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 1．DNA粗提取中的注意事项 (1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。 (2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 (3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 (4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。 (5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。 1．(2023·江苏苏州高三校联考阶段练习)下列关于DNA的粗提取和DNA片段的扩增及电泳鉴定的叙述，错误的是(　　) A．新鲜的洋葱、鸡血、猪肝等均可作为DNA粗提取的实验材料 B．在提取白色丝状物时单向搅拌比双向搅拌更有利于获得结构完整的DNA C．PCR实验中使用的枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌 D．PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，将电泳缓冲液加入电泳槽并没过凝胶1 mm后，电泳、观察 2．(多选)(2023·江苏淮安马坝高中校考期中)下列关于DNA片段扩增及其鉴定的叙述正确的有(　　) A．凝胶中DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来 B．－20 ℃储存的缓冲液和酶，为了加快融化速度，可以从冰箱取出直接水浴加热 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小、构象等有关 D．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前须进行无菌处理 1．核心概念 (1)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (2)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 (3)目的基因：指在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (4)转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (5)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 2．结论语句 (1)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 (2)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 (3)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。 (4)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。 (5)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子等。 (6)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 1．(2023·江苏选择性考试)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有________________，扩增程序中最主要的不同是________。 (2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用________。 A．ATGGTG——CAACCA B．TGGTTG——CACCAT C．GACGAG——CTGCAG D．CTGCAG——CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 2．(2022·江苏选择性考试)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 (1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是________________。 (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物的________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物________； ②PCR目的产物约为________bp 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有HindⅢ＋EcoRⅤ的识别序列，下游含有EcoRⅤ＋BamHⅠ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是________(选填序列编号) 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________ (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的________倍。 【研读教材】 自主诊断 考点1　一、DNA分子　转基因　遗传特性　生物类型　基因重组 二、1．原核生物　特定核苷酸序列　磷酸二酯键　黏性末端　2．磷酸二酯键　大肠杆菌　黏性末端　黏性末端和平末端　3．噬菌体　一个至多个　自我复制　受体DNA　标记 考点2　一、1．(1)受体细胞性状　预期表达产物　编码蛋白质　(2)结构和功能　2．(2)耐高温的DNA聚合酶　(3)50 ℃　72 ℃　(4)琼脂糖凝胶电泳 二、1．(1)稳定存在　(2)表达　2．RNA聚合酶　转录 三、花粉管通道　T­DNA　染色体DNA　显微注射　受精卵　Ca2+　1．(1)将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上　插入目的基因的T­DNA　染色体DNA (2)含目的基因的Ti质粒　含目的基因的T­DNA 四、染色体DNA　目的基因　mRNA　抗原—抗体 【实验基础】 自主诊断 考点3　一、1．酒精　2 mol/L　蓝色　2．白色丝状物　二苯胺 二、1．(1)DNA的热变性　(2)相反　(3)大小和构象　2．(1)微量移液器　微量离心管　使反应液集中在管的底部　(2)电泳缓冲液　沸水浴　核酸染料　电泳槽　1 mm　微量移液器 11 / 21 学科网（北京）股份有限公司 第51讲　基因工程的基本工具 和基本操作程序 考点1 研读教材·夯实必备知识 教材隐性知识 1．提示：切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害 2．提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接 3．提示：DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上 4．提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害 澄清概念 1．√　 2．×　提示：载体是重组DNA技术所需的工具，不是工具酶。 3．×　提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。 4．√　5．√ 思考探究·达成学科素养 1．提示： 2．提示：其他DNA序列也含有与向导RNA(SgRNA)互补配对的序列 ，造成向导RNA(SgRNA)错误结合DNA序列而脱靶，而且SgRNA的序列越短，脱靶率会越高 考向演练·提升关键能力 1．B　2．D 考点2 研读教材·夯实必备知识 教材隐性知识 1．提示：DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 2．提示：抗原—抗体杂交　采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫 澄清概念 1．√　2．√ 3．×　提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 4．