第10单元 强化专题(10) PCR和基因编辑技术(Word教参)-【正禾一本通】2025年高考生物高三一轮总复习高效讲义（人教版2019 不定项版）

　强化专题(十)　PCR和基因编辑技术　 题型1　PCR技术拓展应用 1.反向PCR测定未知DNA区域 当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 2.PCR定点突变技术 该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 3.(实时)荧光定量PCR(RT－PCR) 先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。 【提升训练】1.(2023·山东青岛三模)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变。下列说法错误的是(　　) A.第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板 B.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C.扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 D.为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的复性温度 解析：选B。第一轮PCR中，需要先合成一条链，再用这条链合成互补链，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板，A正确；第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，B错误；若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在PCR扩增的定点诱变产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，C正确；为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第二轮PCR的复性温度应该比第一轮高，D正确。 2.巢式PCR是指先后用外、内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是(　　) A.PCR反应缓冲液中Mg2＋的作用是激活DNA聚合酶 B.与传统PCR相比，巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例 C.由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 解析：选D。PCR反应缓冲液中Mg2＋的作用是激活DNA聚合酶，A正确；与传统PCR相比，巢式PCR用外引物扩增后获得含有目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，能有效提高产物中目的基因的比例，B正确；由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。 3.(多选)PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团(Q蛋白质)和一个淬灭荧光基团(R蛋白质)。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针R处，会水解淬灭荧光基团，荧光监测系统从而可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成的完全同步。下列相关叙述正确的是(　　) A.引物、探针和模板三者之间通过碱基互补配对相互结合 B.Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 C.PCR产物的量与荧光信号的累积呈正相关 D.报告荧光基团和淬灭荧光基团的组成单位是脱氧核苷酸 解析：选BC。据图可知，引物和探针都能与模板结合，但引物不能与探针结合，否则该PCR过程无法完成，A错误；引物与模板的3′端结合，此后Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸，B正确；由“实现了荧光信号的累积与PCR产物形成的完全同步”可知，PCR产物的量与荧光信号的累积呈正相关，C正确；报告荧光基团和淬灭荧光基团都是蛋白质，其基本单位是氨基酸，D错误。 4.科学家为了提高干扰素的抗病毒活性和储存稳定性，采用重叠延伸PCR技术，将干扰素基因中相应位点的C—G碱基对特定突变为G—C碱基对，从而使干扰素中的第17位氨基酸由半胱氨酸变成丝氨酸。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的干扰素基因，然后导入大肠杆菌生产表达新的干扰素，原理如图。回答下列问题： (1)利用重叠延伸PCR技术诱变干扰素基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，制备出PCR体系1和PCR体系2，分别进行PCR扩增。PCR体系1中加入的引物是______________。得到图中由c、d链构成的完整DNA分子至少需要PCR体系2进行______次循环。 (2)将PCR体系1、2的产物(图中ab和cd)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有______种结合的可能，其中能进行进一步延伸的有______种。 (3)为便于构建基因表达载体，需要将限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变干扰素基因的两端，操作思路是__________________________________________________。 解析：(1)分析题图可知，利用重叠延伸PCR技术诱变干扰素基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，制备出PCR体系1和PCR体系2，分别进行PCR扩增。PCR体系1扩增目的基因的左半部分，需要加入的引物是引物1和引物3。PCR体系2扩增目的基因的右半部分，需要加入的引物是引物2和引物4。若要得到图中由c、d链构成的完整DNA分子，则第一次循环得到单链含有定点诱变位点的DNA片段，再以含有诱变位点的单链为模板进行第二次循环。(2)将PCR体系1、2的产物(图中ab和cd)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有4种结合的可能，即ab、cd、ad、bc。由于子链延伸方向为5′→3′，且要扩增形成完整的目的基因，故其中能进行进一步延伸的只有ad这一种。