第十四章 基因重组与基因工程（教学设计）-《生物化学》同步教学（人卫版）

授课章节 第三篇 基因信息传递·第十四章 基因重组与基因工程 授课对象 学时 4 时 间 授课地点 5315、5506、2301教室 教 材 《生物化学》·第六版·人民卫生出版社 教学 目的 要求 1、掌握：基因重组和基因工程的概念，转化作用、限制性核酸内切酶、基因载体、cDNA文库、基因组DNA文库的概念，目的基因的来源，基因载体的类型。 2、熟悉：同源重组、特异位点的基因重组、转座重组的概念和基本过程，重组DNA技术的操作步骤。 3、了解：重组DNA技术与医学的关系，重组DNA技术的操作程序。 教学 重点 难点 1.重点：细菌基因转移的接合作用、转化作用和转导作用，限制性核酸内切酶、基因载体、cDNA文库、基因组DNA文库的概念，目的基因的来源，基因载体的类型。 2.难点：重组DNA技术基本原理和操作步骤。 教学 方法 大课讲授，适当结合临床和生活实际实例 教具 多媒体教学课件 授课 提纲 概述，基因重组与基因工程概念5mins 第一节 DNA的重组 一、同源重组15mins 二、位点特异性重组15mins 三、接合、转化、转导20mins 四、转座20mins 小结 5 mins 第二节 重组DNA技术 一、重组DNA技术相关概念15mins 二、重组DNA技术基因原理25mins 三、重组DNA技术的研究进展15mins 四、重组DNA技术与医学的关系15mins 总结10mins 教 学 主 要 内 容 备 注 一、基因重组和基因工程的概念 1．基因重组概念 基因重组或称遗传重组是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。因此，新的DNA分子中含有原来的两个DNA 分子的片段。严格说来，所有DNA均是重组DNA。在遗传工程中，人们只是设法在试管中改变和连接DNA分子，企图引起基因表达发生比较简单的改变。在这里，人们只是模仿大自然在进化过程中进行的重组和突变而已。 2．基因工程概念 基因工程(genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。 二、自然界的基因重组 根据重组的机制和对蛋白质因子的要求不同,可以将狭义的基因重组分为三种类型,即同源重组、位点特异性重组和异常重组。同源重组的发生依赖于大范围的DNA同源序列的联会,在重组过程中,两条染色体或DNA分子相互交换对等的部分。真核生物的非姊妹染色单体的交换、细菌以及某些低等真核生物的转化、细菌的转导接合、噬菌体的重组等都属于这种类型。大肠杆菌的同源重组需要RecA蛋白,类似的蛋白质也存在于其他细菌中。位点特异性重组发生在两个DNA分子的特异位点上。它的发生依赖于小范围的DNA同源序列的联会,重组也只限于这个小范围。两个DNA分子并不交换对等的部分,有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中。这种重组不需要RecA蛋白的参与。异常重组发生在顺序不相同的DNA分子间,在形成重组分子时往往依赖于DNA的复制而完成重组过程。例如,在转座过程中,转座因子从染色体的一个区段转移到另一个区段,或从一条染色体转移到另一条染色体。这种类型的重组也不需要RecA蛋白的参与。 1、同源重组的概念和机制。 最基本的DNA重组方式，同源重组是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称基因重组。 2、细菌的基因转移与重组 接合作用、转化作用、转化作用。 3、特异位点重组 λ噬菌体DNA的整合，细菌的特异位点重组，免疫球蛋白的基因重排。 4、转座重组 转座子(transposon, Tn) 1950年麦克林托克(McClintock)在对玉米籽粒颜色遗传进行观察时所发现。转座子在移位过程中，导致DNA链的断裂/重接，或是某些基因启动/关闭。 （1）原核细胞转座子     其原型是E.coli的IS(insertion sequence, 插入序列)，一个细菌细胞常带少于10个IS序列。IS两端存在着反向重复序列IR(inverted repeat)，IR长短不一。IS本身没有任何表型效应，只携带和它转座作用有关的基因，称转座酶基因。 （2）真核细胞转座子     真核细胞中转座子以玉米和果蝇研究最多。玉米中至少有4种影响突变和基因重组的转座子；果蝇中有多个在基因组内随机分布而能重复移动的转座子。而在其他高等生物基因组中都存在与玉米或果蝇转座子相似的序列。真和细胞基因组流动性可能比原核细胞更大。  三、重组DNA技术 1、重组DNA技术相关概念等 （1）概念： （2）DNA克隆 （3）工具酶 在重组DNA技术中，常需要一些工具酶进行基因操作。如限制性核酸内切酶、连接酶等 （4）目的基因 需要进行克隆的外源基因 （5）基因载体 携带外源基因进行入宿主的特殊DNA，如制裁粒等。 2、重组DNA技术基本原理及操作步骤： （1）目的基因的获取方法， 人工合成；基因组DNA文库；cDNA文库；聚合酶链式反应。 A．直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。 B．根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 C．从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。 利用PCR合成： D．如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 （2）克隆载体的选择与构建 （3）目的基因和载体的连接方式 A．粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。 B．人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。 （4）重组DNA的筛选和鉴定 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：  A．根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。 B．根据标志互补进行筛选： 当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。 C．根据DNA限制酶谱进行分析： 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。 D．用核酸杂交法进行分析鉴定：为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。 思考题： 1． 什么是同源重组（homologous recombination），其分子机制是什么？ 2． 什么是位点特异性重组(site-specific recombination)，其分子机制是什么？ 3． 什么是转座(transposition)，什么是转座子(transposon)，原核生物有哪几种基本形式？ 4． 什么是DNA重组技术？它包含那些内容？ 5． 基因工程(genetic engineering)中，目的基因的获取有哪些方法？ 6． 简述基因工程的基本过程。 7． 作为载体的质粒应具备哪些基本条件？ 8． 列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。 9． 叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。 10． 怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？ 授课特点 1.首先把第十三章的内容进行概要复习，再结合自然界遗传进化的规律导入至本篇所要学习的内容，承上启下； 2.先介绍本章内容概要，教学目标和要求，使学生明了本章应该学习哪些内容和重点内容； 3.就相应内容联系临床和生活实例，提高学习兴趣； 4.采用启发式教学，适当提问，启迪学生思维； 5.重点介绍基本概念和基本过程，将难点讲清楚。 学科网（北京）股份有限公司 $$