专题18 生物技术与工程综合 -【好题汇编】5年（2020-2024）高考1年模拟生物真题分类汇编（浙江专用）

专题18 生物技术与工程综合 考向 五年考情 考情分析 生物技术与工程综合 2024年6月浙江卷第23题 2024年1月浙江卷第22题 2023年6月浙江卷第23题 2023年1月浙江卷第24题 2022年6月浙江卷第29题 2022年1月浙江卷第29题 2021年6月浙江卷第29题 2021年1月浙江卷第29题 2020年7月浙江卷第29题 2020年1月浙江卷第29题 选择性必修3模块的综合考查，以发酵工程、细胞工程的真实情景为引入，结合多个工程的知识进行解答，其中基因工程基本上年年考查，这一模块考查学生基础知识掌握程度、知识综合应用能力、分析和获取信息的能力。 1、（2024年6月浙江卷）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： （1）获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为_____，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行_____获得分散的单细胞。 （2）对分离获得的单细胞进行_____培养，并通过添加_____或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了_____的胁迫。 （3）在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图_____（填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。_____ （4）多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过_____培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的_____和_____的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用_____工程生产植物的次生代谢产物。 【答案】（1） ①. 外植体 ②. 过滤 （2） ①. 扩大 ②. 过量的胸苷 ③. 微生物侵害 （3） ①. 丙 ②. 将细胞培养至稳定期（即停止生长时期）一定时间后，通过分离提纯获得大量X （4） ①. 根的水培养 ②. 相关基因组成 ③. 基因表达过程 ④. 基因工程和发酵 【解析】 【分析】1、植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。2、植物组织培养的条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【小问1详解】 植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 【小问2详解】 分离获得的单细胞进行扩大培养，并通过添加过量胸苷，（向细胞培养液中加入过量胸苷（TdR），处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。 【小问3详解】 由题可知X只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X的方法，是将细胞培养知稳定期（即停止生长时期）一定时间后，通过分离提纯获得大量X。 【小问4详解】 由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的收集，可以对根进行水培。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的相关基因组成和基因表达过程。 2、（2024年1月浙江卷） 锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： （1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 （2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。 （3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 （4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 【答案】（1） ①. 根 ②. 解旋酶 ③. 磷酸基团 ④. 变长 （2） ①. DNA连接酶 ②. 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 （3） ①. 划线分离 ②. 振荡培养 （4） ①. 梯度稀释 ②. 锌吸收缺陷型酵母+空载体 ③. N ④. 转入N基因的这组酵母菌数量数量多 【解析】 【分析】由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相近，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 【小问1详解】 由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。 【小问2详解】 内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。 【小问3详解】 冻存酵母菌可直接在固体培养基上涂布或平板划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。 【小问4详解】 由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 3、（2023年6月浙江卷）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： （1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 （2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 【答案】（1） ①. 负反馈调节 ②. 过量赖氨酸类似物 （2） ①. 基因数据库 ②. 融合 ③. 核受体细胞 ④. 激活 ⑤. 早期囊胚 ⑥. 转基因BEF ⑦. DNA酶 ⑧. PCR的模板 ⑨. 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 【解析】 【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 负反馈调节是指在一个系统中，系统工作效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。 【小问2详解】 ①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。 ②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。 ③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。 ④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 4、（2023年1月浙江卷）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： （1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的__________为外植体。 （2）植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。 （3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？__________ A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 （4）愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形成再生植株。 （5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的__________。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经__________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 【答案】（1） ①. 再生 ②. 叶 （2） ①. 纤维素 ②. 细胞质和细胞核 ③. 血细胞计数板 ④. 降低PEG浓度，使其失去融合作用 （3） ①. 同一个杂种融合原生质体 ②. ABD （4） ①. 再分化 ②. 根和芽 （5） ①. 模板 ②. M1、M2 ③. 凝胶电泳 ④. 1 【解析】 【分析】1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。 2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作过程包括:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。 【小问1详解】 在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。 【小问2详解】 植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。 【小问3详解】 将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。 【小问4详解】 愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。 【小问5详解】 Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 5、（2022年6月浙江卷） 回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题： （1）为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。 （2）为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。 （3）为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。 （二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题： （4）在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。 （5）为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。 （6）植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。 【答案】（1） ①. 无菌水 ②. 水浴 ③. 杀死不耐热微生物 （2） ①. 分离 ②. KI-I2 （3） ①. 人工诱变 ②. 原生质体融合 （4） ①. 农杆菌 ②. 过低 ③. 敏感性 （5） ①. 再生 ②. 细胞核 ③. 形态特征和数量 （6） ①. 培养时间 ②. 受精卵 【解析】 【分析】（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。 （二）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【小问1详解】 产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。 【小问2详解】 将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。 【小问3详解】 要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。 【小问4详解】 野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T—DNA中插入一种抗生素抗性基因。抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农杆菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T-DNA中抗性基因的细胞能在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，因此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。 【小问5详解】 转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性较强的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。 