(3)为便于构建基因表达载体，需要将限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变干扰素基因的两端，引物的5′端是可修饰的，故操作思路是在引物1的5′端引入限制酶EcoRⅠ的酶切序列，在引物2的5′端引入限制酶SalⅠ的酶切序列。 答案：(1)引物1和引物3　2　(2)4　1　(3)在引物1的5′端引入限制酶EcoRⅠ的酶切序列，在引物2的5′端引入限制酶SalⅠ的酶切序列 题型2　CRISPR/Cas9技术 1.CRISPR/Cas9技术敲除掉部分基因原理 (1)CRISPR/Cas9是细菌的一种后天免疫防御机制——CRISPR序列示意图如下(其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列)，其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。 (2)病毒或外源质粒上存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些“原间隔序列”的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM(“原间隔序列”临近基序)。 (3)当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。 (4)当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。 2.CRISPR/Cas9技术的运用和发展 (1)具体运用如下图所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(指导RNA)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。 (2)CRISPR/Cas9基因魔剪：当研究人员要用基因魔剪来编辑一个基因组时，他们会人工构建一个指导RNA，它与将要被切割的DNA代码相匹配。魔剪蛋白Cas9与指导RNA形成复合物，将魔剪带到基因组中将要进行切割的地方。 (3)原始的CRISPR/Cas9会由于RNA定位偏差而出现脱靶效应，现在通过改进，可以大幅降低脱靶效应。同时还发现了一些新的系统，除了最开始的Cas9，后面又找到了Cas12的一系列酶，机理上有一定不同，但还是用以切割DNA；还有Cas13则用于切割RNA。基于Cas12和Cas13的开发以及机制研究，又发展出了新的工具用于快速检测病毒，效率可以达到几分钟检测一个样品，并且用到了现在的新冠病毒检测中。 【提升训练】5.(2023·辽宁鞍山模拟)CRISPR/Cas9是近年来生物学科研的热门技术，该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示，当细菌感知到噬菌体侵入时，会通过gRNA识别噬菌体DNA，并通过Cas9蛋白切断目标DNA，从而起到防御作用。下列叙述正确的是(　　) A.噬菌体DNA的变化体现了基因突变的不定向性 B.gRNA与目标DNA结合片段中最多含有5种核苷酸 C.Cas9蛋白可破坏DNA分子的磷酸二酯键 D.高倍光学显微镜可观察到该现象 解析：选C。噬菌体被细菌gRNA识别并被Cas9蛋白切割属于特定位点的切割，不是基因突变，不能体现基因突变的不定向性，A错误；gRNA为RNA，最多含有4种核糖核苷酸，DNA含有4种脱氧核苷酸，故gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核苷酸，B错误；Cas9蛋白可切断目标DNA，该过程破坏的是DNA分子的磷酸二酯键，C正确；该过程属于分子水平的改变，光学显微镜下无法观察到该现象，D错误。 6.(2023·山东潍坊模拟)Cre/loxP酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定位点上执行碱基序列的删除、插入以及重组等，从而实现基因的定点编辑。 (1)图1是利用Cre/loxP酶系统敲除基因的过程。loxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向loxP序列时，Cre酶识别并结合到loxP序列的反向重复序列区。两个loxP序列的间隔序列被Cre酶定点切开，4个黏性末端序列交错两两连接，其中待敲除基因两端的序列进行连接，连接时形成的化学键是____________，敲除的基因片段会形成__________(填“线状”或“环状”)结构。 (2)图2是利用Cre/loxP酶系统构建融合基因的过程。首先要用PCR对Bt基因和Bar基因分别扩增，以获得所需要的DNA片段，然后对连接后的DNA片段用Cre/loxP酶系统处理获得Bt ­Bar融合基因片段。在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在________________________________________________________________________。又有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5′端序列的要求是________________________________________________________________________。 (3)图3是用Cre/loxP酶系统敲除转基因烟草细胞内Bar基因的部分过程。已知图中的启动子和终止子可在烟草细胞中正常发挥作用，Cre酶基因在环境中存在Tam化学物质时才能激活表达。重组Ti质粒中的Bar基因作为基因表达载体中的__________可对转化后的烟草细胞进行筛选。进行图3所示敲除后，DNA片段1中的Bt基因不能正确表达，据图分析，原因是______________；若不对融合基因中的Bar基因进行敲除处理，仅在翻译水平上不让Bar基因表达，请利用Cre/loxP酶系统提出解决方案：__________________________________。 (4)图4是经过修饰后的转基因烟草细胞内的融合基因所在片段及相关引物的结合位点。为检测Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，可用PCR技术进行鉴定： 实验组：首先提取在有Tam环境下培养的转基因烟草细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入引物1和引物2进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无Bt基因和Bar基因的条带。 对照组：用未进行敲除处理的转基因烟草细胞，其余同实验组。 若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为______________________。 