2025届高三生物一轮复习课件： 基因工程

基因工程 复习目标（1分钟） 考点解读（2分钟） 1.掌握基因工程的三大基本工具和基本作用。 2.理解并掌握基因工程的原理、步骤和技术（含PCR技术） 基因工程是近年的高频考点，主要集中在限制酶的选择、基因表达载体的构建及各组分的作用、利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物等。如广东卷2023年T11、T20、2022年T22、2021年T22；全国乙卷T38、山东卷T25、天津卷T16等。 1 2023年广东卷 11. “DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ） A. 裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B. 分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C. 沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D. 鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【高考真题】 【高考真题】2023年广东卷 20. 种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。 （2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。 （3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性 植株_________（填“自交” 、“与野生型杂交”或 “与突变体杂交”）所得 的T3代种子按单株收种并 播种于选择培养基，阳性 率达到_________%的培养 基中的幼苗即为目标转基 因植株。为便于在后续研 究中检测该突变，研究者 利用PCR扩增野生型和突 变型基因片段，再使用限 制性核酸内切酶X切割产 物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。 【知识梳理】一、基因工程的概念及理论和技术基础 生物 类型 生物 产品 人们的愿望 转基因 遗传 性状 指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 1 概念 （10分钟） ②限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件 ①发现在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流 ①发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能； ②DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便； ③PCR为获取目的基因提供了有效手段； ④高通量测序技术可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解 ⑤基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换； 发展 2 基因工程的理论和技术基础 1 限制酶 原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 【知识梳理】二、 重组DNA技术的基本工具 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 注意： ①不同的限制酶所识别的核苷酸序列一般是不同的，切割产生的黏性末端一般也是不同的。但也有例外！ ②限制酶识别的核苷酸序列一般是回文序列，一种限制酶切割产生的黏性末端一般是相同的。 ③限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰(如甲基化) 。 （15分钟） (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 图解限制酶的选择原则 【考题讲练】3分钟 (2022·湖北卷T24)（3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用 酶切割S基因的cDNA和载体。 XbaⅠ、HindⅢ 2 DNA连接酶 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端 但连接平末端的效率相对较低。 源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事。 原因是：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 　与DNA有关的几种酶的比较 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端 解旋酶 DNA分子 碱基对中的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 12 3 基因进入受体细胞的载体 载体 质粒（常用载体），噬菌体、动植物病毒等 ①携带外源DNA进入受体细胞后能够自我复制并稳定保存，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ②具有1个或多个限制酶切割位点 ③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 ④对受体细胞无害 携带外源DNA片断进入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行复制和表达 种类 特点 作用 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。天然质粒需进行人工改造，才能用于基因工程。 【考题讲练】3分钟 (2021·辽宁卷，T24节选) （2）右图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。 为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 (填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 EcoRⅠ PvitⅡ T4 DNA连接酶 【课堂小结】 一、基因工程的概念及理论和技术基础 1、概念 2、基因工程的理论和技术基础 二、 重组DNA技术的基本工具 1、限制酶 2、DNA连接酶 3、基因进入受体细胞的载体 2分钟 【当堂训练】 3分钟 1. 第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是 A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒 B.图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团 C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶 C 【当堂训练】 3分钟 2. 农杆菌Ti质粒上的T­DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T­DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T­DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　) 注：子链从引物的3′端开始延伸 A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理 B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T­DNA的插入位置 C (1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是____________________________________________________。 【当堂训练】3. 图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ 三种限制酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题： Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是__________________________________________。 甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录　 【板书设计】 一、基因工程的概念及理论和技术基础 1、概念 2、基因工程的理论和技术基础 二、 重组DNA技术的基本工具 1、限制酶 2、DNA连接酶 3、基因进入受体细胞的载体 【作业布置】 《课时作业》第34讲 第1、2、3题 1 目的基因的筛选与获取 目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。 筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 【知识梳理】三、基因工程的基本操作程序 (1)从基因文库中获取目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 基因组文库 （包含一种生物的所有基因） 部分基因文库（包含一种生物的一部分基因）（cDNA文库） 基因文库类型: cDNA：先由mRNA在逆转录酶作用下获得单链DNA，再利用DNA聚合酶，将单链DNA复制，产生双链DNA，即为cDNA。 10分钟 (2)人工合成目的基因 ①逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下： ②化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下： (3)利用PCR获取和扩增目的基因 ①原理：DNA复制。 ②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸等。 ③扩增过程： 过程 说明 图解 变性 温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 注：引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 ④PCR扩增过程中的循环图示与规律 需要引物的原因？ DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 思考题：至少经过 轮PCR后，才能扩增出目的基因；n轮后，完整的目的基因有 个。 扩增产物中，含有引物的DNA占 个，只含一种引物的DNA 个，含有两种引物的DNA 个。 n轮后，共消耗引物 个；第n轮，消耗引物 个。 2n-2 2n 2 3 2n-2n 2n+1-2 2n ⑤用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 含有孔隙 【考题讲练】 (2023年广东卷T20节选） 为便于在后续研究中检 测该突变，研究者利用 PCR扩增野生型和突变 型基因片段，再使用限 制性核酸内切酶X切割 产物，通过核酸电泳即 可进行突变检测，相关 信息如图，在电泳图中 将酶切结果对应位置 的条带涂黑_________。 DNA片段 基因1 基因2 基因3 放大 终止子 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 思考：如果直接把目的基因导入受体细胞，可能会出现什么样的结果？ 如何避免该结果的发生呢？ 知识拓展 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。 编码区：编码蛋白质的合成 非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达 2 基因表达载体的构建 ---基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 启动子 标记基因 启动子具有物种和组织特异性。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。如构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是水稻胚乳细胞启动子。有时会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达(即在特定诱导物下才会活动)。 用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞 复制原点：DNA分子复制的起点（此处的A和T特别多，相对氢键少，不稳定，DNA容易解旋。） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； (3)基因表达载体的构建过程 问题探讨： 1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？ 若只考虑两两连接，质粒和目的基因至少可以连接3种；即目的基因-目的基因、质粒-质粒、目的基因-质粒。 2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 3.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 【课堂小结】 三、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取 (1)从基因文库中获取目的基因 (2)人工合成目的基因 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 2、基因表达载体的构建 (1)目的：稳定遗传并表达 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)基因表达载体的构建过程 【当堂训练】 3分钟 1. 利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是 A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引 　物b扩增的结果 B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互 　补的碱基 C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却 　至50 ℃左右 D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD D 【当堂训练】 10分钟 2. (2021·山东，25节选)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 (1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。 SalⅠ EcoRⅠ 6 (2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是______________________________________。 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于_______ ____________ 理由是_______ _________。 引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～ F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 【板书设计】 三、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取 (1) 基因文库 (2) 人工合成 (3) PCR技术 用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 2、基因表达载体的构建 (1) 目的：稳定遗传并表达 (2) 结构组成及作用 (3) 构建过程 【作业布置】《课时作业》第34讲 第 4、5、6题 第34讲 基因工程 (第3课时) 课件类型：B 复习目标（1分钟） 考点解读（2分钟） 1.掌握基因工程的三大基本工具和基本作用。 2.理解并掌握基因工程的原理、步骤和技术（含PCR技术） 基因工程是近年的高频考点，主要集中在限制酶的选择、基因表达载体的构建及各组分的作用、利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物等。如广东卷2023年T11、T20、2022年T22、2021年T22；全国乙卷T38、山东卷T25、天津卷T16等。 【课前提问】（2分钟） 1. 获取目的基因的常用方法有哪些？ 2. 说出基因表达载体的基本结构。 主备人：段然 议课人：江鹏波、马海生 议课时间：第4周 上课时间：第6周 34 3 将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (2)常用方法： 【知识梳理】三、基因工程的基本操作程序 10分钟 35 农杆菌转化法示意图 植物组织培养 ①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 ②原理：植物受损伤时伤口处分泌物（酚类化合物）可吸引农杆菌，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 4 目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子 水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 b.活性比较实验: 将基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同。 个体生物学水平的鉴定： a.检测生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度。如： 抗虫：做抗虫接种实验，观察害虫的生存状况 抗病：做病原体接种实验，观察生物的生存状况 抗盐：将转基因植物移栽到盐碱地 抗寒：将转基因植物移栽到低温（寒冷）环境中，观察其生长状况 （2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是__ __ _____ ____； 并且_________ __ ___和___ _______ 的细胞也是不能区分的，其原因是__ ____ ___。