√　5．√　6．√ 思考探究·达成学科素养 1．提示：(1)不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　(2)不合理，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 2．提示：将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组质粒，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长状况 考向演练·提升关键能力 1．ABC　2．AB　3．C 考点3 对应练习 1．C　[理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此洋葱、鸡血、猪肝等均可作为提取DNA的材料，A正确；由于DNA成丝状，双向搅拌有可能破坏DNA，因此，在提取白色丝状物时单向搅拌比双向搅拌更有利于获得结构完整的DNA，B正确；PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器需要清洗，C错误；PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，将电泳缓冲液加入电泳槽并没过凝胶1 mm后，电泳、观察，这样可以保证DNA片段在缓冲液中进行迁移，D正确。故选C。] 2．ACD　[凝胶中的DNA分子经染色后，对波长为300 nm的紫外光吸收性强，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，A正确；缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化，B错误；DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子大小、构象等有关外，还与凝胶的浓度有关，C正确；PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前须进行高压灭菌处理，防止外源DNA等因素的污染，D正确。故选ACD。] 真题感悟·明确考向 1．(1)模板(片段F1、片段F2)、引物　延伸时间　(2)CD　(3)限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶　(4)ABC　(5)P3、P4　(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 2．(1)脂质和蛋白质　发出星射线，形成纺锤体　(2)溶解DNA　耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)　3′　(3)①a、b　②1 100　③Q4　④纤毛基部可能含有X蛋白特异性结合的物质　(4)逆转录　32 $$ 课时分层作业(五十一) 1．B　[DNA连接酶连接两个DNA分子片段，A错误；限制性内切核酸酶识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子，B正确；DNA聚合酶催化脱氧核苷酸形成长链，C错误；逆转录酶是以RNA为模板指导脱氧核苷酸连接合成DNA的酶，D错误。故选B。] 2．C　[λ噬菌体用作运载体时，应保留至少一个限制酶的切割位点，A错误；将目的基因导入微生物细胞需要采用感受态细胞法，该过程常用Ca2+进行处理，而λ噬菌体作为载体将目的基因导入大肠杆菌，不需要用Ca2+处理，B错误；λ噬菌体载体可自我复制并含有标记基因，标记基因便于重组质粒的筛选，C正确；基因工程的核心是基因表达载体的构建，D错误。故选C。] 3．C　[重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A正确；作为运载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点(便于目的基因的插入)、复制原点(便于目的基因的扩增)及标记基因(便于筛选含有目的基因的受体细胞)等，因此载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确；起始密码子和终止密码子序列存在于mRNA上，在重组载体A和重组载体B中含有的是启动子和终止子，C错误；培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有区别，D正确。故选C。] 4．B　[哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不能采用猪血来提取DNA，A错误；在液体培养液中培养的大肠杆菌也可作为实验材料，大肠杆菌是细菌，含有拟核和质粒，DNA含量也较多，适合提取DNA，B正确；DNA在0.14 mol/L的氯化钠中溶解度最低，在2 mol/L的氯化钠中溶解度最大，因此在2 mol/L的NaCl溶液中，不会析出白色丝状物DNA，C错误；DNA鉴定时可取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液5 ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝，因此DNA鉴定时可通过是否加入DNA设置对照实验来观察实验现象，D错误。故选B。] 5．C　[mRNA是核酸，但不能直接用PCR扩增仪扩增，需要先反转录为cDNA再用PCR扩增仪扩增，A错误；PCR反应缓冲液中一般要添加dNTP，耐高温的DNA聚合酶不需要添加ATP激活，需要Mg2+激活，B错误；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，带电量相同的情况下，相对分子质量比较大的DNA片段移动距离较短，距离加样孔越近，C正确；琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中不含指示剂，不能在紫外灯下被检测出来，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。故选C。] 6．B　[根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接，A正确；将t-PA改良基因与质粒连接的酶是DNA连接酶，不是DNA聚合酶，B错误；在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即该基因的作用是便于将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，C正确；重组质粒已经破坏了mlacZ基因，其不会表达产物，即细胞呈白色。所以，在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株，D正确。故选B。] 7．BD　[选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的两种标记基因都破坏，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，A错误；酶切后的质粒和目的基因片段要用DNA连接酶连接，构建重组载体，B正确；能在添加四环素的培养基上生存的也可能是只含有质粒的大肠杆菌，C错误；PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故利用PCR鉴定目的基因时所用的引物为引物甲和引物丙，D正确。故选BD。] 8．ABD　[目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确；由图可知，通过基因工程技术实现酵母菌的PD基因被替换为L-PG基因，基因工程的实质是基因重组，B正确；标记基因AmPr可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误；PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。故选ABD。] 9．(1)A和T　B　(2)5′　MunⅠ和XhoⅠ　Mg2+　(3)胰岛B细胞中的mRNA反转录得到的胰岛素基因无内含子序列，能够在大肠杆菌中表达正确蛋白质　(4)2　B　2n－1　氨苄青霉素和X-gal　该菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落 3 / 3 学科网（北京）股份有限公司 $$