第10单元 第42讲 基因工程的基本工具和基本操作程序(教用Word)-【赢在微点·顶层设计】2025年高中生物学高考一轮总复习（单选版）

第42讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 课标内容 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。 微考点大突破 考点一　重组DNA技术的基本工具 1.基因工程的概念 提醒　基因工程的理论基础 2.基因工程的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。 提醒　 (2)DNA连接酶。 提醒　①DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板,而DNA连接酶不需要模板。 (3)载体。 提醒　与膜载体的区别:基因工程中的载体是DNA分子,能将目的基因导入受体细胞内,并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制;膜载体是蛋白质,与细胞膜的通透性有关。 教考衔接 1.判断正误。 (1)限制酶在识别序列中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开形成的是黏性末端,在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。(选择性必修3 P71“正文”)(√) (2)基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体。(选择性必修3 P71~72“正文”)(×) (3)质粒上标记基因的存在,是便于重组DNA分子的筛选。(选择性必修3 P72“正文”)(√) (4)限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的氢键断开。(选择性必修3 P71“正文”)(×) (5)限制性内切核酸酶可识别并酶切单链DNA。(经典高考题)(×) 2.构建基因表达载体时,需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。 已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是,限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是,根据图示分析回答下列问题: (1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。 答:_____________________________________________________。 (2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶?请说明理由。 答:_____________________________________________________。 提示　(1)限制性内切核酸酶Ⅰ: 限制性内切核酸酶Ⅱ: (2)用限制酶Ⅱ切割目的基因,用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列,因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点,故使用限制酶Ⅱ时,可在目的基因两端同时作切割,从而切出“目的基因”,但若使用限制酶Ⅱ切割质粒,会同时破坏质粒中的两个“标记基因”,故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒 1.限制酶的选择技巧 (1)不破坏目的基因原则:如图中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。 (2)确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒,如图中PstⅠ;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点,而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。 (3)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则,如图所示。 (4)根据Ti质粒的T⁃DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 2.标记基因的作用 可用于检测目的基因是否导入受体细胞。 角度一　结合基因工程所需工具酶,考查科学思维能力 1.(2024·盐城调研)如图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点,AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　) 甲　乙 A.在构建重组质粒时,可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中,不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段,无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 解析　切割目的基因时,用BamHⅠ切割会破坏目的基因,只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体,会出现目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接,而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切,能确保目的基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因,A、C两项正确;在酶切过程中,不能破坏质粒中全部的标记基因,至少需保留其中的一个,B项正确;用PstⅠ切割后,质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了,导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长,D项错误。 答案　D 2.(2021·全国乙卷,T38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题: (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。图中___________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能__________;质粒DNA分子上有______________________,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是________________________________。 (4)表达载体含有启动子,启动子是指_____________________________________________________。 解析　(1)由题图可以看出,EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端、平末端,E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端,T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列,可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有限制酶切割位点,该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。(4)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,是RNA聚合酶识别和结合的部位。 答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一个至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基进行选择性培养　(4)位于基因上游的一段特殊DNA序列,是RNA聚合酶识别和结合的部位 角度二　结合载体的作用及特点,考查科学思维能力 3.大肠杆菌的质粒——环状DNA是基因工程的常用载体,结构如图。下列叙述正确的是(　　) A.①②③共同组成核糖核苷酸 B.质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则 C.DNA连接酶会使化学键④重新连接 D.若某种限制酶在质粒上只有一个限制酶切割位点,则质粒被切为两个片段 解析　①②③共同组成脱氧核苷酸,A项错误;质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则,A与T配对,G与C配对,B项正确;DNA连接酶使DNA片段重新连接,该过程形成磷酸二酯键,题图中的④不能被DNA连接酶连接,C项错误;限制酶识别特定序列并在特定位点切割,环状质粒上若只有一个限制酶切割位点,则质粒被切割为1个完整的DNA链状片段,D项错误。 答案　B 4.如图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题: 图1 (1)EcoR Ⅴ酶切位点为↓…GATATC……CTATAG…↑,EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为__________末端。 (2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为__________的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在__________酶作用下,形成重组质粒P3。 (3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是__________(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是________________、______________________。 