备课素材：PCR介导的两种基因定点突变技术及其原理-2023——2024学年度第二学期高中生物学选择性必修三

PCR介导的两种基因定点突变技术及其原理 先看一道试题： 成纤维细胞生长因子21 (FGF21) 是一种调节机体代谢的分泌型蛋白，具 有降低血糖、提高胰岛素敏感性等生理活性。但由于FGF21稳定性差，导致 FGF21药效较差。科研人员以含有FGF21基因(F)的重组质粒pSUMO-FGF21(p-F)为模板，对 F 进行定点突变，构建含突变基因的突变质粒 pSUMO-mmtFGF21(p-mF)，从而实现对FGF21 的改造，部分过程如下图所示。回答下列问题： （1）改变FGF21 中的氨基酸，使某两个氨基酸R 基之间形成共价键，可提高FGF21 的稳定性。这首先需要在数据库中检索 FGF21 的氨基酸序列和        ，据此设计                  并对蛋白质结构进行模拟验证。 （2）通过PCR 可实现对FGF21 基因 (F)的定点突变。 ①应选择下图中的哪对引物进行定点突变       。 A.1和4    B.2和 3   C.1和 3   D.2和4 ②突变引物长度不能过短，否则会由于          ，突变失败。 ③将引物、p-F、缓冲液、无菌水、DNA 聚合酶和    等加入微量离心管中，构成PCR体系进行反应。 （3）限制酶DpnI可识别并切割腺嘌呤被甲基化的5'-GATC-3'序列。选择突变质粒时，将DpnI与 PCR 产物混合，置于37℃下处理1h，可使p-F被切割而p-mF不被切割，据此推断可能的原因是        。为确保p-F 被充分切割，可适当增加酶量或       。 （4）在转化大肠杆菌时，用低温和 CaCl₂ 溶液处理大肠杆菌细胞，使其成为            细胞，与酶切产物混合后置于冰上30分钟，再通过短暂热刺激处理，使质粒进入细胞中。最后取适量菌液涂布在                 (填“含”或“不含”)青霉素的平板上进行筛选。当平板上长出菌落则表明发生了突变。为证实这一结果，可随机挑取单菌落抽提质粒并进行               。 答案：（1）基因序列    突变位点       （2）①B    ②特异性下降     ③dNTP（3）p－F的腺嘌呤被甲基化而p－mF的腺嘌呤没有被甲基化    适当延长处理时间    （3）感受态   含    测序 解析：试题中存在多外疑点，图中的解释是，在混合物中加入Dpn I酶，则模质粒全部被消化掉（大肠杆菌中提取的模板质粒，具有甲基化修饰，故被Dpn I消化掉），而已经被改造成功的双链环状质粒则不会被消化（PCR扩增的DNA序列均没有甲基化修饰）；把消化后的产物转化大肠杆菌感受态细胞，在抗性压力下筛选出所需要的已经被改造了的质粒。（1）考查的是蛋白质工程，需要了解蛋白质工程的程序来解决。（2）考查的是基因定点突变的原理，其实四个引物都需要，只不过引物1和引物2，引物3和引物4组合，分别进行PCR扩增。需要关注引物的设计不能过短，否则特异性降低。PCR的原料是dNTP，同时也提供能量。（3）Dpn I酶进行酶切是有一定的科学道理的，和甲基化修饰有关。（4）大肠杆菌的培养需要加入青霉素进行筛选，为证实这一结果，可随机挑取单菌落抽提质粒并进行测序，用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。Sanger测序法得到了广泛的应用。在中学，如果知道探针测定DNA序列也算已经不错的答案了。 此题考查了基因定点突变。一般来说，在自然条件下基因突变是不定向且随机的，且突变频率极低，大多数是有害的，如高中生物学教材中提到的镰刀型细胞贫血症。随着科学技术的发展，科学家已经有能力通过基因突变去改变生物体原有的特性，促使其向有益于人类发展的方向，如基因定点突变技术。 那么，什么是基因定点突变技术？原理是什么？ 1.基因定点突变概念和应用 基因定点突变是一种重要的分子生物学技术，它允许科学家们精确地修改基因中的特定部分，从而研究基因的功能或改进生物体的性状。这种技术通常通过聚合酶链式反应（PCR）等方法实现。通过定点突变技术，可以按照预定设计，将某基因中的一个或者几个碱基的添加、删除或替换等操作，导致基因中的部分碱基序列发生改变，实现基因的定点突变。通过这种方式，可以改变基因的表达产物，即蛋白质的氨基酸序列，进而影响蛋白质的结构和功能。 基因定点突变是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具，通过改变已知基因的特定碱基，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构和功能，从而改造酶的不同活性或动力学特性。 2.基因定点突变原理 目前基因突变主要使用PCR介导的突变引入技术，常见的基因定点突变方法有重叠延伸PCR法和滚轮扩增法，两种方法有利有弊。 （1）重叠延伸PCR 法 常规重叠延伸PCR需设计一对涵盖突变位点的引物进行两轮PCR，其中，带红色点标记的是替换成别的碱基，如正常是C可以换成T等方法，同时，还应设计他们对应的引物，也就是基因两端的，如图F和R引物。 第一轮PCR由正向外侧引物（F）与突变引物（R_m）合成片段1，由另一突变引物（F_m）与反向外侧引物（R）合成片段2，关键是会出现相同也就是一样的一段，即突变位点那部分；扩增完成后的产物同时为模板进行第二轮的PCR，因为突变位点俩区域可以碱基互补配对而连接起来，这样可以将来源不同的扩增片段重叠拼接起来，如片段1中的某条链和片段2中的某条链含有突变位点的部分配对，然后引物的作用下延伸，最后在引物R和F扩增出含突变位点的全长基因。 该方法最大的缺陷是操作相对繁琐，两轮PCR扩增和频繁的DNA回收操作会提高原始质粒污染的风险，并且第二轮PCR受影响因素较多，有时反复调整PCR反应条件也不能获得目标基因。 （2）滚轮扩增法 滚轮扩增原理的定点突变方法需设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用DNA聚合酶扩增，获取的扩增片段完成5‘端磷酸化后在DNA连接酶的作用下环化，原始质粒在DpnI的酶切作用下被消化，最终获得突变质粒。 该方法的缺陷在于7～10 Kb全长质粒的扩增往往不顺利，若不彻底消化原始质粒也容易产生假阳性克隆。同时，若需要完成多位点的定向突变，则需要花费更多的时间精力以及试剂成本。 例、定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入特定突变（通常是有利的），包括碱基对的增添、缺失和替换等。下列有关点突变的叙述错误的是（　　） A． 点突变可以利用DNA探针进行检测 B． 点突变引起的变异类型属于基因突变 C． 点突变技术可培育具有新性状的新物种 D．点突变技术可以研究蛋白质结构与功能 解析：DNA探针可检测DNA分子的碱基序列，点突变包括碱基对的增添、缺失和替换等引起DNA分子碱基序列的改变，可以利用DNA探针进行检测，A正确；基因突变指DNA分子中发生碱基对的增添、缺失和替换，从而引起的基因结构的改变，点突变是通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常有有利的），包括碱基对的增添、缺失和替换等，属于基因突变，B正确；新物种的产生需和原物种形成生殖隔离，仅有碱基对的增添、缺失和替换等基因突变，可以产生性状，不一定形成新物种，C错误；蛋白质的结构决定其功能，结构和功能之间的关系是蛋白质组研究的重点之一，对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，D正确。故答案C。 学科网（北京）股份有限公司 $$