【小问6详解】 植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时间长短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表达能力最高。 6、（2022年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： （1）取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。 （2）红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。 （3）生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 （4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （5）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。 （6）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 【答案】（1） ①. 无菌水 ②. 活化 ③. 离心 ④. 破碎 （2） ①. 其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 ②. 70%乙醇溶液 （3） ①. 灭菌 ②. 资源化 （4） ①. 逆转录 ②. 核酸探针 （5） ①. 抗原 ②. 载体 ③. 使腺病毒失去复制能力 （6） ①. 脾 ②. 动物血清 【解析】 【分析】1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。2、微生物接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 【小问1详解】 防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细胞内的红曲色素释放出来。 【小问2详解】 用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。 7、(2021年6月浙江卷) 回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与甘蔗醋制作有关的问题： （1）为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经__________后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，振荡培养24 h。用__________将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有__________的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的__________培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。 （2）优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下振荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中______含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有____________________（答出2点即可）等特点。 （3）制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经_________后用于发酵。其固定化方法为_________。 （二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。 （1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。 （2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成_______，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有__________（答出2点即可）。提取质粒后，采用____法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。 （3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。 【答案】 ①. 冷却 ②. 玻璃刮刀 ③. 较大透明圈 ④. 斜面 ⑤. 乙醇 ⑥. 耐酒精度高、耐酸高 ⑦. 灭菌 ⑧. 吸附法 ⑨. 富营养化 ⑩. 重组DNA分子 ⑪. 限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因 ⑫. 显微注射 ⑬. 胰蛋白酶 ⑭. 原代 ⑮. 饲养层细胞 【解析】 【分析】1、涂布法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在固体培养皿表面，经培养后可形成单个菌落，是筛选高表达量菌株的常用方法； 2、基因工程的基本操作步骤为：获取目的基因、形成重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达。 【详解】（一） （1）高压蒸汽灭菌刚结束时，培养基温度较高，要等培养基冷却后再加入3%体积的无水乙醇。涂布分离法可用于单菌落分离，使用玻璃刮刀将待分离的菌液涂布到分离培养基的整个平面上。醋酸菌发酵产生的醋酸会使培养基中的CaCO3分解，形成透明圈。菌落小，透明圈大，代表着高产醋酸菌。菌种的贮存方法：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面培养基上，培养24h后，置于4℃冰箱中保存。 （2）醋酸发酵结束的标志性：产物不再增加（醋酸浓度不再上升）或原料消耗到最低值（乙醇含量达到最低）。优质菌种不光要产酸高，还要耐高酸，同时还要耐酒精（原料）等特点。 （3）我们在利用微生物时，常常要求所利用的微生物不被其他微生物污染。因此，在培养微生物时必须进行无菌操作，所以作为固定化介质的甘蔗渣需要经过灭菌处理。甘蔗渣类似果醋发酵装置中的锯末，可使醋杆菌吸附在甘蔗渣上进行发酵。 （二） （1）生活污水富含N、P，未经处理就大量排放，会导致水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华或赤潮。 （2）具有相同黏性末端的目的基因和载体DNA（如质粒），经DNA连接酶处理后，会形成重组DNA分子。与目的基因相同的限制性核酸内切酶识别序列，可以确保限制性内切酶处理后与目的基因形成相同的黏性末端，以便于和目的基因的连接。标记基因（抗生素抗性基因）的存在，便于筛选含有目的基因的受体细胞。动物基因工程，通常采用显微注射法将重组DNA分子导入动物受精卵中。 （3）使用胰蛋白酶处理囊胚的内细胞团，借助酶的专一性，可分解细胞间质的蛋白质，让细胞分散，便于培养。将分散的细胞初次在卡氏瓶中培养，称之为原代培养。提高细胞克隆形成率的措施有：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清最好）、饲养层细胞（滋养细胞如经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞）支持生长、激素（胰岛素等）刺激、使用CO2培养箱、调节pH等。 8、(2021年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题： （一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。 （1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或________法，两种方法均能在固体培养基上形成________。对分离的菌株进行诱变、________和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。 （2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除________；③检验固定化菌株的________。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是________。 （3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是________。 （二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。 （1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。 （2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。 （3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 【答案】 ①. 涂布分离 ②. 单菌落 ③. 筛选 ④. 未固定的细菌 ⑤. 降解富营养化污水污染物的能力 ⑥. 包埋法和吸附法 ⑦. 特定介质能为菌株繁殖提供X ⑧. 遗传 ⑨. 间种 ⑩. DNA聚合酶 ⑪. 愈伤组织 ⑫. 继代 ⑬. 杀灭发根农杆菌 ⑭. 转速 ⑮. 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度 【解析】 【分析】1、分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法（平板划线法）和涂布分离法（稀释涂布平板法）。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体--菌落。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。 2、固定化酶( insoluble enzyme)就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。 3、植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其具体过程：外植体→愈伤组织→胚状体→新植体，其中脱分化过程要避光，而再分化过程需光。 4、在植物组织培养时，通过调节生长素和细胞分裂素的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。 【详解】（一）分析题意可知，本实验目的是从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备固定化菌株。 （1）分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。 （2）固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。 （3）由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。 （二）（1）生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。 （2）分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。 （3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 9、(2020年7月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题： （1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的__________。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的__________，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值__________的处理效果好。③对不同处理进行__________，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。 （2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成__________，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已__________的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径__________的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的__________下降。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。 （2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。 （3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。 （4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。 【答案】 ①. 澄清度 ②. 95%乙醇 ③. 较小 ④. 抽滤 ⑤. 细菌悬液 ⑥. 灭菌 ⑦. 较小 ⑧. 粘性 ⑨. 抗性基因 ⑩. 全能性表达充分 ⑪. 显微注射 ⑫. 短 ⑬. 脱分化 ⑭. 生长素 ⑮. 根的分生组织 ⑯. B 【解析】 【分析】发芽培养基：3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g琼脂，再加蒸馏水至4000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。 生根培养基：1000mLMS培养基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g琼脂，再加蒸馏水至2000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。 【详解】（一）（1）由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测OD值，OD值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。 （2）为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌水配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。 （二）（1）设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。 （2）转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。 （3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故选B。 10、(2020年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与泡菜制作有关的问题： （1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。 （2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。 （3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。 （4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。 （2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。 （3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。 【答案】 ①. 果胶酶 ②. 细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质 ③. 喜好氧的 ④. 不耐酸的 ⑤. 稀释 ⑥. 涂布分离 ⑦. 酸碱指示剂 ⑧. 乙醇 ⑨. 过滤灭菌 ⑩. 染色法，渗透吸水或失水 ⑪. 化学合成 ⑫. 两种限制性核酸内切酶 ⑬. 扩增 ⑭. 细胞壁 ⑮. 胚胎发生 【解析】 【分析】泡菜制作： ①菌种：假丝酵母和乳酸菌；②发酵原理：在无氧条件下，微生物利用菜中的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质等，还有亚硝酸。③亚硝酸盐的测定：亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。 【详解】（一） （1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。 （2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。 （3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。 （4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋酸杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。 （二） （1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经过滤灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。可采用染色法、渗透吸水或失水的方法测定该原生质体的活性。 （2）可采用人工合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的黏性末端，需要选择使用两种限制性核酸内切酶，对质粒也进行相同的处理，为了提高目的基因和质粒重组的成功率，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。 （3）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过胚胎发生或器官发生的途径再生植株。 1、 非选择题 1．（2024·浙江温州·三模）普通小麦是两性植株，体细胞中染色体成对存在。条锈病由条锈菌引起，严重危害小麦生产，Yr5和Yr15基因都是有效的显性抗条锈病基因。回答下列问题： (1)Yr5基因和Yr15基因分别在斯卑尔脱小麦和野生二粒小麦中被发现，两种基因的根本区别是 不同。将Yr5基因或Yr15基因导入普通小麦中，实现了物种间的 (填变异类型)，提高了小麦的抗逆性。 (2)研究者将Yr15基因整合到普通小麦1B染色体的短臂上(如图甲)，获得抗条锈病小麦品系F。提取抗条锈病小麦的 作为PCR的模板扩增Yr15基因，用凝胶电泳技术分离、鉴定扩增产物。利用上述方法不能区分纯合和杂合的抗条锈病小麦，因为 ，两者电泳后DNA条带的数量和位置相同。 (3)研究者培育了不抗条锈病小麦品系T，其1B染色体的短臂(1BS)被黑麦 1R染色体的短臂(1RS)取代，形成了B．R染色体(如图乙)，B．R染色体形成的原因是发生了染色体结构变异中的 。品系T的其他染色体形态、功能与正常小麦相同。为检测小麦细胞中的B．R染色体，研究者根据该染色体 中DNA片段的特殊核苷酸序列，设计了荧光标记的探针1RNOR，将该探针导入小麦的体细胞，根据观察到荧光点的数目可判断细胞中 B．R染色体数目。 注：B．R染色体可与IB染色体联会并正常分离，但IRS与IBS不能发生重组。 (4)以纯合的不抗条锈病小麦品系T、条锈菌、探针 1RNOR 及抗条锈病小麦品系F(含杂合子和纯合子)为材料，可快速获得大量纯合的抗条锈病小麦，方法如下：让纯合小麦品系T与小麦品系F杂交得到F₁代， 。 (5)研究者将Yr5基因导入小麦品系T中，得到图丙所示植株，将该植株与杂合的小麦品系F杂交，让所有F₁植株进行自交，用探针 1RNOR 对F₂植株进行检测，若各种基因型的植株结籽率相同，F₂植株中抗条锈病且含荧光点的植株占 。 【答案】(1) 碱基排列顺序 基因重组 (2) DNA 两者都含 Yr15基因，PCR扩增产物类型相同 (3) 易位 黑麦1R染色体短臂 (4)用条锈菌淘汰F1中不抗（条锈）病植株，让F1自交得 F2，用探针1RNOR检测F2植株，细胞中没有荧光点的F2植株即为纯合抗条锈病小麦 (5)7/16 【分析】不同基因的根本区别在于二者的碱基排列顺序不同。由图乙可知，B.R染色体形成的原因是两条非同源染色体之间发生了易位导致的。抗条锈病且含荧光点的植株即含有Yr5或Yr15基因，又含有B.R染色体。 【详解】（1）不同基因的根本区别在于二者的碱基排列顺序不同。将Yr5基因或Yr15基因导入普通小麦中，属于基因重组。 （2）利用PCR扩增Yr15基因时，可提取抗条锈病小麦的DNA作为PCR的模板。无论纯合还是杂合，两者都含 Yr15基因，PCR扩增产物类型相同，所以利用上述方法不能区分纯合和杂合的抗条锈病小麦。 （3）由题意及图可知，B.R染色体形成的原因是两条非同源染色体之间发生了易位导致的。不抗条锈病小麦品系T，其1B染色体的短臂(1BS)被黑麦 1R染色体的短臂(1RS)取代，形成了B.R染色体，欲检测小麦细胞中的B.R染色体，设计探针时应根据染色体黑麦1R染色体短臂中DNA片段的特殊核苷酸序列。 （4）让纯合小麦品系T与小麦品系F杂交得到F1代，由于F中含有纯合子和杂合子，所以需用条锈菌淘汰F1中不抗（条锈）病植株，让F1自交得 F2，用探针1RNOR检测F2植株，细胞中没有荧光点的F2植株即为纯合抗条锈病小麦。 （5）抗条锈病且含荧光点的植株即含有Yr5或Yr15基因，又含有B.R染色体，丙植株与杂合的小麦品系F杂交，所得F1有B.R1B 2B2B，B.R1B 2B2BYr15，B.R1BYr52B2B，B.R1BYr52B2BYr15,上述四种基因型各占1/4，各自自交后，即含有Yr5基因，又含有B.R染色体1/4×3/4×3/4+1/4×1/2+1/4×（1/4×1/2+1/4×1/4+1/4×1）=7/16。 2．（2024·浙江金华·模拟预测）纤维素酶能将纤维素降解为单糖或寡糖，且转化过程绿色、低碳，被认为是纤维素资源化利用的可持续方法。在牛、羊等反刍动物的瘤胃中有能分解纤维素的微生物。某科研团队按照下图所示的流程分离瘤胃中的纤维素分解菌，实验中需要甲、乙两种培养基，并在平板上筛选到有透明降解圈的菌落。 (1)过程①中甲培养基中除水、无机盐、氮源还应有 成分，培养基表面加入一层无菌的石蜡主要目的是 。 (2)过程②中用适宜浓度NaCl溶液而不用无菌水进行梯度稀释的目的是 。 (3)科学家发现分离到的微生物产纤维素酶能力弱，进一步研究发现其体内的M基因抑制了其体内纤维素酶基因表达。某科研团队基于CRISPR/Cas9系统拟对某细菌内的M基因进行敲除，以探究该基因对其体内纤维素酶基因表达的调控效果。CRISPR/Cas9系统是其中一种能敲除特定基因的系统，该系统主要包含Cas9蛋白和由tracrRNA和crRNA形成的sgRNA两部分组成，sgRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA。 ①在设计sgRNA序列时，必须事先测定M基因的 ，从而设计一段能 得到sgRNA的DNA．在sgRNA与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区最多含有 种核苷酸，若要将M基因从目标DNA上剪切下来，需要设计 种sgRNA。 ②将sgRNA基因和Cas9蛋白基因导入 目标细菌，科研人员为提高转化效率，常常用 处理目标细菌一旦细胞中同时含有sgRNA和Cas9，Cas9就会与sgRNA结合在一起并在sgRNA的带领下，来到能够与sgRNA 的目的基因处，特异性地切割M基因。 ③将CRISPR/Cas9系统基因重组载体成功转染至目标细菌后，与对照组相比，实验组纤维素酶的表达量如图所示，由此得出的实验结论是 ，判断依据是 。 【答案】(1) 纤维素 创设无氧环境，有利于厌氧微生物生长 (2)扩大培养 (3) 两端特定的碱基序列 转录 8 2 感受态 CaCl2 碱基互补配对 M基因对其体内纤维素酶基因起抑制表达作用 敲除细胞株中纤维素酶表达量明显比对照组高 【分析】培养基的成分有碳源、氮源、水和无机盐，如果是固体培养基还需要添加琼脂作为凝固剂。 【详解】（1）过程①中甲培养基是液体培养基，除水、无机盐、氮源还应有碳源，而本实验是分离能分解纤维素的微生物，所以添加的碳源为纤维素，培养基表面加入一层无菌的石蜡主要目的是创设无氧环境，有利于厌氧微生物生长。 （2）过程②中用适宜浓度NaCl溶液而不用无菌水进行梯度稀释的目的是扩大培养。 （3）①M基因抑制了其体内纤维素酶基因表达，基于CRISPR/Cas9系统拟对某细菌内的M基因进行敲除，sgRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA，在设计sgRNA序列时，必须事先测定M基因的两端特定的碱基序列，从而设计一段能转录得到sgRNA的DNA。在sgRNA与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区既有DNA，也有RNA，故最多含有8种核苷酸，若要将M基因从目标DNA上剪切下来，需要有两个切口，而sgRNA的识别具有特异性，故需要2种sgRNA。 ②将基因导入微生物细胞，常使用CaCl2处理，使其成为感受态，所以将sgRNA基因和Cas9蛋白基因导入感受态目标细菌，一旦细胞中同时含有sgRNA和Cas9，Cas9就会与sgRNA结合在一起并在sgRNA的带领下，来到能够与sgRNA碱基互补配对的目的基因处，特异性地切割M基因。 ③将CRISPR/Cas9系统基因重组载体成功转染至目标细菌后，与对照组相比，实验组纤维素酶的表达量如图所示，由此得出的实验结论是M基因对其体内纤维素酶基因起抑制表达作用，判断依据是敲除细胞株中纤维素酶表达量明显比对照组高。 3．