10.6 基因工程的基本工具与基本操作程序(Word教参)-【正禾一本通】2025年高考生物高三一轮总复习高效讲义（人教版2019 单选版）

第6课时　基因工程的基本工具与基本操作程序　 【课标要求】1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 考点1　重组DNA技术的基本工具 整合必备知识 1.基因工程的概念分析 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2.基因工程的诞生和发展 (1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。 (2)DNA双螺旋结构的提出和DNA半保留复制的证明。 (3)中心法则的确立。 (4)遗传密码的破译。 (5)基因转移载体和限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 (6)DNA体外重组的实现。 (7)重组DNA表达实验的成功。 (8)DNA测序和合成技术的发明。 (9)PCR技术的发明。 (10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 3.基因工程的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称限制酶) 【深挖教材】 (1)(选择性必修3 P71“旁栏思考”)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 提示：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全。 (2)(选择性必修3 P74“拓展应用”)为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 提示：细菌的DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 (3)(选择性必修3 P75“拓展应用”)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 (2)DNA连接酶 种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 特点 只“缝合”黏性末端 “缝合”黏性末端和平末端 作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，连接两个DNA片段 [深挖教材] (4)(选择性必修3 P72“旁栏思考”)DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上；DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。　 (3)载体 作用 携带外源DNA片段进入受体细胞 种类 质粒、噬菌体、动植物病毒等 目的 ①将目的基因转运到受体细胞中去 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制 必备 条件 能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因；对受体细胞无害 【易错辨析】　//////////////////////////////// (1)限制酶也可以识别和切割RNA。(×) 提示：酶具有专一性，限制酶只能切割DNA。 (2)DNA连接酶可以连接磷酸二酯键，也可以连接氢键。(×) 提示：DNA连接酶只能连接磷酸二酯键。 (3)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×) 提示：大多数限制性内切核酸酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 (4)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(×) 提示：质粒不属于工具酶。 (5)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。(×) 提示：质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因。 提升关键能力 图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。 (1)限制性内切核酸酶切断的化学键所处的具体部位是一条链上相邻两个核苷酸的磷酸基团与脱氧核糖之间。 (2)下列有关限制酶的叙述，正确的是ABC。 A.从反应类型来看，限制酶催化的是一种水解反应 B.限制酶的活性受温度、pH的影响 C.一种限制酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核苷酸序列 D.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率越小 (3)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1所示DNA片段，其产物长度为537 bp、661 bp和790 bp。 (4)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有4种不同长度的DNA片段，试分析其原因。 提示：发生基因突变后的d基因片段只有一个限制酶SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现两个片段，长度分别是1 327 bp、661 bp，D基因被限制酶SmaⅠ切割后，产生537 bp、790 bp、661 bp共3个片段，所以图1所示的DNA片段及其同源片段被切割后共出现4种不同长度的DNA片段。 (5)若将图2中质粒和目的基因D通过同一种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是BamHⅠ，理由是什么？ 提示：MspⅠ和SmaⅠ会破坏目的基因，MboⅠ会将质粒上的两个标记基因全破坏，BamHⅠ在目的基因两端和质粒抗生素A抗性基因上有识别序列，既能形成重组质粒，又因破坏2个标记基因中的一个利于筛选。 关键点拨 图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 落实素养题组 1.如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中错误的是(　　) 限制酶名称 识别序列和 切割位点 限制酶名称 识别序列和 切割位点 BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG 注：Y为C或T，R为A或G。 A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列 解析：选D。HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着识别序列的中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；HindⅡ能识别GTCAAC、GTTAAC、GTCGAC、GTTGAC，D错误。 2.若要利用某目的基因(见图甲)和质粒载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列叙述正确的是(　　) A.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体 B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体 C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体 D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体 解析：选D。