第3章 基因工程 章末达标检测(Word练习)-【精讲精练】2024-2025学年高中生物选择性必修3（人教版2019 多选）

(满分：100分) 一、选择题(本题共15小题，每小题2分，共30分。每小题只有一个选项符合题目要求。) 1．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是(　　) A．基因工程又叫重组DNA技术，所用的工具酶是限制性内切核酸酶 B．所有的限制性内切核酸酶识别同一种特定的核苷酸序列 C．形成重组质粒时，用DNA连接酶将碱基通过氢键连接 D．基因工程常用的运载体有噬菌体、动植物病毒和质粒 解析　基因工程又叫DNA拼接技术或重组DNA技术，所用的工具酶是限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A错误；不同的限制性内切核酸酶识别的特定核苷酸序列不同，B错误；形成重组质粒时，用DNA连接酶将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；基因工程常用的运载体有噬菌体、动植物病毒和质粒，D正确。 答案　D 2．(2024·洛阳一中高二期末)下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是(　　) A．通常情况下，a与d需要用同一种限制酶进行切割 B．b能识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开 C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对 D．b代表的是限制性内切核酸酶，c代表的是RNA聚合酶 解析　b是限制性内切核酸酶，能识别特定的核苷酸序列并使DNA分子的每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，而不是使氢键断开，B错误；c是DNA连接酶，能连接两个DNA片段，C、D错误。 答案　A 3．科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．农杆菌的T­DNA与番木瓜基因发生重组 B．构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C．含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D．转基因抗病毒番木瓜不具有卡那霉素抗性 解析　构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病毒番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病毒番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。 答案　A 4．进行基因编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某二倍体生物B基因进行定点编辑的过程，用sgRNA可指引限制性内切核酸酶Cas9结合到特定的切割位点。下列说法错误的是(　　) A．基因定点编辑前，需要设计与片段Ⅱ两端碱基序列配对的sgRNA B．Cas9通过断裂脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键实现对片段Ⅱ切除 C．通过分析破坏B基因后的生物体功能变化，可推测B基因的功能 D．通过基因编辑技术改造后的B基因与编辑前的B基因不是等位基因 解析　sgRNA可指引限制酶Cas9结合到特定位点进行切割，因此基因定点编辑前需要设计与被切割基因的两端碱基序列配对的sgRNA，A正确；Cas9切断的是DNA片段，所以Cas9切断的是脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，来实现对片段Ⅱ切除，B正确；通过分析破坏B基因后的生物体功能变化，可推测B基因原有的功能，C正确；通过基因编辑技术改造后的B基因与编辑前的B基因由于位于同源染色体的相同位置，所以它们是等位基因，D错误。 答案　D 5．如图是RT­PCR过程示意图，①和②表示逆转录酶催化的逆转录过程，③表示PCR过程。据图分析下列说法错误的是(　　) A．逆转录酶具有DNA聚合酶的能力 B．③过程只需要引物b C．RT­PCR不可直接检测基因表达水平 D．RT­PCR可检测新型冠状病毒等RNA病毒 解析　逆转录酶能催化合成DNA，即具有DNA聚合酶的能力，A正确；③表示PCR过程，需要引物a、b，B错误；RT­PCR可检测基因的转录情况，从而推知基因的表达水平，不可直接检测基因表达水平，C正确；RT­PCR过程是先由RNA逆转录得到cDNA，再通过PCR扩增，故可用于检测新型冠状病毒等RNA病毒，D正确。 答案　B 6．科学家将含有人溶菌酶基因的基因表达载体注射到鸡胚中获得转基因鸡，目的基因在鸡输卵管细胞中特异性表达，并能在鸡蛋中收集溶菌酶。下列说法错误的是(　　) A．可从基因文库获取人溶菌酶基因 B．RNA聚合酶识别鸡输卵管细胞中特异性表达的基因的启动子 C．可通过农杆菌转化法将人溶菌酶基因导入鸡胚 D．鸡输卵管细胞可将人溶菌酶分泌到细胞外 解析　可从基因文库中获取人溶菌酶基因，A正确；目的基因在输卵管细胞中特异性表达，说明RNA聚合酶识别鸡输卵管细胞中特异性表达的基因的启动子，B正确；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，而农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法，C错误；能在鸡蛋中收集溶菌酶，说明鸡输卵管细胞可将人溶菌酶分泌到细胞外，D正确。 答案　C 7．(2024·阜新期末)下列关于几种酶作用的叙述，不正确的是(　　) A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接 B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录 C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因 D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链 解析　DNA连接酶可以使连接DNA分子片段之间的磷酸二酯键得以形成，即使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，A正确；RNA聚合酶能与基因的特定位点(启动子)结合，催化遗传信息的转录，B正确；通常情况下，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，C错误；DNA分子复制时，DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，D正确。 