吉林省/长春中医药大学附属中药职业学校2023-2024学年高三医学生物化学实验技术复习题

医学生物化学实验技术A复习题 1.生物化学的实验技术有哪些? ①离心技术 ②层析技术 ③电泳技术 ④免疫化学技术 ⑤分光光度技术 1. 蛋白质分离纯化的方法（按分离的原理分）和蛋白质分离纯化的程序 1）根据蛋白质溶解度的差别分：①等电点沉淀法②盐析和盐溶③有机溶剂沉淀④重金属盐沉淀2）根据蛋白质分子大小的不同分：①透析②超滤③密度梯度离心④凝胶过滤层析⑤超速离心3)根据电荷不同的纯化方法：①电泳②离子交换层析 程序：首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。 然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。 组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。 简述蛋白质分离和纯化的一般方法？ 答：主要有以下一些方法：透析及超滤法；丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀；电泳；层析；超速离心。 1. 蛋白质提纯的总目标是增加纯度或比活性（要求生物活性高）、设法去除变性的和不要的蛋白质（尽可能去除杂质）、希望所得蛋白质的产量达到最高值（要求得率高）。 4. 什么是离心力? 什么是相对离心力? 各用什么表示? （1）离心力(Fc) 离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力(Fc)的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积。（2）相对离心力(RCF)就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 5.制备性离心机可分为几类,叙述每类的特点？ ⑴ 普通离心机：最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000×g，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。 ⑵ 高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000×g，用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作。 ⑶ 超速离心机：转速可达50000～80000 rpm，相对离心力最大可达510000×g，它能使亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。 6.转头可分为几类,每类的特点是什么? (1)角式转头：在离心过程中，离心管与轴之间的角度是固定的，通常在20°到45°之间 (2)荡平式转头：梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴 (3)垂直转头：分离效率最高，样品密度可达1.7g/ml，两个小时就可以完成质粒DNA的分离 7.离心管可分为几类,每类的优缺点是什么? （1）塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 （2）不锈钢管优点强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 8.何谓差速沉降离心法, 优缺点(特点是)是什么?适用于分离哪些物质的离心? 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 9.离心操作的注意事项有那些? 1) 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡后对应管子必须互相对称地放在转头中。 2) 装载溶液时，要根据离心管不同要求选择装载量。 3) 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 4) 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。 5) 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时不得过速、过时使用。 10.层析:按照在移动相和固定相（可以是气体或液体）之间的分配比例将混合成分分开的技术。 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 指出常用层析技术的应用范围： 凝胶层析法：⑴脱盐；⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量；⑷高分子溶液的浓缩离子交换; 离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子; 高效液相层析法：⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析。 透析：通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 11.层析的分类及其分离原理 （1）吸附层析：固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。 （2）分配层析：固定相为液体，利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。 （3）离子交换层析：固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。 （4）凝胶层析：固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。 （5）亲和层析：根据生物特异性吸附进行分离，固定相只能和一种待分离组分有高度特异性结合，而与无结合能力的其它组分分离。 离子交换层析的原理：离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 亲和层析的原理：亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。 吸附层析的原理：组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂, 各能力不同而进行分离的方法。 凝胶层析原理：凝胶层析柱装有多孔凝胶，当含有各组分的混合液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动。一种是随着溶液流动而进行的垂直向下的移动，另一种是无定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶微孔，只能分布于凝胶颗粒的间歇中以较快速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶微孔，不断进出一个个颗粒的微孔内外，因此流动速度较慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子量由大到小顺序先后流出层析柱得到分离。 凝胶层析常用的凝胶，商品名及其特点： (1)葡聚糖凝胶 （Sephadex）：交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经1-氯-2，3-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。 (2)琼脂糖凝胶（Sepharose ）商品名（GE healthcare）：Sepharose-2B、4B、6B(琼脂糖的百分含量分别为2％、 4％、6％)，分离分子质量范围从100KD ～ 10 000KD。 (3)聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）的型号与特点？由丙烯酰胺(Acr)与甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成。调节Acr和Bis的浓度，就可以得到孔径大小不同的交联物。 (4)Superdex凝胶 ：由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。 