用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体，产生相同的黏性末端，用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接，A错误；用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因会产生两种DNA片段，一种含有目的基因，一种不含目的基因，且有目的基因的片段与载体结合时容易发生反向连接，B错误；用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体，分别产生不同的黏性末端和平末端，但目的基因插入质粒载体后，RNA聚合酶的移动方向与图丙实线方向相反，C错误；用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体，分别产生不同的黏性末端和平末端，防止发生反向连接，且目的基因插入质粒载体后，RNA聚合酶的移动方向与图丙实线方向相同，D正确。 3.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　) A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B.所有质粒都可以作为基因工程中的载体 C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 解析：选D。在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；能自我复制、具有一个至多个限制酶切割位点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状双链DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。 考点2　基因工程的基本操作程序 整合必备知识 1.目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR获取和扩增目的基因 a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 b.PCR反应的条件：一定的缓冲液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。 c.PCR扩增的过程 d.PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 【深挖教材】 (1)(选择性必修3 P77“相关信息”)Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。 (2)(选择性必修3 P77“相关信息”)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 (3)(选择性必修3 P79“旁栏思考”)用PCR技术可以扩增mRNA吗？若扩增mRNA对应的序列，该如何操作？ 提示：不能。mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 [深挖教材] (4)(选择性必修3 P80“旁栏思考”)将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？ 提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。　 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 [提醒] (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T­DNA导入受体细胞。 4.目的基因的检测与鉴定 【易错辨析】　//////////////////////////////// (1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因。(×) 提示：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，有的是指具有调控作用的因子。 (2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×) 提示：外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达。 (3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点。(×) 提示：复制启动于复制原点，表达启动于启动子。 (4)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。(√) (5)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应。(×) 提示：DNA聚合酶只能催化DNA的复制。 提升关键能力 在PCR过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题： (1)什么是引物？ 提示：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 (2)PCR技术为什么需要引物？ 提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。 (3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？ 提示：目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。 (4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？ 提示：两种引物之间不能互补配对。 (5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？ 提示：引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。 (6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？ 提示：经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。 落实素养题组 1.北极比目鱼体内有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图。下列有关叙述错误的是(　　) A.过程①获取的目的基因含有启动子和终止子 B.过程②涉及磷酸二酯键的断裂与形成 C.农杆菌Ti质粒中T－DNA可将抗冻基因导入番茄细胞 D.抗冻番茄植株中抗冻基因与比目鱼体内抗冻基因碱基序列可能不同 解析：选A。因为cDNA是由成熟mRNA逆转录而来的，启动子和终止子不能作为模板转录形成mRNA，因此过程①逆转录获取的目的基因不含有启动子和终止子，A错误；过程②指限制酶切割目的基因和质粒后用DNA连接酶连接，主要涉及的是磷酸二酯键的断裂与形成，B正确；农杆菌Ti质粒中T－DNA可将抗冻基因导入番茄细胞并整合到番茄细胞的染色体DNA上，C正确；抗冻番茄植株中抗冻基因经mRNA逆转录形成，与比目鱼体内抗冻基因碱基序列可能不同，D正确。 题后点击　启动子≠起始密码子　终止子≠终止密码子 项目 本质 位置 功能 启动子 DNA 基因上游 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 起始密码子 mRNA mRNA首端 翻译的起始信号(编码氨基酸) 终止子 DNA 基因 下游 使转录在所需要的地方停下来 终止密码子 mRNA mRNA尾端 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 2.为了构建重组DNA疫苗，可将不同的抗原DNA片段进行重组，图中A、B载体有三个酶切位点，其中BclⅠ和BamHⅠ识别并切割的核苷酸序列相同，如图所示。