答案　C 8．利用基因工程技术，将T­DNA片段插入A基因中导致A基因突变，可获得突变体。为获知T­DNA插入位置，可用PCR技术进行扩增，应从下图选择的引物组合是(　　) A．引物Ⅰ与引物Ⅱ B．引物Ⅰ与引物Ⅲ C．引物Ⅱ与引物Ⅳ D．引物Ⅲ与引物Ⅳ 解析　引物Ⅰ与引物Ⅱ延伸方向向右，引物Ⅲ与引物Ⅳ延伸方向向左，引物组合只能是Ⅰ与Ⅲ、Ⅰ与Ⅳ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅱ与Ⅳ。为获知T­DNA插入位置，扩增序列应该包括T­DNA和A基因片段，故C正确。 答案　C 9．下列关于基因工程的应用的叙述，正确的是(　　) A．水稻细胞内检测到耐盐基因的表达产物，说明育种成功 B．向植物体内转入Bt毒蛋白基因可培育转基因抗病植物 C．转入胰岛素基因的大肠杆菌直接合成的胰岛素不具有生物活性 D．乳腺生物反应器只有乳腺细胞中含有目的基因 解析　水稻细胞内检测到耐盐基因的表达产物，并不能说明育种已成功，还要进一步检测该水稻在盐碱地中的生长状况，A错误；向植物体内转入Bt毒蛋白基因可培育转基因抗虫植物，B错误；具有正常生物活性的胰岛素需要内质网和高尔基体进行加工，而大肠杆菌(原核细胞)没有内质网和高尔基体，故转入胰岛素基因的大肠杆菌直接合成的胰岛素不具有生物活性，C正确；乳腺生物反应器各个细胞都含有目的基因，但目的基因只在乳腺细胞中选择性表达，D错误。 答案　C 10．下列有关基因工程和操作工具的叙述，正确的是(　　) A．质粒常被用作载体的原因之一是质粒上具有标记基因 B．RNA聚合酶能与信使RNA的特定位点结合，催化遗传信息的转录 C．利用显微注射法将人的生长激素基因直接导入小鼠的受精卵，培育超级小鼠 D．DNA探针可用于检测苯丙酮尿症和21三体综合征 解析　因质粒上具有标记基因，所以质粒常被用作载体，将目的基因导入受体细胞；RNA聚合酶能与基因的启动子相结合，催化遗传信息的转录；利用显微注射法将重组DNA导入小鼠的受精卵，目的基因才能够得以表达；DNA探针可用于检测苯丙酮尿症，但不能用于检测21三体综合征。 答案　A 11．(2024·合肥质检)科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。下列说法正确的是(　　) A．将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，可以用花粉管通道法 B．人的生长激素基因只存在于小鼠的膀胱上皮细胞中 C．进行基因转移时，通常要将外源基因转入受精卵中 D．采用抗原—抗体杂交技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组 解析　花粉管通道法用于将目的基因导入植物细胞，A错误；小鼠的体细胞是由同一个受精卵分裂和分化来的，核遗传物质相同，故小鼠的体细胞几乎都含有人的生长激素基因，B错误；由于受精卵的全能性最高，所以进行基因转移时通常将外源基因转入受精卵中，C正确；检测外源基因是否插入了小鼠的基因组通常采用PCR等技术，D错误。 答案　C 12．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，可以用于治疗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，据图分析下列叙述错误的是(　　) A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是新的干扰素的预期功能 B．图中新的干扰素基因必须插入到质粒上的启动子和终止子之间才能表达 C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 D．图中各过程并没有涉及基因工程技术 解析　构建新的干扰素模型的主要依据是新的干扰素的预期功能，A正确；新的干扰素基因必须插入到质粒上的启动子和终止子之间才能表达，B正确；改造干扰素结构的实质是对干扰素基因的结构进行改造，C正确；题图中从“人工合成DNA”到“在受体细胞中表达”的过程运用了基因工程技术，D错误。 答案　D 13．α1­抗胰蛋白酶缺乏症是北美常见的一种单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人α1­抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更容易获得这种酶。 下列关于该过程的叙述，错误的是(　　) A．载体上绿色荧光蛋白基因(GFP基因)的作用是便于筛选含有目的基因的受体细胞 B．将目的基因导入羊膀胱细胞中，将会更加容易得到α1­抗胰蛋白酶 C．培养的转基因羊的所有细胞中都含有该目的基因，故该羊有性生殖产生的后代也都能产生α1­抗胰蛋白酶 D．目的基因与载体重组过程需要DNA连接酶的催化作用 解析　载体上绿色荧光蛋白基因作为标记基因，可用于筛选含目的基因的受体细胞；将目的基因导入羊膀胱细胞中可制得膀胱生物反应器，获取产品将不受性别和发育时期的限制；基因表达载体的构建需要限制酶和DNA连接酶；转基因羊有性生殖产生的后代会发生性状分离，有的子代不再具有转基因生物的特性。 答案　C 14．运用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，达到大规模生产凝乳酶的目的。下图表示用作载体的质粒和目的基因所在DNA片段。下列操作与实验目的不符的是(　　) A．用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA连接酶构建基因的表达载体 B．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌 C．可用PCR技术大量扩增目的基因 D．用Ca2＋处理大肠杆菌使其易于转化 解析　限制酶不能破坏目的基因，也不能破坏质粒上的标记基因，且应该用不同的限制酶进行切割，以防止质粒和目的基因自身的黏性末端连接或防止目的基因与载体反向连接，所以构建图示的重组质粒的酶切位点应该选BamHⅠ、PstⅠ，用DNA连接酶将重组基因连接，A不符合题意；载体和导入目的基因的载体上都存在氨苄青霉素抗性基因，因此不能依此来确定筛选出的是否为导入目的基因的细菌，B符合题意；可用PCR技术大量扩增目的基因，C不符合题意；用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，易于转化，D不符合题意。 答案　B 15．