如何对Sepharose (GE healthcare)凝胶进行预处理？ 保存于20%的乙醇, 使用前去除乙醇Sephadex Gs (GE healthcare)；若是干胶, 使用前须充分泡涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。 12.保留值、分离度、柱效、理论塔板等效高度的概念 （1）保留值：是表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的多少。它用来描述层析峰在层析图上的位置。 （2）分离度（Rs）：是指相邻两峰的保留差值是两峰宽平均值的几倍，分离度愈大，说明分离效果愈好。 （3）板高（理论塔板）：即分离效果的高低，常用塔板数的多少来衡量，某一组分随流动相经过一定距离后，流动相中某组分的平均浓度与固定相的平均浓度达到分配平衡，完成这一平衡所需要的层析柱的柱长称为板高或理论塔板等效高度。 （4）柱效：用H表示；一定柱长（L）中含有多少板高（H）称为理论塔板数（n）即 n= L/H 。 标准差：因分离过程中流出的曲线是正态分布曲线，两侧拐点之间的距离为2个标准差σ。σ的计算是流出峰到基线的距离为峰高的0.607倍，所以σ为峰高0.607倍处层析峰宽度的一半。σ大，说明组分流出分散，层析峰宽度也大，是柱效不高的表现。反之，σ小，表示组分在层析柱中集中，层析峰就窄，柱效也高。 13.层析峰区域宽度的描述方式 层析峰区域宽度的三种表示方法是标准差（σ）、 峰宽（Wb）、半峰宽（W1/2）。 14.如何提高柱效 （1）增加柱子高度 （2）凝胶柱中避免气泡（减少涡流） （3）根据分子扩散速率选择合适的流速 （4）透析除盐降低样品粘稠度、提高蛋白质的浓度（合适的上样体积（2-5%柱体积））减少传质阻力； 板高的影响因素：传质阻力，涡流，分子扩散 15. 电泳的原理：电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 影响电泳的主要因素有哪些？ 1)电泳介质的pH :影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快 2)缓冲液的离子强度 :离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快 3)电场强度 :电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快 4)电渗作用 5)支持物筛孔大小 :孔径越小，电泳速度越慢，反之越快 6)温度对电泳的影响 7)带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； 颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快 8)溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快 16.什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳 ？ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，这种凝胶由丙烯酰胺和交联剂N,N’ –甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺聚合而成。可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时，使用的电泳缓冲液PH＝8.3，那么样品应点在哪端？为什么？ 在负极。因为电泳缓冲液PH＝8.3时，血清蛋白的几种蛋白电离后都带上负电荷，所以只有点样在负极端，外加电压后，才能向正极移动，彼此才能分开。（PH值大于等电点时带负电荷 ,小于等电点时带正电） 17.聚丙烯酰胺凝胶聚合时自由基的引发有哪两种方法？ 聚丙烯酰胺凝胶聚合时自由基团的引发有化学、光合两种方法。 18. 简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 三个不连续：（1）凝胶由上下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同；（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同；（3）在电场中形成不连续的电位梯度。 三种物理效应：（1）电荷效应：酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定的电极以一定的速度泳动。 （2）分子筛效应：分子量、形状不同的分子在经过凝胶孔径过程中，受到的阻力不同，因此移动速率不等。 （3）浓缩效应：使待分离样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层，使原来很稀的样品得到高度的浓缩。 不连续凝胶电泳的分离原理。 （1） 样品的浓缩效应：1）凝胶层的不连续性2）缓冲液离子成分的不连续性 （2） 分子筛效应：因蛋白质分子量的大小而达到分离。蛋白质分子量大，迁移速率小，蛋白质分子量小，迁移速率大。 （3） 电荷效应。 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳与不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么不同？ 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 19.请说出常用蛋白质染色的几种方法 。 常用蛋白质染色剂有：氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝 G250 、 固绿、荧光染料、银染色法。 20. 请说出常用脂蛋白染色方法。 脂蛋白染色可用油红O、苏丹黑B染色。 21. SDS在SDS-PAGE中的作用。 SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。这样的SDS-蛋白质复合物在胶电泳中的迁移率只与蛋白质的分子量有关。 22. 蛋白质含量测定方法有哪些，简述其原理 1) 紫外吸收法测定蛋白质: 蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在波长280nm处，在一定的浓度范围内，蛋白质溶液的吸光度A280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。 2) 双缩脲法测定蛋白质: 蛋白质分子中含许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫红色的化合物。在一定浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质（浓度）含量呈线性关系。 双缩脲法定量测生物材料中蛋白质是否适合所有样品，如植物块茎等？ 不是。在生物实验中，双缩脲是用来测蛋白质的，现象是出现紫红色。选材时要注意蛋白质含量要高，材料颜色为白色或接近白色。故并非适用所有样品。 什么是双缩脲反应？ 双缩脲反应是指具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应,生成红紫色的络合 3) Lowry法测定蛋白质:蛋白质分子中含有带酚基的酪氨酸，在碱性条件下其肽链与Cu2+螫合，形成蛋白质 - 铜复合物，此复合物中酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。 利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。 4) 凯氏定氮法：根据蛋白质平均含氮量16%计算蛋白浓度。 5）考马斯亮蓝G-250染色法： 考马斯亮蓝G-250结合蛋白质后，形成蓝色CBG-蛋白质结合物，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内（10-1000ug/ml），CBG-蛋白质结合物的OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。 23. 总论部分： ⑴.实验报告包括实验名称、实验者、实验目的、实验原理、仪器与试剂、实验步骤、数据处理、实验结果、对实验得失的总结。 ⑵. 实验记录应做到：详细、准确、如实。 (3).