现对A载体和B载体分别进行双酶切得到含A载体片段和含B载体片段，经DNA连接酶得到BA载体，需要使用的酶分别是(　　) 选项 A B C D A载体 ①＋② ①＋③ ①＋③ ①＋② B载体 ①＋③ ①＋② ①＋③ ①＋② 解析：选A。由题干信息可知，BclⅠ和BamHⅠ识别并切割的核苷酸序列相同，故将A载体用①和②酶切，保留BamHⅠ与A相连，将B载体用①和③酶切，保留BclⅠ与B相连，然后用DNA连接酶将A载体片段和B载体片段连接，即可得到BA载体。 考点3　DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 整合必备知识 1.DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理 (2)操作流程 [提醒]　加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 ①PCR利用DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②电泳：在一定的pH下，DNA分子中可解离的基团带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，向与它所带电荷相反的电极移动的过程。 ③产物鉴定：PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 (2)PCR实验操作步骤 (3)DNA的电泳鉴定 【深挖教材·选择性必修3 P85“探究·实践”】 (1)成功扩增出DNA片段的判断依据是什么？ 提示：可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 (2)电泳鉴定的结果如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 提示：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 【易错辨析】　//////////////////////////////// (1)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存。(×) 提示：实验所需的缓冲液和酶在－20 ℃条件下储存。 (2)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关。(×) 提示：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 (3)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换。(×) 提示：每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (4)DNA遇甲紫溶液会呈现紫色。(×) 提示：甲紫溶液会将染色体(质)染成紫色，DNA遇甲紫溶液不会变色。 提升关键能力 某兴趣小组以苹果为材料开展细胞中DNA含量测定研究，主要实验流程如下图，其中SDS(十二烷基硫酸钠)具有破坏细胞膜和核膜、使蛋白质变性等作用。苯酚和氯仿不溶或微溶于水，它们的密度均大于水。 (1)步骤①中苹果组织研磨前先经液氮冷冻处理的主要优点是充分破碎植物细胞。在常温条件下，也可向切碎的组织材料中加入一定量的洗涤剂和食盐，再进行充分搅拌和研磨。 (2)根据实验流程可推知，步骤③④所依据的原理是什么？ 提示：DNA不溶于苯酚、氯仿，而蛋白质等杂质能溶。 (3)步骤⑤加入2～3倍体积分数为95%的乙醇的目的是使DNA析出，同时去除部分蛋白质等杂质。 (4)下面是某同学设计的DNA鉴定实验的主要步骤： ①取1支20 mL试管，向其中先后加入2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL和少量絮状DNA沉淀，用玻璃棒搅拌使其溶解。 ②向试管中加入4 mL二苯胺试剂，混匀后将试管置于50～60 ℃水浴中加热5 min，待试管冷却后，观察溶液是否变蓝。 请指出上面实验步骤中的两个错误：“50～60__℃水浴”应为“沸水浴”、缺少对照组。 (5)该兴趣小组成员还以同种苹果的不同组织、器官为材料，测定不同组织细胞中DNA的含量，结果如下表(表中数值为每克生物材料干重中DNA含量)。 组织或器官 韧皮部 形成层 冬芽 秋梢嫩叶 成熟叶片 含量/(μg·g－1) 80 150 160 120 70 试从细胞分裂的角度，解释不同生物材料中DNA含量差异明显的原因。 提示：形成层、冬芽、嫩叶等部位的细胞分裂旺盛，DNA复制使得细胞中DNA含量较高。 落实素养题组 1.(2023·天津南开二模)PCR技术可用于遗传多样性的研究。下图是对两个跳虫(A和B)DNA分析的实验过程，有关叙述错误的是(　　) A.蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA B.Taq DNA聚合酶能够耐高温，高温下不会变性，常在PCR中用于DNA链的合成 C.将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照，可用于估测样本DNA片段的大小 D.阴性对照是已知DNA模板及PCR扩增过程所需的物质，以监测试剂是否污染 解析：选D。蛋白酶是水解蛋白质肽键一类酶的总称，跳虫细胞中大量DNA和蛋白质构成染色体，所以在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA，A正确。Taq DNA聚合酶能够耐高温，高温下不会变性，常在PCR中用于DNA链的合成，B正确；双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比，据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小，C正确。PCR污染的监测方法有阳性对照和阴性对照。阳性对照是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括标本对照和试剂对照。①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染，D错误。 2.(2023·湖北荆州模拟)科学家将海鱼的抗冻蛋白基因用PCR方法扩增，图1是扩增的目的基因的示意图。为寻找合适的载体，科学家对某载体用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶进行酶切后，再利用琼脂糖凝胶电泳得到图2所示图谱(其中1号泳道是标准DNA样品，2号、3号、4号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果)。下列说法错误的是(　　) A.应选用引物2和引物3对目的基因进行扩增 B.扩增5次后有22个等长的目的基因片段 C.DNA分子经过染色可在自然光下观察得到图2所示图谱 D.由图2可知该载体DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个 解析：选C。DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此应选用引物2和引物3对目的基因进行扩增，A正确；在PCR仪中经过5次循环后会产生25＝32(个)DNA片段，其中只有2个DNA片段含有最初的模板链，另外以由引物参与合成的与最初模板链配对的单链为模板形成的DNA片段的两条链不等长，这样的DNA片段有8个，因此经过5次复制产生等长的目的基因片段有32－10＝22(个)，B正确；琼脂糖凝胶电泳染色剂自然光下很难看到，一般在紫外灯下观察，C错误；当仅用一种限制酶切割载体时，图中的2号、3号泳道仅产生一种长度的DNA片段，说明该DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个，D正确。 　　　　　　　　　　　　　　　　