菌落类型 平板类型 A B C 无抗生素 + + + 氨苄青霉素 + + - 四环素 + - - 氨苄青霉素+四环素 + - - (4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物,结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是________________________。 图2 解析　(1)据题图可知,EcoRⅤ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)据题可知,目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸,由于载体P1为平末端,所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸,这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P2连接起来。(3)由题意可知,构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏,所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活,应该选B类菌落。A类菌落在四种条件下都能存活,说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活,说明C类菌落没有导入质粒。(4)据题图分析,目的基因的外侧链只能用丙作引物,内侧链可用甲或乙作引物,如果用甲、丙作引物,则无论目的基因是否插入正确,都能通过PCR扩增大量目的基因,如果用乙、丙作为引物,当目的基因插入不正确(反向插入)时,则乙、丙两引物都结合在外侧,PCR不能正常进行,因此选用乙、丙作为引物可以进行RCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp,则正好是目的基因反向连接后,外侧链用乙作引物,内侧链用甲作引物扩增出的片段。 答案　(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA连接　(3)B　A类菌落含有P0　C类菌落未导入质粒 (4)乙、丙　目的基因反向连接 考点二　基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 (1)目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因。 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取。 ①人工合成目的基因。 ②PCR获取和扩增目的基因。 (1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 (3)复性温度过高,则引物难以与模板链结合,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。 (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 2.基因表达载体的构建——核心 (1)构建基因表达载体的目的。 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。 ②使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成。 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始 密码子 终止 密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) (3)基因表达载体的构建过程。 3.将目的基因导入受体细胞 (1)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同,实质都是基因重组。 (2)导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。 (3)农杆菌特点。 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T⁃DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (4)农杆菌转化法中的两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T⁃DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T⁃DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T⁃DNA导入受体细胞。 4.目的基因的检测与鉴定 教考衔接 1.判断正误。 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(选择性必修3 P77“相关信息”)(√) (2)构建基因表达载体是转基因工程的核心工作。(选择性必修3 P80“正文”)(√) (3)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动DNA的复制过程。(选择性必修3 P80“正文”)(×) (4)将生物的所有DNA通过注射或花粉管通道法转入植物细胞中,就可获得具有理想性状的转基因植物。(选择性必修3 P80“旁栏思考”)(×) (5)转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(选择性必修3 P81“资料卡”)(√) (6)Ti质粒上的T⁃DNA可携带目的基因进入受体细胞,并可将目的基因整合到该细胞的染色体DNA上。(选择性必修3 P81“资料卡”)(√) 2.(选择性必修3 P80“正文”)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶?是否只能用同一种限制酶? 答:_____________________________________________________。 提示　选用同一种限制酶切割会产生相同的末端,可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割 3.PCR是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中,引物非常关键,回答下列有关引物的问题: (1)什么是引物? 答:_____________________________________________________。 (2)PCR技术为什么需要引物? 答:_____________________________________________________。 (3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物,原因是什么? 答:_____________________________________________________。 (4)在PCR扩增目的基因之前,需先设计引物,对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么? 答:_____________________________________________________。 (5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达,科研人员提取胚乳中的总RNA,经逆转录过程获得总cDNA,通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是什么? 答:_____________________________________________________。 (6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环,理论上需要消耗多少个引物?第n轮循环需要消耗多少个引物? 答:_____________________________________________________。 提示　(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 (2)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3'端延伸DNA链 (3)目的基因的两条反向平行的链都作为模板,其碱基序列不同 (4)两种引物之间不能互补配对 (5)引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (6)经过n轮循环需要消耗(2n+1-2)个引物,第n轮循环需要消耗2n个引物 4.如果将某种抗性基因导入受体细胞后,仅一条染色体含抗性基因,该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是_____________________________________________________。 提示　仅一条染色体含有抗性基因,另一条没有其等位基因 角度一　结合PCR技术的操作和应用,考查科学思维能力 1.PCR反应中使用的引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,而5'端则无严格限制,常用于给目的基因两侧添加限制酶切点等序列。下列相关叙述正确的是(　　) A.PCR第3个循环,消耗了7对引物 B.反应体系中游离的脱氧核苷酸作为PCR扩增的原料会依次连接到引物的5'端 C.耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到双链DNA片段的引物链上 D.