(2024·河北卷)下列相关实验操作正确的是(　　) A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 解析　配制PCR反应体系时，应加入4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料，A错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，故B正确；配制的酵母培养基先进行高压蒸汽灭菌处理，然后再倒平板，C错误；烧红的接种环需在酒精灯火焰旁冷却后才能蘸取菌液，否则会杀死菌种，D错误。 答案　B 二、选择题(本题共5小题，每小题3分，共15分。每小题有一个或多个选项符合题目要求，全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分。) 16．B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如图所示的实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。下列关于该实验的叙述，正确的是(　　) A．B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录 B．可利用水稻体细胞和精子中的RNA构建cDNA文库，从中获得B基因中编码蛋白的序列 C．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测T­DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上 D．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光 解析　启动子是与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A正确；目的基因获取途径之一就是从cDNA文库中获得，B正确；检测T­DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应该用DNA分子杂交法，C错误；由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D正确。 答案　ABD 17．(2024·本溪期中)下图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR扩增出T­DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T­DNA插入的具体位置。下列有关说法正确的是(　　) A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物，T­DNA存在于其Ti质粒上 B．若扩增循环n次，需要2n－2个引物 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T­DNA的插入位置 解析　农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，A错误；扩增循环n次，得到2n个DNA分子，只有最初的两条母链不需要引物，共需要2n＋1－2个引物，B错误；耐高温的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T­DNA的插入位置，D正确。 答案　D 18．下列哪些方法能用于检测目的基因是否成功导入或表达(　　) A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因 B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因 C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测 D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性 解析　检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定：检测是否具有抗性及抗性程度。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因。 答案　BCD 19．(2024·扬州高二模拟)我国科学家利用了XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图所示是相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无XbaⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法正确的是(　　) A．一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增6次共产生52个等长片段 B．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法 C．植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株 D．使用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp左右的片段 解析　一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增6次共产生26－2×6＝52个DNA，A正确；将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法、花粉管通道法，B正确；目的基因插入两个限制酶酶切位点之间，对卡那霉素抗性基因和新霉素抗性基因都无影响。之所以不能用卡那霉素筛选，是因为插入植物细胞染色体上的是质粒的T­DNA片段，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，导入成功的植物细胞对卡那霉素无抗性，C错误；根据切割目的基因的限制酶在质粒上的切割位点，可知由于重组质粒上移除1 900 bp而补充了目的基因的678个碱基对，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1 500 bp的新片段，D正确。 答案　ABD 20．(2024·天津一中期末)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述错误的是(　　) A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种 B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成两个磷酸二酯键 C．