[高考真题·感悟试做]　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.(2023·广东高考)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 解析：选D。裂解是加研磨液破坏细胞壁和细胞膜，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA的纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液，加入二苯胺试剂，沸水浴5 min，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。 2.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 解析：选C。酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的重组表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。 3.(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 解析：选D。若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中只含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 4.(2023·浙江6月选考)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3­GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是(　　) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3­GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 解析：选B。由图可知，启动子在左侧，GFP基因整合到Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 5.(2023·广东高考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题： (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与____________植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和__________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备______________。 (3)转化后，T­DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了____________________________________________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株______(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的上游，终止子位于目的基因的下游，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T­DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T­DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知，电泳图中，野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，图见答案。 答案：(1)野生型　(2)载体　启动子和终止子　(3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因　②75　③自交　100 6.(2023·山东高考)科研人员构建了可表达J­V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是______________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够驱动基因转录。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点等。(2)若要确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，则可利用引物F2和R1进行PCR扩增。若J基因没有连接到质粒中，则引物R1没有结合部位，扩增不出J基因；若J基因连接到质粒中但反向插入，则利用引物F2和R1扩增不出J基因。同理可知，还可选择引物F1和R2进行PCR扩增，以确定J基因连接到质粒中且插入方向正确。若用引物F2和R2进行PCR扩增，不能确定J基因是否连接到质粒中。若用引物F1和R1进行PCR扩增，不能确定J基因插入方向是否正确。综上可知，应选择图甲中的引物F2和R1或引物F1和R2。转录时mRNA的合成方向为5′→3′，又知J基因转录的模板链位于b链，所以b链左侧是3′端，右侧是5′端。PCR扩增时引物F1与模板链3′端的碱基进行互补配对，所以引物F1与图甲中J基因的b链左侧相应部分的序列互补，与a链相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J­V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 答案：(1)RNA聚合酶　标记基因、复制原点　(2)F2和R1(或F1和R2)　a链　(3)J­V5融合蛋白　不是 7.(2023·全国乙卷·节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题： (1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是______________________________。图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_________________________________________________。 (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是________________________________(答出1点即可)。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______________________________________________________。 解析：(2)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。(3)正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一个或多个密码子决定。(4)基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的基因表达载体(含有目的基因YFP基因)导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。 答案：(2)终止子　启动子　RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录　鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来　(3)密码子具有简并性　(4)将构建好的基因表达载体(含有目的基因YFP基因)导入酵母菌中进行表达 学科网（北京）股份有限公司 $$