2025届高考生物二轮复习：PCR技术与应用专题拓展

新知讲解 一、教学目标： 1.基于PCR原理，掌握引物的设计原则。 2.由新冠病毒核酸检测原理，体会在真实科学研究与实践中，PCR技术的应用情景，尝试在实验设计中，利用PCR技术解决实际问题。 二、教学重点： 通过案例，学生总结归纳出PCR技术应用于新冠病毒核酸检测的原理。 三、教学难点： 学生运用PCR技术，解决分析相关问题。 复习旧知 1.[（2017·全国卷Ⅰ，38（5）]艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是___________________________________________________。 DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体 2. [（2018·全国卷Ⅰ，38（1）]回答下列问题： 博耶 和科恩 将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_______________________________________________________________________（答出两点即可）。 体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 （3min） 1.PCR反应的体系 预习检测 （4min） 2.PCR技术的过程 （退火） 新知讲解 （25min） PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。 一、PCR引物设计原则 扩增 特异性 扩增 高效性 引物 ①引物长度要适宜 ②引物GC含量要适宜 ③引物自身及引物之间不应存在互补序列 ④引物5'端可以修饰，3'端不可修饰 ⑤退火温度要适宜 （7min） 
一般，引物的长度为15-23bp，常用的长度为 18-21bp。 过长会导致退火温度高，也会导致延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应。 过短会导致退火温度低，特异性差。 ① 引物长度要适宜 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。 过低扩增效果不佳，过高易出现非特异性条带。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 ②引物GC含量要适宜 碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。 1、发夹结构（Hairpin） 自身互补 2、二聚体（Dimer） 两个引物间互补 发夹结构 二聚体 ③引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 在引物的5`端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。 ④引物5'端可以修饰，3'端不可修饰 如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。 退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。 思考原因是什么？ ⑤退火温度要适宜 新型冠状病毒的检测 （18min） 新冠病毒核酸检测 咽拭子采样 检测是否有新冠病毒RNA 新冠病毒RNA的量太少无法检测出来 需要扩增后检测 PCR只能扩增DNA 将新冠病毒的RNA通过逆转录后形成DNA PCR扩增逆转录后的DNA 检测 实时荧光定量PCR可以在扩增DNA的同时进行检测。 rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。 RT表示逆转录（reverse transcription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA（图1）。 2019-nCoV 核酸检测 优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接证据。 二、PCR技术的应用:（实时）荧光定量PCR（（r）RT-PCR） PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 荧光值 1.PCR扩增过程中荧光信号强度变化的变化规律 ①早期:扩增产物较少，荧光信号不易检测到 ②指数期:荧光值随循环次数增加呈指数增加。 ③线性期:荧光值随循环次数增加呈线性增加。 ④平台期:荧光值随循环次数增加几乎不增加。 早期 指数期 线性期 平台期 Taq酶活性下降 引物浓度下降 原料浓度下降 荧光值 循环数 2.相同DNA模板，在同一台PCR仪器上重复扩增曲线图 通过重复扩增曲线发现，在指数期的早期，重复实验的结果是一致。 荧光值 循环数 3.荧光阈值 在荧光扩增曲线的指数增长期的早期，设定一个荧光强度标准，称为荧光阈值。如图所示。 荧光阈值 荧光阈值是人为设定的，可以设定在指数扩增期早期的任意位置上。该位置上，在重复实验中，荧光值是相同的。 荧光值 循环数 4.Ct值(循环阈值) 荧光阈值 PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光值时所经过的扩增循环次数。 Ct值 4. Ct值(循环阈值) 如图，两个不同样品(样品1和2)DNA经过PCR扩增，得到的Ct值为Ct1和Ct2。 荧光值 循环数 样品1 样品2 Ct1 Ct2 样品中DNA的含量越多，其Ct值就越小。 因此，样品1中的DNA含量较样品2中的DNA含量多。 4.Ct值(循环阈值) 如图，两个不同样品(样品1和2)DNA经过PCR扩增，得到的Ct值为Ct1和Ct2。 荧光值 循环数 样品1 样品2 Ct1 Ct2 样品中DNA的含量越多，其Ct值就越小。 样品中DNA(模板DNA)的量与Ct值呈线性关系(负相关) 根据样品扩增的Ct值就可以计算出样品所含的模板DNA量。 新冠病毒核酸检测 咽拭子采样 新冠病毒RNA DNA 逆转录 实时荧光定量PCR Ct值 小于35 大于35 有传染性 无传染性 我国新冠肺炎防治最新诊疗方案(第9版)规定 居家隔离 医院收治 奥密克戎变异病毒毒力降低 典例.（2021南通期末考试改编）（7min）“实时荧光定量RT—PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在l~2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针（如图1），其5末端连接荧光基团（R）,3末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答： （1）这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的 、 有关。 （2）新冠病毒（nCoV-2019）是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，但nCoV-2019有部分特有序列，那么实时荧光定量RT—PCR中引物、 TaqMan探针中碱基序列的设计应主要依据 ，以避免假阳性的出现。 引物 TaqMan探针 nCoV-2019特有序列 （3）在实时荧光定量RT—PCR过程中，通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图（如下图）。最初数个循环里，荧光信号变化不大，设置为基线;之后进入指数增长期，在这个时期设置一个荧光阈值线;Ct值是PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，则Ct值越小，起始模板量越 . 从而实现对起始模板的相对定量分析。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn）主要与 、 有关。 指数扩增期 平台期 大 扩增次数 病毒RNA初始数量 典例2：新型冠状病毒是一种单链RNA病毒，新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 (1)首先，从样本中提取病毒RNA，经__________酶作用生成cDNA。然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。 逆转录 (2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图1）。 ① 当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因退火时，通过______________________ 原则而特异性结合。 ②在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈_________（正相关或反相关）关系。 碱基互补配对原则 正相关 (3)通过实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。 ①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有_________。 Taq酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降等。 (3)通过实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。 ②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就_________。 越小 (3)通过实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。 ③某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为_________。 阳性 (4)阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有________。 a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值 b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c.病毒发生变异 abc （5min） NC膜上的检测线（T线）和质控线（C线）。结合垫内含有标记的抗原特异性抗体，可以与样本中的抗原（病毒蛋白）发生结合，当液流到达检测线（T线）时，固定在这条线上的第二种抗原特异性抗体再次与抗原结合，将会呈现阳性结果。质控线（C线）包被IgG抗体，可以结合样本垫中抗体，用于判断层析过程是否顺利。 抗体 新型冠状病毒肺炎发病7天后，血清特异性抗体逐渐产生，首先出现的是免疫球蛋白IgM抗体，然后出现IgG抗体。因此，IgM抗体增高提示近期急性感染，IgG抗体增高提示既往感染。 NC膜上包被两条检测线（G线和M线）和一条质控线（C线）。M线包被有鼠抗人IgM单抗，G线包被有鼠抗抗人IgG单抗，C线包被有质控抗体。样本加到加样孔中，该样本在层析作用下将沿检测卡向前移动，如果样本中含有新冠状病毒IgM抗体，则该抗体与胶体金标记病毒抗原结合，形成夹心复合物，将会呈现阳性结果。如果样本中含有新型冠状病毒IgG抗体，则该抗体会与胶体金标记新型冠状病毒抗原结合，形成夹心复合物，将会呈现阳性结果。该检测卡还包含一条质控线（C线），用于判断层析过程是否顺利。 核酸与IgG、IgM抗体联合检测的结果解读 微专题 PCR技术与应用 微专题 PCR技术与应用 $$