解析：(1)基因中一条链上脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接，因此待敲除基因两端的序列进行连接时，形成的化学键是磷酸二酯键。据图可知，当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向loxP序列时，Cre酶识别并结合到loxP序列的反向重复序列区，这样敲除的基因片段的两端因为是用同种酶进行切割，产生的是互补的黏性末端，它们会通过碱基互补配对原则形成环状结构。(2)启动子是决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列，终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，启动子一般在目的基因的左侧(外侧)，终止子在目的基因的右侧(内侧)，因为要获得Bt ­Bar融合基因片段，即需要Bt基因带上启动子(不需要终止子)、Bar基因带上终止子(不需要启动子)，因此在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置分别在启动子外侧和终止子内侧。据图2可知，Bt ­Bar融合基因片段中Bar基因的左侧和右侧都含有loxP序列，又因为大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG，据此可知，对Bar基因引物5′端序列的要求是引物的5′端均要连接上loxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG)。(3)图3是用Cre/loxP酶系统敲除转基因烟草细胞内Bar基因的部分过程，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，因此推测Bt基因是目的基因，Bar基因是标记基因，可对转化后的烟草细胞进行筛选。Bt ­Bar融合基因片段中的启动子是Bar基因的，终止子是Bar基因的，图中DNA片段1中不存在Bar基因及其终止子，因此DNA片段1中的Bt基因不能正确表达。若不对融合基因中的Bar基因进行敲除处理，仅在翻译水平上不让Bar基因表达，在Bt基因后面插入能翻译终止的mRNA序列，这样Bar基因就会因为没有启动子不能转录，因此利用Cre/loxP酶系统提出解决方案为：利用Cre/loxP酶系统在Bt基因和Bar基因之间插入终止密码子对应的DNA序列。(4)PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的，如果Bar基因被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，实验组中引物1不能结合到要扩增的目的基因上，不能进行扩增，因此两种基因的条带都无，对照组因此基因没有敲除，因此两个基因都能正常扩增，因此两种基因的条带都有。 答案：(1)磷酸二酯键　环状　(2)启动子外侧和终止子内侧(启动子和终止子的左侧)　引物的5′端均要连接上loxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG)　(3)标记基因　缺少Bar基因的终止子　利用Cre/loxP酶系统在Bt基因和Bar基因之间插入终止密码子对应的DNA序列　(4)实验组两种基因的条带都无，对照组两种基因的条带都有 7.CD3D严重联合免疫缺陷(SCID)是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统(ABE)，该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3δ－SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。 (1)研究发现，Cas9切口酶只能对DNA的单链剪切，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过____次DNA复制可以完成修复。 (2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。研究发现，sgRNA会识别与之匹配的其他区域，导致sgRNA脱靶，试分析其原因是________________________________________________________________，对此，你的解决措施是________________________________________________________________________。 (3)为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。 ①His的基因编码链的碱基序列为5′____________________3′。 ②为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物______(填“A”或“B”)的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′__________________3′。 解析：(1)由图1可知需要把A－T碱基对修复为G－C碱基对，腺嘌呤脱氨酶把A变成次黄嘌呤核苷酸，第一次复制黄嘌呤核苷酸与C配对，第二次复制C－G配对，完成修复，所以至少通过2次DNA复制可以完成修复。(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成，当其他DNA序列也含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶；为了解决这个问题可以适当增加sgRNA的长度，提高其与目标基因识别的特异性程度。(3)①基因编码链的碱基序列，相当于把mRNA的序列中U改为T，His标签由6个组氨酸组成，组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG，所以His的基因编码链的碱基序列为5′CATCATCATCATCATCATTAG3′。②欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，也就是在图中的右侧，所以要在右侧加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，即引物B的5′端，增加的是His的基因编码链的互补链碱基序列和XhoⅠ的识别序列：5′CTCGAGCTAATG3′。 答案：(1)2　(2)其他DNA序列含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶　适当增加sgRNA的长度，提高其与目标基因识别的特异性程度　(3)①CATCATCATCATCATCATTAG　②B　CTCGAGCTAATG 学科网（北京）股份有限公司 $$