用图中引物扩增仅需2个循环后就能获得两端均添加限制酶切点的目的基因 解析　该DNA是双链,第一次循环需要1对引物,第二次需要2对,第三次需要4对,即PCR第3个循环,消耗了4对引物,A项错误;进行PCR时,扩增是从引物的3'端延伸,因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到引物的3'端,B项错误;耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上,C项正确;由题图可知,第一、二轮循环合成的子链长度均不同,根据半保留复制特点可知,前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长,第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链,即用题图中引物扩增至少3个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的基因,D项错误。 答案　C 2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程,其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是(　　) A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对,则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测,第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占15/16 解析　由于复制过程中子链的合成方向是从5'端向3'端,所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端,A项正确;题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点,因此复制出的子链从引物开始一直延伸至模板链的末端,在第二轮复制中才会出现两个引物之间的单链,在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链等长的DNA片段,即引物之间的核苷酸序列,B项正确;如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对,则会降低与模板链结合的效率,不能有效扩增目的基因,C项正确;第三轮扩增共形成8个DNA分子,共16条链,除去原来的模板链,应该有新形成的14条链,且这14条链中均含有引物,两种引物使用的频率是相同的,即有7条单链含有引物A,每一条单链参与组成1个DNA分子,因此第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占7/8,D项错误。 答案　D PCR技术和DNA复制的比较 角度二　围绕基因工程的基本操作程序,考查科学思维能力 3.回答下列问题: (1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了_____________________________________________________(答出两点即可)。 (2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的__________方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与___________组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是__________。 (3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用________________的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加__________的抑制剂。 解析　(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达,说明体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体后,才能侵染宿主细胞。噬菌体是细菌病毒,侵染细菌。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。 答案　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶 4.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点,同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示。请回答下列问题: (1)将目的基因导入植物细胞,采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是__________;该质粒含有一段特殊的DNA片段,称为__________。该方法中农杆菌的作用是________________________________________________________。 (2)在构建重组质粒时,和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比,选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是_____________________________________________________。 (3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖,农杆菌中是否已含有目的基因?__________(填“是”或“否”)。为什么?____________________________________。 (4)将已经转化的农杆菌进行如下操作,筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养,长出菌落后,用无菌牙签挑取A上的单个菌落,分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上,一段时间后,菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中?请在图中相应的位置上圈出来。 解析　(1)农杆菌细胞内含有Ti质粒,该质粒含有一段特殊的DNA片段,称为T⁃DNA。该方法中农杆菌的作用是感染烟草细胞,把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上。(2)在构建重组质粒时,如果只用一种酶切割目的基因的两端及质粒,切割后的目的基因或质粒各自出现的两个黏性末端碱基序列正好能互补配对,容易发生目的基因或质粒各自自连的现象,若选用HindⅢ和SalⅠ两种酶切割目的基因及质粒,则可以避免这种自连现象的发生,将切割后的目的基因和质粒混合,在DNA连接酶的作用下,可以得到更多的目的基因和质粒相连接的重组质粒。(3)据题图分析,三种限制酶在质粒上的切割位点都位于抗四环素基因的部位,含目的基因的农杆菌只含完整的抗氨苄青霉素基因,不含完整的抗四环素基因(被目的基因破坏),该农杆菌不能在同时含两种抗生素的培养基中正常生长繁殖,只能在含氨苄青霉素的培养基中生长繁殖。(4)据题可知,B、C两个培养基中的菌种都能抗氨苄青霉素,和B相比,在C中培养的有两个位置的菌落消失,说明这两个位置的菌种只能抗氨苄青霉素,不能抗四环素,推测这两个位置的菌种是含重组质粒的农杆菌,图见答案。 答案　(1)Ti质粒　T⁃DNA　感染烟草细胞,把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 (2)防止目的基因自连和质粒自连,以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率;防止目的基因与质粒反向连接　(3)否　含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏 (4)如图所示 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示,目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种:含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图中1、2、3、4、5菌落,再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图中能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图中1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 考点三　DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理。 (2)方法步骤(以洋葱为例)。 提醒　加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础。 (2)PCR实验操作步骤。 (3)电泳鉴定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。  提醒　①为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。③电泳时,DNA的相对分子量越大,迁移速率越慢;DNA的相对分子量越小,迁移速率越快。 3.DNA的电泳鉴定 教考衔接 1.(选择性必修3 P84~85 “探究·实践”)DNA的电泳鉴定实验中,影响DNA分子迁移速率的因素有哪些? 答:_____________________________________________________。 提示　凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等 2.(选择性必修3 P84~85 “探究·实践”)你进行电泳鉴定的结果是几条条带?如果不止一条条带,请分析产生这个结果的可能原因。 答:_____________________________________________________。 提示　多条条带。不止一条条带的原因:操作过程中混入限制酶切割DNA片段或还有其他DNA片段,以此为模板,进行了扩增 角度　结合DNA的粗提取与电泳鉴定,考查科学探究能力 1.