为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞 解析　将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因，目的基因—质粒片段、质粒—片段质粒片段三种类型，A错误；DNA连接酶的作用是将酶切后得到的具有相同黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割开的质粒两端形成的末端也不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确；题图显示，在构建基因表达载体的过程中质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因都不会被破坏，因此能在含青霉素和四环素的培养基中生长的受体细胞不能表明目的基因已成功导入该细胞，D错误。 答案　ABD 三、非选择题(本题共5小题，共55分) 21．(10分)经过基因工程改造的、能生产人胰岛素的大肠杆菌是一种特殊的“工程菌”。所用载体(普通质粒)结构如图1所示，目的基因如图2所示。 (1)该过程中最重要的环节是基因表达载体的构建，方法是选用________(填“X”或“Y”)限制酶同时处理质粒和目的基因，再用________处理使之成为重组质粒。 (2)基因工程的四个基本步骤是________，__________，__________，________。 (3)将目的基因导入受体菌时，常出现三种情况未转化的细菌、含空载体(普通质粒)的细菌、含重组质粒的细菌。如图3是含人胰岛素基因的重组质粒的“工程菌”的筛选示意图： 图3中的________和________(填图3中字母)菌落为含有目的基因的“工程菌”。 解析　(1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，该过程需要选用X限制酶同时处理质粒和目的基因，再用DNA连接酶处理质粒和目的基因，将其连接为重组质粒。(2)基因工程的四个基本步骤是目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。(3)X限制酶的酶切位点位于抗青霉素基因内部，重组质粒含有抗四环素基因，抗青霉素基因被破坏，故含人胰岛素基因的重组质粒的“工程菌”可以在含有四环素的培养基上生长，不能在含青霉素的培养基上生长，B和D菌落为含有目的基因的“工程菌”。 答案　(1)X　DNA连接酶　(2)目的基因的筛选与获取　基因表达载体的构建　将目的基因导入受体细胞　目的基因的检测与鉴定　(3)B　D(两空顺序可颠倒) 22．(10分)下图为培育转基因奶牛获得人血清白蛋白(HSA)的流程。回答下列问题： (1)PCR扩增HSA基因使用的酶是________，反应体系中需要加入两种引物，原因是______________________，一个DNA分子经过三轮复制以后，同时含有两种引物的DNA分子有________个。 (2)过程①常用的方法是________。在过程②进行之前，需对早期胚胎进行性别鉴定，可取胚胎细胞进行DNA分析，其采用的基因探针来自________(填“X”或“Y”)染色体。 (3)检测牛奶中是否含有HSA，可采用________技术，如果在转基因牛乳汁中没有检测到HSA的存在，从构建基因表达载体的角度分析，最可能的原因是位于目的基因前后的____________________设计不理想，导致目的基因不能正常表达。 (4)有人另辟蹊径，成功培育出能生产HSA的转基因酵母菌。试指出利用转基因酵母菌生产人血清白蛋白的两点优势：________；________。 解析　(1)PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶；利用PCR技术扩增HSA基因时，需要加入两种引物，原因是耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增，该酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，一个DNA分子经三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有6个。(2)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；在过程②胚胎移植进行之前，需对早期胚胎进行性别鉴定，采用的基因探针来自性染色体，其中Y染色体是雄性特有的，因此采用的基因探针来自Y染色体。(3)检测牛奶中是否含有HSA，可采用抗原—抗体杂交技术。基因表达载体的组成包括启动子、目的基因、标记基因和终止子等，如果在转基因牛乳汁中没有检测到HSA的存在，从构建基因表达载体的角度分析，最可能的原因是位于目的基因前后的启动子和终止子设计不理想，导致目的基因不能正常表达。(4)利用转基因酵母菌生产人血清白蛋白的优势：酵母菌繁殖快、易培养、成本低；可以工业化生产、生产不受季节、气候、地域限制。 答案　(1)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)　DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增　6　(2)显微注射法　Y　(3)抗原—抗体杂交　启动子和终止子　(4)酵母菌繁殖快、易培养、成本低　可以工业化生产、生产不受季节、气候、地域限制 23．(13分)(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是________________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和________________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________________________________________________________________________。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出2点即可)。 解析　(1)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，从而使N基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C、A—U、A—T。(3)由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入了细菌B1基因组所用的模板为菌株B2的基因组DNA。