论文需要翻译成英文的部分有：论文题目、作者与作者单位、摘要、关键词（或主题词）。 (4).论文的正文一般由以下部分组成：前言（或序）、实验材料与方法、实验结果、讨论、参考文献。 24. 简述血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的原理及实验中的注意事项。 原理：血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 注意事项： 1.市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在15－30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。 2.醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥－巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.05－0.09mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。 3.点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不齐，影响分离效果。 4.点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 5.电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4－0.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。 6.操作过程为防止指纹污染，应避免手与薄膜直接接触。 醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端，为什么？ 电泳时点样端应靠近负极，因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 血清醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白依次分为哪几条带？哪带电泳最快？影响电泳速度有哪些？ 有血清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白；其中血清蛋白电泳最快。影响因素蛋白质所带电荷数，分子大小与形状以及缓冲液浓度。 25.血清中总胆固醇测定的原理 总胆固醇测定原理为： 血清中总胆固醇（TC）包括游离胆固醇FC和胆固醇酯（CE）两部分。血清中胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成Δ4-胆甾烯酮和过氧化氢，H2O2在4-氨基安比替林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含量成正比。 26.简述血糖的测定原理 血清中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下氧化为葡萄糖酸，并释放出过氧化氢，过氧化物酶在色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应。红色醌类化合物生成量与葡萄糖含量成正比。 何为Trinder反应？影响该反应的因素有哪些？ Trinder反应，其原理为被测物质通过酶作用产生的过氧化氢4-氨基安替比林（4-AAP），过氧化物酶（POD）的存在下，可生产红色醌类化合物。 影响因素：维生素C，尿酸，谷胱甘肽及胆红素等还原性物质，工具酶中如杂有较多的过氧化氢酶，也会消耗氧化产物H2O2，使被测物的测定值偏低。 27. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：在去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳。SDS-PAGE只是按照分子的大小，而不是根据分子所带的电荷大小分离的。 为什么SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来测定未知蛋白质的相对分子质量？ 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质-SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系。 28. 等电点: 等电点是使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的净电荷为零）的pH值。 在等电点时，蛋白质的溶解度为什么最低？ 在等电点时，蛋白质在溶液中净电荷为零。蛋白质分子失去了电荷的排斥作用，因分子运动聚集而沉淀下来了 29. 酶活性单位: 1个酶活性单位是指在特定条件（25ºC，其它为最适条件）下，在1min内能转化1μmol底物的酶量，或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量。 30. 实验误差：简称误差，是量值的给出值与其客观真值之差。 31. 系统误差：是指一系列测定值对真值存在同一倾向的偏差。它具有单向性，而没有随机性，常有一定的大小和方向；一般由恒定的因素引起，并在一定条件下多次测定中重复出现。当找到引起误差的原因，采取一定措施即可纠正，消除系统误差能提高测定的准确度。 32. 随机误差：是指在实际工作中，多次重复测定某一物质时引起的误差。误差没有一定的大小和方向，可正可负，数据呈正态分布；具有不可预测性，不可避免，但可控制在一定范围内；分析步骤越多，造成这种误差的机会越多；随测定次数增加，其算术均数就越接近于真值。 33. 回收试验：回收是指候选方法准确测定加入常规分析标本的纯分析物的能力，用回收率表示。回收试验的目的是检测候选方法的比例系统误差。 34. 回收率：回收试验中测得的回收浓度占加入浓度的百分比例 35.蛋白质的分离常用的方法有哪些？ （1）前处理：选择适当的破碎细胞的方法破碎细胞，组织细胞破碎后，选择适当的介质（一般用缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。 （2）粗分离：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这种方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。 （3）细分离：也就是样品的进一步提纯，一般使用层析法，包括凝胶过滤层析，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可以选择电泳法。 36.SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？ 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。 37. 用SephadexG25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？ 蛋白质 38.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？为什么？ 不能,分子量差距太小。 39.将分子量分别为a（90 000）、b（45 000）、c（110 000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。 c、a、b 40.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在pH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM（阳离子交换剂）结合的紧密？如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？ Ala 41.什么是标准曲线法？举例说明在我们实验中的标准曲线是如何绘制的？ 答：标准曲线：是直接用标准液制作的曲线是用来表述被测物质的的浓度与分析仪器响应值之间的关系。 绘制方法：先配置一系列浓度由小到大的标准溶液，测出吸光度，以各管的吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制出曲线图。 学科网（北京）股份有限公司 $$