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_________的固体培养基。 【考题讲练】 5分钟 1. (2016全国Ⅰ卷)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆 菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠 杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有 插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：    二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长  二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有质粒载体     含有插入了目的基因的重组质粒 四环素  如何筛选出插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落？ 在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，产生一些菌落，然后将这些菌落按照原来的位置转移到含有四环素的培养基上进行培养，一段时间后，某些菌落将会出现停止增殖的现象，这些菌落的位置在含氨苄青霉素的培养基中对应的位置的菌落即为插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落。 抗原-抗体杂交技术 若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 脱分化 ①制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针） ②提取受体细胞全部DNA或mRNA，与基因探针置于同一培养液。 ③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交片段。 核酸分子杂交技术 【考题讲练】（2022·广东·高考）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对_________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是_____________________________________ ，终止子的作用是__________________________________________。 引物 筛选含有基因表达载体的受体细胞  终止转录，使转录在需要的地方停下来 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是__ ______________ ________________ _________________________ ，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了_____________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于_ ______________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳 二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长 废物的资源化 【课堂小结】 三、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 常用转化方法：农杆菌转化法、花粉管通道法、 显微注射法、 Ca2＋处理法 4、目的基因的检测与鉴定 常用方法：PCR、抗原—抗体杂交、抗性实验 【当堂训练】3分钟 1. (2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是 A.①＋③ 　　　 B.①＋② C.③＋② 　　　 D.③＋④ B 或①＋④ 【当堂训练】6分钟 2. (2023年广东卷T20节选) 种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。 （2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。 （3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。 野生型 运载体 启动子和终止子 ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。 DAI基因和卡那霉素抗性基因 75 【当堂训练】3. 某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题： (1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是_______；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为_________。该方法中农杆菌的作用是_____________________ _________________________________。 Ti质粒 T－DNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 (2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是_______ _ ______________________________________________。 防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率 (3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。为什么？___ __________________________________。 否 含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏 (4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。 【板书设计】 三、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 常用转化方法：农杆菌转化法、花粉管通道法、 显微注射法、 Ca2＋处理法 4、目的基因的检测与鉴定 常用方法：PCR、抗原—抗体杂交、抗性实验 【作业布置】《课时作业》第34讲 第7-9题 第34讲 基因工程 (第4课时) 课件类型：B 复习目标（1分钟） 考点解读（2分钟） 1.掌握基因工程的三大基本工具和基本作用。 2.理解并掌握基因工程的原理、步骤和技术（含PCR技术） 基因工程是近年的高频考点，主要集中在限制酶的选择、基因表达载体的构建及各组分的作用、利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物等。如广东卷2023年T11、T20、2022年T22、2021年T22；全国乙卷T38、山东卷T25、天津卷T16等。 【课前提问】（2分钟） 1. 导入目的基因的常用方法有哪些？ 2. 如何检测受体细胞转化成功? 主备人：段然 议课人：江鹏波、马海生 议课时间：第4周 上课时间：第6周 51 不溶于 2mol/L 二 苯胺 (1) DNA与二苯胺试剂作用呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。 【知识梳理】四、基因工程的实验与应用 1. 实验：DNA的粗提取与鉴定 (2)方法步骤 研磨 上清液 95% 一 个方向 2mol/L 二苯胺 5min 蓝色 1. （2023年广东卷 11）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ） A. 裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B. 分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C. 沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D. 鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【考题讲练】 D 2. (2022·山东卷T13) 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ） A. 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质 B 3分钟 离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀 2．基因工程在农牧业方面的应用 (1) 培育转基因植物：抗虫植物、抗病植物、抗除草剂植物。 (2) 改良动植物的品质：改良植物的营养价值；改良观赏价值。 (3) 提高动物的生长速率、改善产品品质。 【知识梳理】 3. 基因工程在医药领域的应用 (1) 利用转基因微生物或动植物细胞生产药物：生产出细胞因子、抗体、疫苗、激素等基因工程药物。 (2) 转基因哺乳动物批量生产药物：将药用蛋白基因和乳腺中特异表达的 基因的启动子等调控元件重组，制成乳腺生物反应器从而获得抗凝血酶、血清白蛋白等医药产物。 (3) 转基因动物作器官移植的供体(设想)：a.抑制抗原决定基因的表达；b.设法除去抗原决定基因。 4．基因工程在食品工业方面的应用 (1)应用：可以利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 (2)基因工程技术生产的工业用酶的优点 相比从天然产物中提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶的纯度更高，而且它的生产成本显著降低，生产效率较高。 5．基因工程在其他方面的应用 (1)培育出可以降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染。 (2)利用经过基因改造的微生物生产能源等。 1．红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是(　　) 【考题讲练】 (3分钟) A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶 B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程 C．检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术 D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得 C 【知识梳理】五　蛋白质工程的原理和应用 1．蛋白质工程的概念：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 特别提醒：蛋白质工程通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造的原因： (1)蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造。 (2)改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。 蛋白质结构 氨基酸序列 脱氧核苷酸序列 自然界中没有 自然界中已有 政治、经济和文化 无性生殖 中国不反对治疗性克隆，反对生殖性克隆 d遗传学诊断 不孕夫妇的生育 白血病、贫血症等疾病的治疗 体外受精 有性 致病菌 不发展、不生产、不储存 【课堂小结】 四、基因工程的实验与应用 1. 实验：DNA的粗提取与鉴定 2. 基因工程在农牧业方面的应用 3. 基因工程在医药领域的应用 4. 基因工程在食品工业方面的应用 5. 基因工程在其他方面的应用 五、蛋白质工程的原理和应用 六、生物技术的安全性与伦理问题 (2分钟) 【当堂训练】 1．胰岛素可用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，有关叙述错误的是(　　) A．新的胰岛素的预期功能是构建新胰岛素模型的主要依据 B．新的胰岛素生产过程中不涉及中心法则 C．若用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2＋处理大肠杆菌 D．新的胰岛素功能的发挥必须依赖于蛋白质正确的高级结构 B (10分钟) 2．乳酸菌无氧呼吸过程中，第一阶段产生的丙酮酸会在LDH的催化下产生乳酸，科学家通过改造乳酸脱氢酶(LDH)，能够高效地生产高纯度的苯乳酸。 (1)科学家拟改造LDH基因成为mLDH基因，需将LDH第52位的酪氨酸替换为亮氨酸，使得活性中心增大，可用于生产苯乳酸。 ①先将LDH基因片段连入载体中，形成环状质粒，如图。 注：1.方框中“GTA”转录出的UAC是酪氨酸的密码子。2．亮氨酸的密码子为CUX(X可为任意碱基)、UUA、UUG。 将突变后的序列设计在引物1中，以环状质粒为PCR的______，再向体系中加入四种脱氧核苷酸(dNTP)、_____________________酶、________以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因，PCR产物的序列便引入了预期的突变。下列引物序列中符合引物1要求的有________、________。 A．5′－TGACTGACTAACACTCGGAC－3′ B．5′－TGACTGACAACCACTCGGAC－3′ C．5′－TGACTGACGATCACTCGGAC－3′ D．5′－TGACTGACGAGCACTCGGAC－3′ 模板 耐高温的DNA聚合 引物2 A D (2)产生苯乳酸的过程还需FDH酶参与，现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。根据如图信息，先用限制酶________和________切割质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物，再用限制酶_______________切割质粒1和上一步中的连接产物，连接获得基因表达载体。 (3)上述科学实践属于生物工程中的________工程。 ②上述PCR产物为____状DNA分子，改造后的LDH基因序列位于PCR产物的两侧，需要用__________酶将产物两端连接起来，获得含有mLDH基因的质粒。 NdeⅠ XhoⅠ NcoⅠ和BamHⅠ 蛋白质 链 DNA连接 【板书设计】 四、基因工程的实验与应用 1. 实验：DNA的粗提取与鉴定 2. 基因工程在农牧业方面的应用 3. 基因工程在医药领域的应用 4. 基因工程在食品工业方面的应用 5. 基因工程在其他方面的应用 五、蛋白质工程的原理和应用 六、生物技术的安全性与伦理问题 【作业布置】《课时作业》第34讲 第10-12题 2．蛋白质工程与基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 过程 预期的蛋白质功能→设计预期的 eq \o(□,\s\up7(03)) →推测应有的 eq \o(□,\s\up7(04)) →找到并改变相应的 eq \o(□,\s\up7(05)) (基因)或合成新的基因→获得蛋白质 筛选获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 区别 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 生产 eq \o(□,\s\up7(06)) 的蛋白质 生产 eq \o(□,\s\up7(07)) 的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程 六　生物技术的安全性与伦理问题 1．转基因成果 领域 成果 微生物 方面 ①减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期； ②构建高产、优质的基因工程菌生产氨基酸； ③用基因工程菌生产药物 转基因 动物方面 ①培育生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜； ②培育抵抗相应病毒的动物新品种； ③建立某些人类疾病的转基因动物模型 转基因 植物方面 培育具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状的作物 2.转基因产品的安全性 (1)争论焦点：在转基因食品的安全性等方面发生激烈的争论。 (2)正确态度：理性看待转基因技术要做到建立在完备的相关科学知识基础之上；看到人们的观点受到许多复杂的 eq \o(□,\s\up7(01)) 等因素的影响；要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。 (3)我国方针：研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。 3．关注生殖性克隆人 (1)治疗性克隆与生殖性克隆 类型 项目 治疗性克隆 生殖性克隆 区 别 目的 治疗疾病 用于生育、获得人的复制品 产物 细胞、组织、器官 新个体 联系 都属于 eq \o(□,\s\up7(02)) ；遗传信息不变 (2)中国政府态度： eq \o(□,\s\up7(03)) 。 (3)比较试管婴儿技术与设计试管婴儿技术 ①过程区别：设计试管婴儿比试管婴儿多出的过程是上图中的 eq \o(□,\s\up7(04)) 。 ②应用不同：试管婴儿主要解决 eq \o(□,\s\up7(05)) 问题，而设计试管婴儿主要用于 eq \o(□,\s\up7(06)) 。 ③相同点：两者都是 eq \o(□,\s\up7(07)) ，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都属于 eq \o(□,\s\up7(08)) 生殖。 4．禁止生物武器 (1)生物武器的种类： eq \o(□,\s\up7(09)) 、病毒、生化毒剂等。 (2)中国政府的态度：在任何情况下 eq \o(□,\s\up7(10)) 生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。 $$