结合题图分析可知P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故以菌株B2的基因组DNA为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。(4)焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染。 答案　(1)磷酸二酯键　片段甲含有启动子和终止子　(2)A—U、A—T　(3)菌株B2的基因组DNA　无扩增产物　(4)实现废物利用，减少环境污染(合理即可) 24．(12分)角蛋白酶(KerA)能降解角蛋白，在饲料工业中具有广阔的应用前景。实验小组将KerA基因导入大肠杆菌中，获得了能高效表达KerA的工程菌，如图表示KerA基因重组质粒的构建和筛选过程，(注：TikⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和PstⅠ表示限制酶，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neor表示新霉素抗性基因，大肠杆菌不含氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗性基因)。请回答下列问题： (1)构建重组质粒时宜选用________两种限制酶切割目的基因和质粒，而不选用另外两种限制酶的原因是________________________________________________________。 (2)将重组质粒导入大肠杆菌时要用________处理大肠杆菌，目的是_________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 大肠杆菌细胞作为原核细胞，常作为基因工程的受体细胞，其优点是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。 (3)影印接种就是用丝绒做成与平板大小相近的印章，然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒印章上，轻轻印一下，再把此印章在新的培养基平板上轻轻印一下。经培养后，比较平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置，推测可能导入了重组质粒的菌落。筛选重组质粒时，培养基甲应添加的抗生素是________________，培养基乙添加的抗生素是________________，根据图示结果，从培养基甲中应选择编号为________的菌落进行培养，其他菌落导入的是________________。 解析　(1)构建重组质粒时需要切割质粒和含目的基因的DNA片段，分析图示可知，应该用EcoRⅠ和PstⅠ两种限制酶同时进行切割，不使用其他两种酶切割的原因是TikⅢ会破坏质粒的复制原点，而BamHⅠ会破坏目的基因。(2)将外源DNA分子导入大肠杆菌前要用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。原核细胞作为基因工程的受体细胞的优点在于细胞结构简单、繁殖速度快、遗传物质相对较少。(3)PstⅠ进行切割时会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因，根据图示可知，b和c菌落能在培养基甲中增殖，但不能在培养基乙中增殖。培养基甲添加的是新霉素，培养基乙添加的是氨苄青霉素。应选择b、c菌落进行培养，获得工程菌。 答案　(1)EcoRⅠ和PstⅠ　TikⅢ会破坏质粒的复制原点，而BamHⅠ会破坏目的基因　(2)Ca2＋　使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　细胞结构简单、繁殖速度快、遗传物质相对较少　(3)新霉素　氨苄青霉素　b、c　不含目的基因的普通质粒 25．(10分)M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： (1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的________断开。 (2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_____________________________________________________________________________。 从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为________(答出两点即可)，功能上具有________________________________________________________________________。 (4)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活的实验思路：______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析　(1)基因工程中切割DNA的工具酶是限制性内切核酸酶(限制酶)，故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性内切核酸酶(限制酶)。限制性内切核酸酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。(2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。(3)由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。(4)先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路为：取该转基因动物的肝组织细胞，提取其蛋白质，加入适量的M蛋白的单克隆抗体，观察有无凝集现象(或有无抗原—抗体特异性结合的现象)，若有则说明M基因不失活，若无则说明M基因失活。 答案　(1)限制性内切核酸酶(或限制酶)　磷酸二酯键　(2)清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害　(3)动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难　细胞体积小，细胞核大，核仁明显(任选两点作答)　发育的全能性　(4)B　取该转基因动物的肝组织细胞，提取其蛋白质，加入适量的M蛋白的单克隆抗体，观察有无凝集现象(或有无抗原—抗体特异性结合的现象)，若有则说明M基因不失活，若无则说明M基因失活 学科网（北京）股份有限公司 $$