（2024·浙江绍兴·模拟预测）A型塞内卡病毒(SVA)会导致猪患水疱传染病，症状与猪口蹄疫等传染病非常相似，增加了临床鉴别诊断的难度。VP1蛋白是SVA核衣壳的主要成分，可作为SVA诊断的靶蛋白。研究人员尝试制备抗VP1蛋白单克隆抗体，以便快速、准确检测SVA病毒。回答下列问题： (一)基因工程抗原的制备 (1)提取病毒RNA，经 形成cDNA，根据GenBank上发表的VP1蛋白基因序列，设计一对特异性引物，在引物的 (5’或3’)端引入限制酶BamHⅠ和XhoI的识别序列，并进行PCR扩增。考虑一个模板DNA分子的扩增，PCR第四次循环时，需要消耗 对引物。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分析正确后，通常还需进行序列测定，原因是 。 (2)将回收后的VP1基因片段及pET-28a载体经酶切和连接后转化大肠杆菌DH5a菌株，接种至LB固体培养基。37℃恒温箱培养，挑取 至LB液体培养基，置于37℃摇床震荡培养12h，提取重组质粒，经鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21菌株。扩增成功转化的菌株，最后经 后收集菌体沉淀，并 细菌，纯化得到VP1蛋白。 (二)抗VP1蛋白单克隆抗体的制备 (3)用纯化的VPl蛋白多次免疫小鼠，然后诱导小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合，推测SP2/0细胞的生长特点是 。常用方法有PEG融合法、电融合法和 。通过选择培养的方法筛选出杂交瘤细胞，再经过96孔板 培养和抗体检测筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的2个杂交瘤细胞株分别注射到小鼠腹腔中，从腹水中成功提取得到了2种鼠源单克隆抗体—2E10和3E4。 (4)为进一步确定2E10和3E4在VP1蛋白上的结合位点，将VP1蛋白截为4段(VP1-1~VP1-4)，电泳后分别用2E10和3E4为探针进行杂交，结果如图所示。根据实验结果，可判断2E10和3E4与VP1的结合位点是 (填“相同”或“不同”)的，依据是 。 【答案】(1) 逆转录 5’ 8 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测 DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 (2) 单菌落 离心 破碎 (3) 体外无限增殖 灭活病毒诱导法 克隆 (4) 不同 2E10仅与 VP1-1结合，而3E4仅与VP1-3结合 【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2、动物细胞工程常用的技术有动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等。动物细胞培养是动物细胞工程的基础；动物细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术 【详解】（1）以RNA为模板合成DNA的过程叫逆转录，产物为DNA。因此，提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA。PCR过程中，子链的延伸方向是5’端向3’端，因此，限制酶BamHⅠ和XhoI的识别序列应设计在5’端。PCR第四次循环时以第三次循环的产物为模板，第三次循环结束后得到个DNA分子，每个模板DNA消耗一对引物。因此，PCR第四次循环时，需要消耗8对引物。经扩增得到的DNA分子经电泳后，可以区分不同产物的大小但无法经电泳结果知道碱基序列。因此，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分析正确后，通常还需进行序列测定。 （2）将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的子细胞群体称为单菌落。要分离获得含基因表达载体的菌株，要在固体培养基上挑取单菌落进行培养。VP1基因在大肠杆菌中表达出VP1蛋白，要提取VP1蛋白，先要经离心获得菌体，菌体再经破碎处理后纯化得到VP1蛋白。 （3）脾细胞和SP2/0细胞融合后要用于制备单克隆抗体，融合细胞要即能产生抗体，又能在体外无限增殖。脾细胞可以产生抗体，由此推测SP2/0细胞的生长特点是能在体外无限增殖。诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获 得足够数量的能分泌所需抗体的细胞，克隆化培养过程通常用96孔板。 （4）抗原与抗体发生特异性结合，结合电泳结果图，2E10仅与VP1-1结合，而3E4仅与VP1-3结合，可判断2E10和3E4与VP1的结合位点是不同的。 4．（2024·浙江绍兴·模拟预测）绍兴腐乳，又叫“霉豆腐”，具有酒醉醇香、细腻松酥、入口即化等特点，是浙江地区的传统名菜。其制作的流程是：让豆腐表面长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。腐乳味道鲜美的主要原因是微生物产生的蛋白酶和脂肪酶等将豆腐中的蛋白质和脂肪等分解成小分子的肽、氨基酸、脂肪酸等，其中的氨基酸与钠盐作用形成氨基酸钠（其中的谷氨酸钠是味精的主要成分）。研究人员欲从自然发酵的传统“霉豆腐”中筛选出新的毛霉菌株以进一步改良风味。 (1)腐乳发酵过程中所用的毛霉菌株是一种 菌。腌制完成后需要加卤汤装瓶，卤汤中酒精的含量一般控制在12%左右，从发酵角度分析主要原因是酒精含量过高，导致 ；过低，导致杂菌生长，引起变质。 (2)酪素培养基的原理是在培养基中添加酪素，如果菌株能产生蛋白酶并分泌到胞外，则能将酪素降解形成透明圈，从培养基的用途上分，该培养基属于 （填“选择”或“鉴别”）培养基。Hc值是透明圈直径与菌落直径的比值，据Hc值初步筛选出三种具有高蛋白酶活力的菌株编号为M2、M3、M4，原人工接种发酵工艺所用的毛霉菌株编号为M1。将各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合，接种于豆腐小块表面，分别以接种 为对照，培养后测定各组蛋白酶活力和脂肪酶活力如图1所示（柱状图上的误差线“I”代表数据的波动范围）。根据下图1数据，最优的毛霉菌株组合是 。 (3)根据以上研究，研究者想通过以下细胞工程的方案获得M2M3杂种菌株，以期获得优质毛霉菌株。 处理③过程可选择 、离心等物理方法，也可选择合适的化学方法；在此处理前需要先对原生质体2和3进行 。在获得杂种毛霉后，往往还需要经过 和鉴定。结果发现，利用细胞工程得到的杂种毛霉并没有达到预期的效果，其原因可能之一是 。 (4)另一研究小组想通过改造M4菌株形成新的单菌株毛霉发酵工艺，图3为M4菌株改造的基本思路。 图3的流程是利用 工程对毛霉进行改造，A是指活力更高的 （蛋白质）。 若图4为目的基因的部分序列： 现需要在目的基因上游添加EcoRⅠ识别序列（5'-G↓AATTC-3'），下游添加BamHⅠ识别序列（5’-G↓GATCC-3'）以便与载体正确链接，利用PCR扩增目的基因应选择的一对引物是 。 上游引物 下游引物 A 5'-…GAATTCATGACAGTTAGT…-3' 5'-…GGATCCTCACCGGCAGTA…-3' B 5'-…GGATCCATGACAGTTAGT…-3' 5'-…GAATTCTCACCGGCAGTA…-3' C 5'-…GAATTCTACTGTCAATCA…-3' 5'-…GGATCCAGTGGCCGTCAT…-3' D 5'-…GAATTCAGTGGCCGTCAT…-3' 5'-…GGATCCTACTGTCAATCA…-3' 【答案】(1) 真 毛霉菌死亡，腐乳发酵时间延长或失败 (2) 鉴别 单一毛霉孢子/单独接种M1、M2、M3和M4毛霉孢子的豆腐 M2M3 (3) 电融合 活力鉴定 分离纯化 染色体丢失或基因选择性表达 (4) 蛋白质/第二代基因 蛋白酶或脂肪酶 A 【分析】1、制作腐乳的主要微生物是毛霉，毛霉是异养需氧型真菌，孢子生殖。毛霉能产生脂肪酶和蛋白酶，脂肪在脂肪酶的作用下被分解生成脂肪酸和甘油，蛋白质在蛋白酶的作用下分解生成小分子肽和氨基酸。 2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。 【详解】（1）毛霉是异养需氧型真菌。酒精对细胞生长有抑制作用，所以卤汤中的酒精含量不能过高，否则会到导致毛霉菌死亡，腐乳发酵时间延长或导致腐乳制作失败。 （2）微生物产生蛋白酶并分泌到胞外后，能将酪素培养基中的酪素降解后形成透明圈，所以在酪素培养基上生长，且菌落周围有透明圈的微生物，就是能产生蛋白酶并分泌到胞外的微生物，酪素培养基是鉴别培养基。根据图1，接种的菌种有单一毛霉孢子M1、M2、M3、M4，也有各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合的菌种，本实验以各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合、接种于豆腐小块表面的为实验组，接种单一毛霉孢子M1、M2、M3和M4的豆腐小块为对照组，培养后测定各组蛋白酶活力和脂肪酶活力。根据下图1数据，M2M3组蛋白酶和脂肪酶的活力均较高，是本实验中最优的毛霉菌株组合。 （3）处理③过程为诱导原生质体融合，常用的物理方法有：电融合法、离心法；也可选择合适的化学方法如PEG诱导法。在诱导原生质体融合前，需要对原生质体进行活力鉴定。由于原生质体融合是随机的且达不到100%，所以在获得杂种毛霉后，往往还需要经过分离、纯化和鉴定。若用细胞工程得到的杂种毛霉没有达到预期的效果，其原因可能是融合后部分染色体丢失，或者是基因选择性表达导致的。 （4）图3的流程从预期M4菌株的功能出发→预期的蛋白质A功能→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→构建表达载体→改造M4菌株形成新的单菌株毛霉→获得预期产品，这属于蛋白质工程的范畴，蛋白质工程又称为第二代基因工程。改造M4菌株目的是为了获得活力更高的蛋白酶和脂肪酶，以更好的进行腐乳制作，所以A是指活力更高的蛋白酶或脂肪酶。PCR扩增时，引物与DNA模板的3’端结合，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸；若要在目的基因两端添加限制酶识别序列，可在设计引物时在引物的5'端加入相应限制酶的识别序列。图4中目的基因模板链的3'端应与启动子相连，是目的基因的上游，模板链的5'端应与终止子相连，是目的基因的下游，根据碱基互补配对原则，上游引物与模板链的3'端互补，且引物的5'端含有EcoRⅠ识别序列，为5'-…GAATTCATGACAGTTAGT…-3'；下游引物与编码链的3'端互补，且引物的5'端含有BamHⅠ识别序列，为5'-…GGATCCTCACCGGCAGTA…-3'，故选A。 5．（2024·浙江绍兴·模拟预测）叶酸是生物体内极其重要的维生素，化学性质不稳定，部分植物和微生物可以合成叶酸，人类则需额外补充。GCHI和ADCS是叶酸合成途径中两种重要的酶。研究人员通过RACE技术获得转录因子APBP2基因，并将其在粮食作物小麦中过量表达，结果显示转基因小麦中叶酸量显著提高，人类有望通过食用面包补充部分叶酸。回答下列问题： (1)RACE技术是一种基于PCR技术利用低含量的mRNA快速扩增DNA的有效方法，通过此技术获取大量APBP2基因需经逆转录和 两个基本过程，这两个过程需要逆转录和 酶。 (2)PCR的产物可通过凝胶电泳鉴定，由于APBP2基因在电泳缓冲液中带 电，电泳时加样孔一端应该靠近 极。电泳结果如图甲，其中1号泳道是DNAMarker的电泳结果，DNAMarker是一组已知长度和 的标准DNA片段混合物，2号泳道是以 为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组。含有APBP2基因条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA片段，从而达到 目的。    (3)为提高转录因子APBP2的表达量，研究人员构建了携带特异性强启动子的APBP2基因表达载体，如图乙。强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被 识别并结合，驱动基因的持续转录，该特异性启动子能使APBP2基因在小麦植株的 部位表达。 (4)将含重组Ti质粒的农杆菌和小麦愈伤组织混合培养一段时间，经过 后进行植物组织培养，在培养基中加入 进行筛选，此物质能抑制叶绿体和线粒体中蛋白质的合成，从而引起植物细胞死亡。愈伤组织是一种相对没有 的薄壁细胞团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成 ，再继续发育成转基因小麦株系。 (5)在小麦内过量表达转录因子APBP2可提高小麦叶酸量，推测APBP2基因在细胞内发挥的作用可能是 。 【答案】(1) DNA复制 TaqDNA聚合酶 (2) 负 负 含量 (提纯的)APBP2基因片段 提纯 (3) RNA聚合酶 种子(胚乳) (4) 去菌 G418 分化 胚状体 (5)增强GCHI和ADCS等基因的表达，促进叶酸合成 【分析】由题意可知，GCHI和ADCS是叶酸合成途径中两种重要的酶，在在小麦内过量表达转录因子APBP2可提高小麦叶酸量，水命APBP2基因过量表达可能增强GCHI和ADCS等基因的表达，促进叶酸合成。 