(2022·山东卷,T13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是(　　) A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 解析　低温时DNA酶的活性降低,过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解,A项正确;离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀,B项错误;在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C项正确;细胞中的某些蛋白质可能不溶于酒精,在95%的冷酒精中与DNA一起析出,故粗提取的DNA中可能含有蛋白质,D项正确。 答案　B 2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱,其中1号为DNA标准样液(Marker),2~10号为PCR产物;其中2号的模板为野生型植株DNA,3~9号的模板为转基因植株的DNA,10号使用蒸馏水代替模板DNA。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出的分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达 C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 解析　PCR过程中,可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3~9号是转基因植株,理论上应包含目的基因,结合2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果,推测包含目的基因的片段大小应为250~500 bp,A项合理;3号PCR结果包含250~500 bp片段,包含目的基因,但导入的目的基因不一定能成功表达,B项不合理;9号PCR结果不包含250~500 bp片段,所以不是所需转基因植株,C项合理;10号放入蒸馏水,可排除反应体系等对实验结果的干扰,D项合理。 答案　B 微真题重体悟 1.(2023·全国甲卷,T38 )接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。 (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是_________________________________________________。 (2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是_________________________________________________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是____________________。 (3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取__________________进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是_____________________________________________________。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。 解析　(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,由于不含乙肝病毒的遗传物质,故接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒。(2)抗生素抗性基因为标记基因,其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。启动子是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。(3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,可采用DNA分子杂交技术,将酵母细胞中的基因组DNA提取出来,在含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,就表明目的基因已插入染色体DNA中。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,应从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已形成蛋白质产品。 答案　(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,不含乙肝病毒的遗传物质　(2)鉴别受体细胞(酵母菌)中是否含有目的基因(乙肝病毒表面抗原基因),从而将含有目的基因的细胞筛选出来　RNA聚合酶　(3)基因组DNA　用放射性同位素等标记的含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段　(4)从转基因酵母菌中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,观察是否有杂交带出现。 2.(2023·山东卷,T25)科研人员构建了可表达J⁃V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。 甲 乙 (1)与图甲中启动子结合的酶是________________。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有________________________________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物______。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的__________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了___________,条带2所检出的蛋白__________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 解析　(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'到5'端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J⁃V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 答案　(1)RNA聚合酶　标记基因、复制原点(或限制酶切割位点)　(2)F2和R1(或F1和R2)　a链 (3)J⁃V5融合蛋白 不是 3.(2023·全国乙卷,T38)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库,科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指_____________________________________________________。 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为____________;②为____________,其作用是________________________________;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是______________________。 (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是_____________________________________________________(答出1点即可)。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是_____________________________________________________。 解析　(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因文库包括基因组文库和部分基因文库(如cDNA文库)。(2)一个基因表达载体的组成,除了目的基因外,还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是检测受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来,题中的氨苄青霉素抗性基因就是一种标记基因。(3)结合题中信息可知,将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现有的大肠杆菌发绿色荧光,即GFP蛋白的荧光颜色,推测发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性,GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同。(4)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌,之后检测酵母菌是否发黄色荧光,如果发黄色荧光,则可证明YFP基因能在真核细胞中表达,否则,不能证明YFP基因能在真核细胞中表达。 答案　(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因　(2)终止子　启动子　被RNA聚合酶识别并结合,驱动GFP突变基因的转录　将含有目的基因的细胞筛选出来　(3)密码子具有简并性,GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同　(4)选择合适的运载体,利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和运载体连接起来,构建基因表达载体,之后将基因表达载体导入酵母菌,检测其是否会发黄色荧光 学科网（北京）股份有限公司 $$