【详解】（1）由题意可知，该技术用低含量的mRNA快速扩增DNA，理论上需经逆转录和（DNA）复制两个基本过程。逆转录需要逆转录酶催化，PCR（实质是体外DNA复制）需要TaqDNA聚合酶催化。 （2）在电泳缓冲液会使APBP2基因带负电，PCR扩增结束后需要对PCR产物进行检测，常采用电泳的方法，将装有凝胶的胶托从胶盒中取出，放入电泳槽内，加样孔一端朝向负极。DNAMarker是一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物，为阴性对照组，根据实验目的可知，2号泳道是以提纯的APBP2基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组，有实验结果可知，经PCR后获得了APBP2基因片段。含有APBP2基因条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA片段，从而达到提纯目的。 （3）启动子能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因的持续转录，由题意可知，APBP2基因在小麦中过量表达， 人类有望通过食用面包（其食材来源于植株的种子部分）补充部分叶酸，说明该特异性启动子能使APBP2基因在小麦植株的种子部分表达。 （4）将含重组Ti质粒的农杆菌和小麦愈伤组织混合培养一段时间，经过去除农杆菌后进行植物组织培养，由图可知，重组质粒中含有G418抗性基因，所以在培养基中加入G418进行筛选，此物质能抑制叶绿体和线粒体中蛋白质的合成，从而引起植物细胞死亡。愈伤组织是一种相对没有分化的薄壁细胞团，经诱导分化，愈伤组织可发育成胚状体，再发育为转基因植株。 （5）由题意可知，GCHI和ADCS是叶酸合成途径中两种重要的酶，在在小麦内过量表达转录因子APBP2可提高小麦叶酸量，推测APBP2基因在细胞内发挥的作用可能是增强GCHI和ADCS等基因的表达，促进叶酸合成。 6．（2024·浙江·模拟预测）CRISPR/Cas9基因编辑系统是由Cas9蛋白和向导RNA构成的复合体，可利用向导RNA识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目标DNA进行编辑，其过程如下图所示。利用该系统对某种野生食用真菌进行了DNA编辑，培育出转基因真菌。CRISPR/Cas9系统的相关基因能否成功转入受体细胞是遗传转化体系建立的重要前提。 (1)将真菌细胞置于一定浓度的PEG溶液中，一段时间后再与重组DNA混合可以提高转化效率，其中PEG的作用是 。在转基因真菌的培育中，一般以原生质体为主，极少尝试菌丝体和孢子，说明遗传转化体系中 的选择是制约转化效率的另一重要因素。 (2)野生型核基因组中含有pyrg、ura3基因，这两类基因表达可产生乳清核苷-5’-磷酸脱羧酶，参与催化尿嘧啶的合成，通过CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA与 基因中的序列进行 ，将Cas9蛋白带到靶基因附近并对基因进行剪切。当目标基因序列被破坏后，菌体表现为尿嘧啶营养缺陷，只能在含有 和5-氟乳清酸的培养基上正常生长，利用这种选择作用可以初步区分出野生型真菌及完成了转化的转基因品系。研究发现CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA序列长度应当适中否则极易脱靶即难以精准找到目标DNA序列，脱靶最可能的原因是 。 (3)Cas9蛋白和向导RNA基因在真菌细胞中表达水平低，可通过在基因一端添加合适的 来构建高表达基因编辑系统，还可以通过基因优化，使其转录产物中含有真菌细胞高频使用 ，以此来提高翻译效率。 (4)该食用菌是某种逆转录病毒的特定宿主，侵染时，病毒将 （填物质）注入食用菌细胞合成双链DNA片段，说明注入的酶可能具有①以病毒核酸为模板，催化 键的形成、②解开 的作用。这些功能的实现由酶分子相应的结构区域完成，体现了酶的 以及酶功能的复杂性。食用菌细胞中合成的这些DNA片段通过 进入细胞核内，并 （选填“随机”或者“定向”）整合到食用菌的核基因组中，使其发生 （填变异类型），进而引发食用菌减产。 (5)某些食用菌具有天然抗击该种逆转录病毒的能力，有同学指出，可能是因为这些食用菌中含有限制性内切核酸酶切割了病毒核酸，你认为这种推测合理吗？ ，请说明原因 。 【答案】(1) 增加细胞膜的通透性 受体细胞 (2) pyrg、ura3 互补（或特异性识别并结合） 尿嘧啶 其他基因序列中也有与向导RNA互补配对的序列，造成向导RNA错误结合到有关基因区域 (3) 启动子 密码子 (4) 病毒RNA、逆转录酶 磷酸二酯 DNA与RNA杂交片段中氢键 酶的专一性 核孔 随机 基因重组 (5) 不合理 因为逆转录病毒的遗传物质是RNA，而限制酶只能识别DNA中的特定碱基序列 【分析】根据题意分析可知，CRISPR/Cas9系统基因编辑技术，是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而出现脱靶现象。 【详解】（1）将真菌细胞置于一定浓度的PEG溶液中，一段时间后再与重组DNA混合可以提高转化效率，其中PEG的作用是增加细胞膜的通透性。在转基因真菌的培育中，一般以原生质体为主，极少尝试菌丝体和孢子，说明遗传转化体系中受体细胞的选择是制约转化效率的另一重要因素。 （2）基因编辑系统中的引导RNA能识别并通过碱基互补配对结合特定的DNA序列，野生型核基因组中含有pyrg、ura3基因，这两类基因表达可产生乳清核苷-5’-磷酸脱羧酶，参与催化尿嘧啶的合成，通过CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA与pyrg、ura3基因中的序列进行互补（或特异性识别并结合），将Cas9蛋白带到靶基因附近并对基因进行剪切。当目标基因序列被破坏后，菌体表现为尿嘧啶营养缺陷，所以只能在含有尿嘧啶和5-氟乳清酸的培养基上正常生长，利用这种选择作用可以初步区分出野生型真菌及完成了转化的转基因品系。研究发现CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA序列长度应当适中否则极易脱靶即难以精准找到目标DNA序列，脱靶最可能的原因是其他基因序列中也有与向导RNA互补配对的序列，造成向导RNA错误结合到有关基因区域。 （3）Cas9蛋白和向导RNA基因在真菌细胞中表达水平低，启动子是RNA聚合酶识别和结合位点，起始转录，所以可通过在基因一端添加合适的启动子来构建高表达基因编辑系统，还可以通过基因优化，使其转录产物中含有真菌细胞高频使用密码子，以此来提高翻译效率。 （4）该食用菌是某种逆转录病毒的特定宿主，侵染时，病毒将病毒RNA、逆转录酶注入食用菌细胞合成双链DNA片段，说明注入的酶可能具有①以病毒核酸为模板，催化磷酸二酯键的形成、②解开DNA与RNA杂交片段中氢键的作用。这些功能的实现由酶分子相应的结构区域完成，体现了酶的专一性以及酶功能的复杂性。食用菌细胞中合成的这些DNA片段通过核孔进入细胞核内，并随机整合到食用菌的核基因组中，使其发生基因重组，进而引发食用菌减产。 （5）某些食用菌具有天然抗击该种逆转录病毒的能力，有同学指出，可能是因为这些食用菌中含有限制性内切核酸酶切割了病毒核酸，这种推测不合理，原因是因为逆转录病毒的遗传物质是RNA，而限制酶只能识别DNA中的特定碱基序列。 7．（2024·浙江·三模）天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶二羧酸合成酶（DHDPS）是玉米赖氨酸合成途径中的关键酶。野生型玉米赖氨酸含量很低，科学家利用蛋白质工程技术将天冬氨酸激酶第352位苏氨酸替换为异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶第104位天冬酰胺替换为异亮氨酸，显著提高两种酶的活性，使玉米中赖氨酸含量提高数倍。回答下列问题： (1)将天冬氨酸激酶基因模板链中的单个碱基 替换为 ，可得到改造后的基因（苏氨酸的密码子为ACU、ACC、ACA、ACG，异亮氨酸的密码子为AUU、AUC、AUA）。将改造后的基因导入玉米细胞中，使玉米获得高活性天冬氨酸激酶。用 （写出1点即可）等物理或化学因素处理玉米种子也可能得到类似结果，但该育种方式具有一定的盲目性，因为基因突变具有 的特点。 (2)将改造后的AK基因（记为基因A）和改造后的DHDPS基因（记为基因D）导入玉米细胞，经组培获得高赖氨酸含量的植株甲、乙、丙，已知三个植株中的每个细胞中仅导入一个基因A和1个基因D。让植株甲、乙、丙分别自交，所得子代表型及比例如下： 亲本 子代表型及比例 甲 高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=9：7 乙 高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=3：1 丙 高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=1：1 （注：不考虑基突变和交叉互换） ①植株甲的子代中，低赖氨酸含量植株基因型有 种，高赖氨酸含量植株中纯合子占 。 ②为快速获得稳定遗传的高赖氨酸含量玉米，应取植株 （“乙”或“丙”）的 置于适宜培养基上培养，对全部幼苗进行染色体加倍处理，最终所得纯合植株中高赖氨酸含量个体占 。 ③若植株乙和植株丙进行杂交，所得子代表型及比例为 。 (3)分别提取野生型玉米和第（2）小题中植株甲的DNA，用下图所示引物1和引物2进行PCR扩增，用限制酶A充分切割扩增产物，之后进行凝胶电泳，已知图乙泳道1对应野生型玉米，请在图乙泳道2中画出植株甲对应的结果 。    【答案】(1) G A 射线X射线/γ射线/紫外线/激光/温度剧变/亚硝酸/碱基类似物/硫酸二乙酯/苯/石棉/砷化物等（注：不能写生物因素） 多方向性/不定向性 (2) 5 1/9 乙 花药/花粉 1/2 高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=1：1 (3)   【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工 程，是包含多学科的综合科技工程领域。 【详解】（1）苏氨酸的密码子为ACU、ACC、ACA、ACG，异亮氨酸的密码子为AUU、AUC、AUA，苏氨酸替换为异亮氨酸，且只替换一个碱基，苏氨酸的密码子可写为ACU（C、A），异亮氨酸的密码子可写为AUU（C、A），故只用替换中间的碱基就可以，苏氨酸对应模板链的碱基为TGA（G、T），异亮氨酸对应模板链的碱基为TAA（G、T），故将天冬氨酸激酶基因模板链中的单个碱基G替换为A，改造后得到基因。将改造后的基因导入玉米细胞中，使玉米获得高活性天冬氨酸激酶。用射线X射线/γ射线/紫外线/激光/温度剧变/亚硝酸/碱基类似物/硫酸二乙酯/苯/石棉/砷化物等等物理或化学因素处理玉米种子也可能得到类似结果，但该育种方式具有一定的盲目性，因为基因突变具有多方向性/不定向性的特点。 （2）若将没有A、D的染色体上的基因表示为a、d ①甲自交子代中高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=9：7，说明甲中A、D基因位于非同源染色体上，独立遗传，遵循基因的自由组合定律，则植株甲的基因型为AaDd,子代中高赖氨酸含量的基因型为A-D-，低赖氨酸含量的基因型为AAdd，Aadd、aaDD、aaDd、,aadd共5种，高赖氨酸含量中只有AADD一种纯合子，纯合子植株占1/9。 ②乙自交子代中高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=3：1，由此可推断出乙中A、D位于一对同源染色体上，且A、D在一条染色体，a、d在一条染色体；丙自交子代中高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=1：1，由此可推断出乙中A、D位于一对同源染色体上，且A、d在一条染色体，a、D在一条染色体，为快速获得稳定遗传的高赖氨酸含量玉米，应取植株乙的花药/花粉置于适宜培养基上培养，对全部幼苗进行染色体加倍处理，乙的花粉的类型为AD、ad=1:1,故最终所得纯合植株中高赖氨酸含量个体占1/2。 ③乙自交子代中高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=3：1，由此可推断出乙中A、D位于一对同源染色体上，且A、D在一条染色体，a、d在一条染色体；丙自交子代中高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=1：1，由此可推断出乙中A、D位于一对同源染色体上，且A、d在一条染色体，a、D在一条染色体，植株乙产生的配子为AD：ad=1:1，植株丙产生的配子为Ad:aD=1:1，子代为AaDD（高赖氨酸含量）：aaDd（低赖氨酸含量）：AADd（高赖氨酸含量）：Aadd（低赖氨酸含量）=1:1:1:1，故后代的表型及比例为高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=1：1。 （3）若将没有A、D的染色体上的基因表示为a、d，甲自交子代中高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=9：7，说明甲中A、D基因位于非同源染色体上，独立遗传，遵循基因的自由组合定律，则植株甲的基因型为AaDd,本小题，只针对DHDPS基因，故甲的基因型为Dd，对甲植株的DNA，用下图所示引物1和引物2进行PCR扩增，用限制酶A充分切割扩增产物，之后进行凝胶电泳，已知图乙泳道1对应野生型玉米，植株甲中有d基因故有一条与野生型玉米一样的条带，限制酶A的位点位于基因的中间将D基因进行了切割产生了小片段，故迁移的速度要快，出现另外两条迁移速度不同的条带，且比野生型的迁移速度快。 8．（2024·浙江绍兴·模拟预测）果蔬生产过程中，农药、化肥、土壤微生物等均可产生NO（一氧化氮），NO作为一种气体信号分子对植物的生命活动产生一定影响；NO同时也是重要的环境响应因子，在植物的抗逆境生理中发挥重要作用。某研究小组为探究NO对某果蔬植株光合作用强度的影响进行了如下实验。实验中用SNP（硝普钠）作为NO的供体。回答下列问题。 (1)实验中测定了叶片的NO含量、叶绿素和类胡萝卜素含量、气孔导度，结果如图1。测定色素含量时，需用 提取色素并测定含量。提取液中的叶绿素主要吸收 光。相较于甲组，推测乙组叶片的光合作用强度较弱，依据是 。 (2)进一步检测发现，转录因子（HY5）基因敲除的植株叶绿素含量下降。PORC基因是叶绿素合成的关键基因，推测HY5蛋白可直接结合PORC基因的启动子调控其转录。为研究HY5基因与PORC基因的关系，研究者利用亮氨酸合成缺陷型酵母菌进行相关转基因实验，其操作步骤如下。 ①先将载体1导入亮氨酸缺陷型酵母细胞，但始终无法在添加金担子素（AbA，一种抗生素）和亮氨酸的培养基上获得重组酵母菌菌落，因此，可采过 技术筛选出重组酵母细胞。 ②再将载体2导入①步骤获得的重组酵母细胞，接种到选择培养基上，能筛选获得如图2所示的重组酵母细胞。关于该选择培养基的配方正确是 。 A．加亮氨酸和AbA    B．不加亮氨酸加AbA C．不加亮氨酸和AbA  D．加亮氨酸不加AbA ③据此分析步骤①中培养基上无法培养得到菌落的原因是 。 (3)已知NO不直接影响PORC基因的表达也不影响其表达产物的活性，综合上述研究，阐明NO降低植物叶绿素的可能机制： 叶绿素合成减少。 (4)NO作为环境响应因子，还能通过抑制需氧呼吸中 、三羧酸（TCA）循环、电子传递链途径中关键酶的活性，抑制了呼吸速率，延缓了植物衰老，此功能与 （植物激素）的作用相互拮抗。 【答案】(1) 有机溶剂 红光和蓝紫光 叶绿素和类胡萝卜素含量较低，光反应较弱；气孔导度小影响CO2吸收，碳反应弱 (2) PCR/核酸分子杂交和电泳 B 无HY5蛋白作用于PORC基因启动子，导致AbAr基因无法表达对/金担子素无抗性 (3)NO抑制HY5基因的表达，导致P0RC基因转录减少/PORC含量下降 (4) 糖酵解 乙烯 【分析】1、叶绿体色素的提取和分离实验：①提取色素原理：色素能溶解在酒精或丙酮等有机溶剂中，所以可用无水乙醇等提取色素。②分离色素原理：各色素随层析液在滤纸上扩散速度不同，从而分离色素。溶解度大，扩散速度快；溶解度小，扩散速度慢。③各物质作用：无水乙醇或丙酮：提取色素；层析液：分离色素；二氧化硅：使研磨得充分；碳酸钙：防止研磨中叶绿素被破坏。④结果：滤纸条从上到下依次是：胡萝卜素（最窄）、叶黄素、叶绿素a（最宽）、叶绿素b（第2宽），色素带的宽窄与色素含量相关。 2、色素的作用：叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，类胡萝卜素主要吸收蓝紫光。 【详解】（1）色素能溶解在酒精或丙酮等有机溶剂中，所以可用无水乙醇等提取色素。叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，类胡萝卜素主要吸收蓝紫光。根据图示结果可知，与甲组相比，乙组叶片中光合色素含量低，抑制光反应，气孔导度变小，可以减少水分的蒸发，响应干旱胁迫，但是会抑制二氧化碳的吸收，影响暗反应过程，从而直接影响光合速率。 （2）①筛选出重组酵母细胞的方法是DNA分子杂交技术或PCR或电泳。 ②如果H基因的表达产物是D基因的转录因子，该细胞亮氨酸缺陷型酵母细胞，因此培养基中不加亮氨酸，而加入AbA（金担子素），由于H基因存在，H基因表达的产物启动D基因表达，进而使金担子素抗性基因表达，对金担子素表现出抗性而出现菌落，B正确。 故选B。 ③先将载体1导入亮氨酸缺陷型酵母细胞，但始终无法在添加金担子素和亮氨酸的培养基上获得重组酵母菌菌落，这是因为重组酵母菌菌落中无HY5蛋白作用于PORC基因启动子，导致AbAr基因无法表达，对金担子素无抗性。 （3）NO不直接影响PORC基因的表达也不影响其表达产物的活性，但NO可能会抑制HY5基因的表达，导致PORC基因转录减少，使PORC含量下降，这可能是NO降低植物叶绿素的可能机制。 （4）糖酵解是需氧呼吸的第一阶段，NO通过抑制需氧呼吸中糖酵解、三羧酸（TCA）循环、电子传递链途径中关键酶的活性，抑制了呼吸速率。乙烯主要作用是促进果实成熟，促进老叶等器官脱落的作用，NO能够延缓植物衰老，此功能与乙烯的作用相互拮抗。 9．（2024·浙江杭州·模拟预测）为使甘蓝具有抗除草能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。（见图1，注：BamHI识别的序列是G↓GATCC；BgⅢ识别的序列是A↓GATCT，EcoRI识别的序列是C↓AATTC）    (1)利用PCR扩增草甘膦抗性基因时，需要在引物的 （填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，原因可能是 （答2条）。 (2)构建表达载体时切割质粒应选择 酶切。酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用 酶对两种重组质粒进行剪切，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小进行区分，电泳结果出现长度为 的片段即为所需基因表达载体。 (3)步骤②将重组质粒与经 处理农杆菌的混合，完成转化后先置于 培养基中培养，其目的是 。再将菌液涂布在含有抗生素的固体培养基中进行筛选。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在培养基中添加 以便筛选出含目的基因的甘蓝愈伤组织。 (4)基因芯片技术是一种能有效地对转基因作物进行检测的新技术，通常被检测的特定DNA序列包括两类：一类是非目的基因序列，主要为载体上通常具有的各种组成元件；另一类则是目的基因序列本身。使用方法如下：第一步，针对待测的特定DNA片段设计引物，扩增出的特定DNA片段带上标记制成探针，经变性后通过芯片点样仪固定到杂交膜上，再经过一定的处理，便得到可用于检测的DNA芯片（见图2）；第二步，从待测植物中提取DNA作为模板，加入引物进行扩增；第三步，将扩增产物经过变性处理后铺于芯片表面，放入杂交盒中，在适宜条件下进行杂交；第四步，待反应结束后，对芯片进行清洗等处理，用仪器检测芯片上的杂交结果。    利用基因芯片可检测特定DNA序列依据的是 原则。对抗草甘膦转基因甘蓝进行检测的基因芯片的阵列设计为：第1列为空白对照，第2列固定甘蓝植株的内源基因作为阳性对照，第3列固定与甘蓝DNA序列高度 （填“同源”或“非同源”）的DNA片段作为阴性对照，第4~6列可分别固定 、 和潮霉素抗性基因进行检测，每列重复多次以保证结果的准确性。若该基因芯片检测有效，转基因甘蓝的样本在芯片的第 列上均应出现检测信号。 (5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。 【答案】(1) 5'端 引物较短，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA片段；复性温度过低，出现非特异性扩增条带；杂DNA污染 (2) BamHI BamHI和EcoRI 45kb (3) CaCl2 LB液 使处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态，便于筛选 潮霉素 (4) 碱基互补配对 非同源 草甘膦抗性基因 启动子（或终止子） 2456 (5) 目的基因的表达量 基因污染 【分析】PCR原理:在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 【详解】（1）在利用PCR扩增草甘膦抗性基因时，需要在引物的5′端添加限制酶识别序列，以确保扩增产物能与载体正确连接。如果产物中除了目的基因外还有其他DNA片段存在，可能的原因包括引物较短，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA片段；复性温度过低，出现非特异性扩增条带；杂DNA污染。 （2）据图表可知，BamHI酶切割得到的黏性末端为-GATC，BgⅢ酶切割得到的黏性末端为-GATC，其黏性末端相同，故剪切后的目的基因能与质粒连接在一起，重组质粒形成后，在重组质粒上，不再有BgⅢ酶的识别位点，质粒上的切割位点会有EcoRI酶和BamHI酶，目的基因的编码顺序是从BamHⅠ酶到BgⅢ酶，用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶会将正向连接的目的基因片段剪切去除；正向连接的重组质粒会被切去20+25=45kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去20kb长度的片段，根据电泳凝胶时，DNA分子量越大，在凝胶中收到的阻力越大，迁移距离越短的特点，故正向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小介于反向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小之间，所以电泳结果出现长度为45kb长度的片段即为所需基因表达载体。 （3）据图分析可知，步骤②是将重组质粒导入农杆菌的过程，需要使用CaCl2处理微生物细胞使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态。当将重组质粒与经CaCl2处理农杆菌的混合，完成转化后先置于LB液培养基中培养，使处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态，便于筛选。由图可知，标记基因是潮霉素抗性基因，因此要筛选获得含有基因表达载体的农杆菌需要在培养基中添加潮霉素，才能筛选出含目的基因的甘蓝愈伤组织。 （4）利用基因芯片可检测特定DNA序列依据的是碱基互补配对原则。对抗草甘膦转基因甘蓝进行基因检测时，需要设置不含草甘膦抗性基因的对照组，由于启动子可调控草甘膦抗性基因的表达，故启动子的序列也需要检测，因此基因芯片的阵列设计为：第1列为空白对照，第2列固定甘蓝植株的内源基因作为阳性对照，第3列固定与甘蓝DNA序列高度非同源的DNA片段作为阴性对照，第4~6列可分别固定草甘膦抗性基因、启动子（或终止子、标记基因）和潮霉素抗性基因进行检测，每列重复多次以保证结果的准确性。若该基因芯片检测有效，转基因甘蓝的样本在芯片的第2456列上均应出现检测信号。 （5）因每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量；且叶绿体基因位于细胞质中，一般不能稳定遗传，因此可避免基因污染。 10．（2024·浙江·模拟预测）小麦是雌雄同花植物。科研人员偶然发现一株高秆雄性不育小麦（甲），其雄性不育受显性基因M控制，另有一株矮秆可育小麦（乙），株高由A、a基因控制。科研人员进行了以下实验： 杂交一：甲×乙→F1矮秆雄性不育：矮秆雄性可育=1∶1 杂交二：F1中的矮秆雄性不育×高秆雄性可育（野生型）→F2矮秆雄性可育：高秆雄性不育=1：1回答下列问题： (1)A、a基因的根本区别是 ，其显性现象的表现形式是 。 (2)杂交一实验中甲作为 （父本/母本）。根据杂交一、二实验结果可知，甲和乙的基因型分别为 、 ，两对等位基因的遗传 （遵循/不遵循）自由组合定律。 (3)假设让实验二的F2自由交配，后代中高秆雄性可育植株占 。 (4)研究发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且M及其等位基因的编码区相同；为研究该序列与雄性不育之间的关系，科研人员在野生型小麦中获得了M等位基因的启动子并利用Ti质粒构建表达载体，部分结构如下图所示，GFP表达后会发出绿色荧光。将载体转入小麦幼胚，获得转基因植株，对植株表型和M基因表达情况进行鉴定。 a．通用的强启动子b．M等位基因启动子c．插入TRIM序列的M等位基因启动子d．M编码区e．M基因f．无关基因 实验材料 转入载体组成I、II 植株表型 M基因表达情况 雄性不育小麦 - 雄性不育 仅在花药发育早期表达，在根、 茎、叶、雌蕊中均不表达 野生型小麦 - 可育 在花药发育各时期均不表达，在 根、茎、叶、雌蕊中均不表达 野生型小麦 ad 死亡 - 野生型小麦 ①________ ②________ 仅在花药发育早期表达，在 根、茎、叶、雌蕊中均不表达 （1）表中①处转入的载体组成为 （从a~f中选择），②处植株表型为 。 （2）在存活的转基因小麦花药中特异性检测到绿色荧光。根据实验结果推测导致雄性不育的原因是 。 【答案】(1) 碱基序列不同 完全显性 (2) 母本 aaMm AAmm 不遵循 (3)1/4 (4) cd 雄性不育 TRIM插入引起启动子序列改变，导致M基因在花药发育的早期表达 【分析】据题干信息分析，本实验的实验目的是研究TRIM序列与雄性不育之间的关系，自变量是野生型小麦是否携带有TRIM序列，检测指标是植株的表型（雄性是否不育）以及M基因的表达情况。 【详解】（1）A、a为等位基因，等位基因的区别在于碱基的排列顺序不同。株高由A、a基因控制，只有高杆和矮杆性状，说明A对a为完全显性。 （2）甲为高秆雄性不育，只能作为母本。高杆和矮杆杂交后代都是矮杆，则矮杆为显性，因此甲的基因型是aaMm，乙的基因型为AAmm。杂交二中亲本的基因型为AaMm×aamm，后代的表现型及比例为1:1，没有表现出1:1:1:1，说明两对等位基因位于同源染色体上，A与m基因连锁，两对等位基因不遵循基因的自由组合定律。 （3）实验二的F2的基因型及比例为Aamm：aaMm=1:1，自由交配产生的雌配子及比例为Am：am：aM=1：2：1，产生的雄配子及比例为Am：am=1:1，则后代中高秆雄性可育植株（aamm）占1/2×1/2=1/4。 （4）本实验的实验目的是研究TRIM序列与雄性不育之间的关系，因此野生型小麦需要选择插入TRIM序列的M等位基因启动子，即c，TRIM序列的M等位基因启动子的作用是启动M基因的表达的，因此在构建载体组成I、Ⅱ时需要在插入TRIM序列的M等位基因启动子之后加入M编码区，故表中①处应分别选择c、d。已知所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且第一组实验结果和第四组的实验结果中M基因表达情况是相同的，因此②处植株表型是雄性不育。第二组实验野生型小麦M基因在花药发育各时期均不表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达，而第四组和第一组雄性不育植株中M基因仅在花药发育早期表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达，综上推测导致雄性不育的原因是TRIM序列的插入引起启动子序列改变，导致M基因在花药发育早期表达。 11．（2024·浙江·三模）干旱胁迫会引起植物细胞内重要生理代谢途径紊乱，如细胞呼吸电子传递链受损、光反应中电子散逸，细胞内活性氧自由基（ROS）积累等，因此干旱胁迫下ROS对膜脂质、蛋白质及DNA等的氧化损伤是植物损伤的重要方式。Lon1蛋白具有降低叶绿体和线粒体内ROS产生，维护细胞正常代谢的功能。某研究团队以耐干旱胁迫突出的“夏普蓝”蓝莓为材料，构建了如下图所示表达载体，导入烟草后以研究Lon1蛋白在植物应对干旱胁迫时的相关功能。回答下列问题： 注：1.KpnⅠ和SmaⅠ为限制酶，CaMV35S表示启动子，Lon1为目的基因。2.Gus基因表达产物能催化无色X-Gluc生成蓝色物质，植物无此基因。3.左右边界之间的区段表示T-DNA片段。 (1)获取目的基因及构建重组表达载体。通过检索基因数据库，获得蓝莓 ，以此设计引物并在引物的5’端添加 。由图可知，SmaⅠ识别位点位于目的基因模板链的 端。PCR扩增产物可用电泳技术分离后将含有 切割下来以便回收并提纯。 (2)利用农杆菌转化烟草细胞及培育转基因植株。使用的外植体是带有伤口的叶圆片，将重组的农杆菌和叶圆片共培养一段时间，该过程需控制好 （答两点）和pH、温度等环境条件，以保证外植体的存活率和转化率均较高。将共培养后的叶圆片转入添加适当抗生素的培养基上培养，目的是 。培养基中还含有 （答两点）等有机成分及植物生长调节剂来调控叶圆片细胞脱分化、再分化过程，从而得到转基因烟草植株。 (3)筛选转基因烟草植株及耐旱特性观察鉴定。选取转基因烟草叶片，将其置于含 的鉴别培养基中染色，若叶片出现蓝色斑点即为转基因烟草转化成功。染色前需对叶片进行 处理，以防对结果产生干扰。将转基因烟草叶片，一组置于添加10% PEG的MS培养基中培养，另一组置于未添加PEG的MS培养基中培养。添加10% PEG的作用是 。另取野生型烟草叶片作为对照。 (4)电镜下显示正常培养的烟草细胞叶绿体、线粒体形态结构完整。添加PEG的野生型烟草细胞出现叶绿体基粒片层结构模糊，线粒体变形嵴断裂等现象，而添加PEG的转基因烟草细胞未出现上述现象；检测各组植株叶绿素相对含量，结果如下图。推测干旱胁迫下Lon1蛋白可能是通过 ，来维护光合作用的正常进行，从而抵御干旱。 【答案】(1) Lon1基因序列 相应的限制酶识别序列 3’ 目的基因条带的凝胶 (2) 农杆菌的浓度、共培养的时间等 杀死农杆菌并筛选含有目的基因的植物细胞 糖类、氨基酸、维生素等 (3) X-Gluc 脱色 模拟干旱环境/提供干旱胁迫环境 (4)稳定叶绿体基粒片层的结构/减少对叶绿体基粒结构的破坏、维持叶绿素含量/减缓叶绿素含量下降 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）结合题干可知，基因工程需要导入的目的基因为蓝莓的Lon1基因序列，以此设计引物并在引物的5’端添加相应的限制酶识别序列，使得目的基因和载体能从产生相同的黏性末端进行互补配对。转录的方向是从启动子到终止子，结合题图中限制酶识别序列的顺序可知SmaⅠ识别位点位于目的基因模板链的3’端（转录出来的mRNA安5，→3，方向进行）。PCR扩增产物可用电泳技术分离后将含有目的基因条带的凝胶切割下来以便回收并提纯。 （2）利用农杆菌转化烟草细胞及培育转基因植株。使用的外植体是带有伤口的叶圆片，将重组的农杆菌和叶圆片共培养一段时间，该过程需控制好农杆菌的浓度、共培养的时间、和pH、温度等环境条件，以保证外植体的存活率和转化率均较高。将共培养后的叶圆片转入添加适当抗生素的培养基上培养，目的是杀死农杆菌并筛选含有目的基因的植物细胞。培养基中还含有糖类、氨基酸、维生素等等有机成分及植物生长调节剂来调控叶圆片细胞脱分化、再分化过程，从而得到转基因烟草植株。 （3）Gus基因表达产物能催化无色X-Gluc生成蓝色物质，植物无此基因，故筛选转基因烟草植株及耐旱特性观察鉴定。选取转基因烟草叶片，将其置于含X-Gluc的鉴别培养基中染色，若叶片出现蓝色斑点即为转基因烟草转化成功。染色前需对叶片进行脱色处理，以防对结果产生干扰。将转基因烟草叶片，一组置于添加10% PEG的MS培养基中培养，另一组置于未添加PEG的MS培养基中培养。添加10% PEG的作用是模拟干旱环境（提供干旱胁迫环境）。另取野生型烟草叶片作为对照。 （4）添加PEG的野生型烟草细胞出现叶绿体基粒片层结构模糊，线粒体变形嵴断裂等现象，而添加PEG的转基因烟草细胞未出现上述现象，叶绿素含量：正常组的野生型烟草叶绿素含量高于转基因烟草，PEG处理组的野生型烟草叶绿素含量少于转基因烟草，经PEG处理后野生型烟草叶绿素含量减少，转基因烟草叶绿素含量增加，推测干旱胁迫下Lon1蛋白可能是通过稳定叶绿体基粒片层的结构/减少对叶绿体基粒结构的破坏、维持叶绿素含量（减缓叶绿素含量下降），来维护光合作用的正常进行，从而抵御干旱。 12．（2024·浙江·模拟预测）莫内林是从一种西非植物的浆果中分离提纯到的甜味蛋白，甜度是蔗糖的3000倍左右。下图1所示利用大肠杆菌生产莫内林，其中M基因可表达合成莫内林。表1是为PCR扩增M基因设计的引物，画线部分是所需使用的限制性内切核酸酶的识别序列。 Ampr为氨苄青霉素抗性基因，氨苄青霉素可抑制细菌细胞壁的形成，对真核生物生长无影响 限制性内切核酸酶识别序列及切割位点：BamHI：5’-G↓GATCC-3’   XhoI：5’-C↓TCGAG-3’   Sau3AI：5’-↓GATC-3’   SacI：5’-GAGCT↓C-3’ 引物1 5’GGAATTCCTCGAGGGCGAATGGGAAATTATCG3’ 引物2 5’TTTGGATCCTTACGGCGGCGGAACCGGAC3’ (1)若选用XhoI和Sau3AI对质粒A进行切割，为实现其与目的基因的连接，可在目的基因两端添加 。引物1的结合位点可能在 （选填图1中的编号）。引物1的画线部分序列在A中 （有/没有），引物2画线部分的序列在B中 （有/没有）的可能性较高。 (2)已知C中的培养基成分有水、酵母粉、蛋白胨和氯化钠，并按一定比例添加氨苄青霉素。将C中有生长优势的菌落经多次 后作为菌种在发酵罐中培养，积累产物，发酵罐中培养基成分与C中培养基相较可不添加 ，并采用 的方法对装填在发酵罐中的培养基灭菌。 (3)通过大肠杆菌生产的莫内林甜度较天然莫内林大为降低，天然莫内林也易因温度等因素导致甜度降低甚至甜味消失，科学家分析其中的原因并进行了后续的工程学改造，请结合所学知识，分析两种莫内林甜度降低的原因分别是 。 (4)针对上述问题，从分子水平对蛋白质进行改造是解决莫内林甜度降低的工程学思路。以甜味蛋白质的三维结构为基础，选择影响其与受体相互作用的关键氨基酸残基，进行定点突变，将获取的新基因与酵母质粒中构建 ，导入到真核细胞如甲醇营养型毕赤酵母中，并评价突变体的功能，筛选能产生 等优良性能的甜味蛋白质的菌种。研究结果表明，相对于天然的野生型甜味蛋白质monellin，突变体E2N/E23A的甜味均提高了约3倍左右，而突变体E2N/E23A的热稳定性(Tm值)提高了约10℃。 (5)接上题，与大肠杆菌转化不同，毕赤酵母转化前一般先用低温山梨醇溶液处理，使其处于一种 的生理状态；同时需将外源DNA处理成线性，分析原因可能是 。转化后的毕赤酵母进行发酵培养分为两个阶段：生长阶段，以甘油为碳源、获取大量的功能性细胞；诱导阶段，通过添加甲醇来诱导表达重组蛋白。培养基中除加入甘油、甲醇外，还需要提供的营养物质有 。 【答案】(1) ①XhoI和BamHI的识别序列 ②或③ 有 没有 (2) 扩大培养 氨苄青霉素和琼脂 从底部通入高温蒸汽/（通入）高温蒸汽 (3)大肠杆菌生产的莫内林甜度降低，可能是因其为原核生物，细胞无法加工修饰合成的莫内林，分子结构与植物中的天然莫内林有差异。因天然莫内林是蛋白质，容易受到温度等条件的影响改变结构，导致甜度下降甚至甜味消失。 (4) 表达载体/重组DNA/重组质粒 甜味度好、稳定性强 (5) 能吸收周围环境中DNA分子（感受态） 将环状质粒（表达载体、重组DNA）酶切成线性，便于整合在酵母染色体上且稳定存在 氮源、无机盐、水 【分析】PCR原理:在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。 【详解】（1） 若选用XhoI和Sau3AI对质粒A进行切割，为实现其与目的基因的连接，需要用XhoI和Sau3AI对目的基因进行切割，但是目的基因内部存在Sau3AI的识别序列无法使用，因此可采用BamHI代替Sau3AI，因此可在目的基因两端添加XhoI和BamHI的识别序列。 DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸子链，因此要想PCR扩增出M基因，引物1的结合位点可能在②或③。 画线部分是所需使用的限制性内切核酸酶的识别序列，PCR出的M基因中含有该限制性内切核酸酶的识别序列，那么要想M基因能连接在质粒中，那么质粒A中也应该有该序列，因为M基因和质粒用同种限制酶切割，因此连接之后的重组质粒B中也含有该酶的识别序列。 （2）在工业化生产时发酵罐中需要大量菌种，因此需要再接种之前，对生长优势的菌落经多次扩大培养。 氨苄青霉素属于抗菌药物，但在发酵过程中培养基和发酵罐已经灭菌，且发酵条件只适合发酵所需菌种生长，因此发酵罐中培养基成分可去掉氨苄青霉素，发酵过程要得到大量发酵产物，常用液体培养基，因此也可以去掉琼脂。对装填在发酵罐中的培养基灭菌可以采用从底部通入高温蒸汽/（通入）高温蒸汽。 （3）根据原核生物没有复杂的细胞器，并且莫内林化学本质为蛋白质，可推测两种莫内林甜度降低的原因分别是大肠杆菌生产的莫内林甜度降低，可能是因其为原核生物，细胞无法加工修饰合成的莫内林，分子结构与植物中的天然莫内林有差异。因天然莫内林是蛋白质，容易受到温度等条件的影响改变结构，导致甜度下降甚至甜味消失。 （4）根据基因工程操作过程，在导入受体细胞之前需要将获取的新基因与酵母质粒中构建表达载体/重组DNA/重组质粒，然后导入到真核细胞如甲醇营养型毕赤酵母中，并评价突变体的功能，筛选能产生甜味度好、稳定性强等优良性能的甜味蛋白质的菌种。 （5）可根据大肠杆菌的转化条件，猜测毕赤酵母转化前一般先用低温山梨醇溶液处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子（感受态），因为酵母菌是真核生物，核DNA分子是线状，因此需将外源DNA处理成线性，便于整合在酵母染色体上且稳定存在。培养基中除加入甘油、甲醇外，还需要提供的营养物质有氮源、无机盐、水。 13．（2024·浙江·三模）葡萄是两性花植株。无核葡萄品质优良，但抗寒性差，中国野生山葡萄具有较强抗寒性。回答下列问题： Ⅰ．利用中国野生山葡萄培育抗寒无核葡萄品种 (1)人工杂交。研究者对无核种子败育型（经过授粉受精，胚和胚乳一段时间后停止发育）葡萄植株进行 、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的 ，完成杂交。 (2)胚离体培养。杂交后7-10天，剪取子房经75%乙醇或 消毒后，用 多次冲洗，用解剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。 Ⅱ．利用基因工程技术对抗寒相关D基因的功能展开相关研究 (3)科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中，如下图所示。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。 ①为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的 组，此外还需额外添加 ，通过显色反应做进一步验证。 A组：加色氨酸和组氨酸 B组：不加色氨酸和组氨酸 C组：加组氨酸，不加色氨酸 D组：加色氨酸，不加组氨酸 ②实验结果表明抗寒相关D基因编码的蛋白质具有转录激活功能，完善实验分组及预期实验结果。 对照组1：酵母菌导入pG-GAL4重组载体，实验结果：有菌落，变蓝。 对照组2：酵母菌导入 ，实验结果： 。 实验组：酵母菌导入 ，实验结果： 。 (4)将抗寒相关D基因导入无核葡萄植株中，研究者常构建含D基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，用含 的培养基筛选愈伤组织，用PCR方法筛选出 植株，72小时 诱导培养，检测植株中D蛋白的含量以判断抗寒能力。 【答案】(1) 去雄 成熟花粉 (2) 次氯酸钠或氧化汞 无菌水 (3) B X-a-gal pG载体 无菌落，不变蓝 pG-D重组载体 有菌落，变蓝 (4) 除草剂 含D基因阳性 低温 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建： 是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞： 根据受体细胞不同，导入的方法也不—样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）葡萄植株在开花前进行去雄、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的成熟花粉，完成杂交。 （2）胚离体培养。杂交后7-10天，剪取子房经75%乙醇或次氯酸钠或氧化汞消毒后，用无菌水多次冲洗，用解剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。 （3）①依据题干信息，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，为了能够筛选得到重组酵母，重组的载体中含有编码色氨酸合成酶的基因和具有转录激活功能的Va基因，AH109菌株的基因中含有HIS3基因可以编码组氨酸合成酶，所以若重组成功，就可以合成色氨酸和组氨酸，所以培养基配方中无需添加色氨酸和组氨酸，即B组；若用显色反应进行验证，依据题干信息，MEL1基因可以编码α-半乳糖苷酶，可分解X-α-gal产生蓝色物质，所以培养基中需额外添加X-α-gal。②依据图示信息，实验分为三组：对照组1是导入pG-GAL4重组载体，对照组2是只导入PG载体，实验组是导入pG-Va重组载体，对照组1导入pG-GAL4重组载体，含有MEL1基因、HIS3基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落；对照组2只导入PG载体，无菌落接种，且不含有MEL1基因，所以不会出现蓝色物质，也无菌落生长；实验组导入pG-Va重组载体，也含有MEL1基因、HIS3基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落。 （4）构建了含D基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，用农杆菌转化法进行转染。后续的实验操作（即目的基因的检测与鉴定）为：用含除草剂的培养基筛选愈伤组织，用PCR方法筛选出含D基因阳性植株，72小时低温诱导培养，检测植株中D蛋白的含量以判断抗寒能力。 14．（2024·浙江·三模）农杆菌转化法存在单个Ti质粒可承载外源基因大小有限的不足，研究人员通过改进转化过程，获得了抗虫牧草。表为实验所用菌株和质粒特性，图为质粒2的T-DNA片段基因和限制酶识别序列分布。 实验农杆菌和质粒特性 菌株 E 含有利福平抗性基因 质粒 1 质粒 2 含有链霉素抗性基因和 Vir基因，无T-DNA 片段 含有卡那霉素抗性基因，无Vir基因，有T-DNA 片段 备注：利福平、链霉素和卡那霉素都是抗生素， Vir 基 因在特定物质下表达， 其产物是 T-DNA 片段转入植物 细胞的必需物质。有无 T-DNA 片段不影响质粒其他基因的表达。 回答下列问题： (1)愈伤组织获取。选取牧草种子后，剥去外壳，70%乙醇消毒后，用 冲洗，接种在培养基中，通过 和细胞增殖，获得愈伤组织。 (2)构建重组载体和转化农杆菌。选用限制酶 对质粒2进行酶切，目的是保留潮霉素抗性和 。用 处理农杆菌后，将其与质粒1和质粒2共培养一段时间。将转化后的农杆菌接种到含有 的培养基中培养，一段时间后，挑取单克隆培养物，接种到不含抗生素的培养基中培养一段时间。采用双质粒转化农杆菌的优点是 。 (3)转基因愈伤组织的获取。将重组农杆菌分别接种至含乙酰丁香酮（AS）和不含AS的培养基中预培养，再与愈伤组织共培养3天，然后取少量愈伤组织接种到不同浓度潮霉素的培养基中培养30分钟，结果如表所示。 表不同浓度潮霉素对愈伤组织存活率的影响 潮霉素浓度（mg/L） 0 20 40 60 80 不含 AS 组存活率（%） 93 86 23 0 0 含 AS 组存活率（%） 93 90 77 15 0 由表2可知，AS的作用是 ，应选用 的潮霉素浓度作为筛选浓度对所有转化后愈伤组织进行筛选。 (4)抗虫牧草的鉴定。将愈伤组织接种至分化培养基培养至幼苗，经炼苗后，转移至移植到土壤中培育，获得抗虫牧草甲、乙、丙。取三组牧草的适量叶片细胞，提取总DNA。以抗虫基因的特异序列和叶肉细胞自身基因的特异序列分别做2对引物，PCR扩增后进行 ，结果显示植株甲、丙成功导入抗虫基因，组1和组2分别是阴性对照和阳性对照，请在电泳结果图2上绘制组1和组2的电泳结果 。植株甲和丙不能立即推广种植，原因是 。 【答案】(1) 无菌水 脱分化 (2) NcoI和BstEII 确保目的基因与载体的正确连接（防止自身环化或防止反向拼接） （低浓度）CaCl2（氯化钙） 利福平、链霉素和卡那霉素 能导入长度更长的外源基因 (3) 促使Vir基因表达，使T-DNA转导到植物细胞中 40mg/L (4) 凝胶电泳 甲丙含有抗虫基因，但不一定表达抗虫性状；甲丙抗虫性状不一定能稳定遗传；可能出现基因漂移；转基因植株的存活能力可能较弱等 【分析】基因工程的操作步骤： 1、目的基因的获取方法。 2、基因表达载体的构建。 3、将目的基因导入受体细胞。 4、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）外植体消毒后，需要用无菌水清洗，一方面去除消毒剂，另一方面也避免病原微生物的污染。接种后，外植体需要通过脱分化，然后进行细胞增殖过程，才能形成愈伤组织。 （2）依据图1信息，T-DNA中的潮霉素抗性基因需保留，用于筛选转基因愈伤组织，同时为了确保外源目的基因的正确连接，所以选用NcoI和BstEⅡ两种酶进行酶切。为提高外源基因的转化成功率，常使用低浓度的氯化钙溶液处理细菌。根据表1信息，所用农杆菌自带利福平抗性基因，质粒1带有链霉素抗性基因，质粒2带有卡那霉素抗性基因，因此最后筛选导入了2种质粒的农杆菌时，需接种到含有利福平、链霉素和卡那霉素的培养基上。虽然具有抗生素抗性，但抗生素仍旧会对农杆菌产生不利影响，因此需要将筛选出来的重组农杆菌在不含抗生素的培养基上培养，恢复活性。依据题干和表格信息，质粒1的作用是提供Vir蛋白，质粒2的作用是提供T-DNA，因此质粒2不需要Vir基因片段，从而增加了可承载的外源基因的长度。 （3）依据题干和表2信息，潮霉素用于筛选转基因愈伤组织，因此不抗潮霉素的愈伤组织即为未导入外源基因的愈伤组织。表中信息表示不含AS的愈伤组织只能在无潮霉素或较低潮霉素浓度下存活（说明植物自己有一点潮霉素抗性），说明未导入外源基因，而含有AS组的愈伤组织，在较高潮霉素浓度下也能存活，再结合表1备注的相关信息，可以得出AS的作用，即AS的作用是促使Vir基因表达，使T-DNA转导到植物细胞中。同时潮霉素的作用是筛选导入外源基因的外植体，因此需要一定的浓度，但浓度也不能过高，避免转基因愈伤组织也死亡，即应选用40mg/L的潮霉素浓度作为筛选浓度对所有转化后愈伤组织进行筛选。 （4）鉴定转基因牧草中是否含有目的基因，可以通过PCR的方式进行检测，PCR的结果需用凝胶电泳的方式获得。依据题目信息，甲乙丙三组都有叶肉细胞自身基因，甲丙两组含有外源基因，因此电泳结果图上方条带为叶肉细胞自由基因，下方条带为外源基因。阴性对照应使用未导入外源基因的该植株细胞使用叶肉细胞自身引物进行PCR，所以应该获得一条上方的条带，阳性对照应使用含有目的基因的质粒进行PCR，因此获得的是下方的条带。则组1和组2的电泳结果为：  ；甲丙含有抗虫基因，但不一定表达抗虫性状；甲丙抗虫性状不一定能稳定遗传；可能出现基因漂移；转基因植株的存活能力可能较弱等，故植株甲和丙不能立即推广种植。 15．（2024·浙江宁波·二模）草甘膦是一种除草剂，但会影响水稻产量。水稻产量与高产基因有关，研究人员拟采用农杆菌转化法对水稻高产基因进行定位，并进一步培育能稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。回答下列问题： Ⅰ.水稻高产基因定位水稻穗粒数可影响水稻产量。农杆菌 Ti质粒的 T－DNA 可以转移并随机插入野生型水稻基因组中（可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点），导致被插入的基因功能丧失，从而得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常突变体，并进行下列研究。 (1)提取 DNA。采集适量突变体和野生型水稻的幼嫩叶片，分别冷冻后研磨成粉末状，依次加入SDS、RNA酶等试剂，去除蛋白质和 等大分子杂质。提取过程中需加入 酶抑制剂并保持轻柔操作，以避免 ，从而提高总 DNA提取率。 (2)PCR扩增。对提取获得的两组总DNA分别进行PCR 扩增。为避免外源DNA等因素的污染，微量离心管、枪头和蒸馏水等在 PCR 前需进行 处理。可以通过在紫外灯下直接观察电泳结果中DNA条带的 及粗细程度来评价扩增是否成功。 (3)结果鉴定。分别用EcoRI、Hind Ⅲ、BamHI三种限制酶处理突变体总DNA 扩增产物，处理后进行电泳，并与野生型 DNA 和 Ti质粒对照。电泳后的 DNA 与含放射性同位素标记的 DNA 探针（T－DNA的一条单链） 进行杂交，得到突变体总 DNA 不同酶切处理后的放射性检测结果如图1所示。 ①不同酶切结果的杂交带位置不同的原因是：不同酶切后含 的片段长度不同，因此各组 DNA片段在凝胶中电泳时的 不同，最终导致分布于不同位置。 ②若杂交结果显示突变体在不同限制酶处理时均出现杂交带，野生型组 （填“有”或“无”） 杂交带， Ti质粒组 （填“有”或“无”） 杂交带，则表明T－DNA 成功插入水稻染色体基因组中，且可判断突变体为T－DNA 位点插入，依据是 。（注：T－DNA 上没有 EcoRI、HindⅢ、BamHI三种限制酶的酶切位点）。 (4)用某种限制酶处理突变体的DNA（如图2所示），断开DNA 分子中的 个磷酸二酯键，再用 将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用下表中的引物①②进行 PCR，扩增出 序列，扩增产物 （填“不含”或“含”）T－DNA 完整序列。经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T－DNA 插入2号染色体上的B基因中。 T-DNA序列 引物序列 5ˊ-AACTATGCGC…….CGTAGCCTAT-3ˊ ①5ˊ-GCGCATAGTT-3ˊ 3ˊ-TTGATACGCG…….GCATCGGATA-5ˊ ②5ˊ-CGTAGCCTAT-3ˊ (5)研究发现，该突变体产量明显低于野生型，据此推测 B基因可 （填“促进”或“抑制”） 水稻穗粒的形成，可控制高产性状。 Ⅱ.抗草甘膦高产水稻培育，研究者构建如图3所示的Ti表达载体，采用农杆菌转化法将抗草甘膦基因R 和基因B转入野生型水稻中，培育稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。 (6)转基因技术的理论基础有：T－DNA 和水稻 DNA 均为 结构、生物界共用一套 等。 (7)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S 是 ，其功能是 酶的识别和结合部位。Ti 表达载体中，B基因和R基因转录的模板链的方向 （填“相同”或“相反”）。 (8)现需选出单一位点插入R基因和B基因且稳定遗传的水稻新品种，筛选方案如下： ①转基因后的水稻植株自交，收获种子（F₁） 并播种在含 的选择培养基上，若能够萌发并生长的个体即为 的个体； ②F₁存活个体自交所得种子（F₂） 按单株收种并播种于选择培养基上，选择存活率约 的培养基中的幼苗继续培养获得F₂植株； ③将F₂植株自交所得种子（F₃）按单株收种并播种于选择培养基上，选择种子全部存活的培养基中的幼苗即为单一位点插入且 的抗草甘膦植株。 ④为实现最终育种目标，研究人员还需检测 。 【答案】(1) RNA DNA DNA被分解或断裂 (2) 高压蒸汽灭菌 位置 (3) T-DNA 迁移速率 无 有 单一 用三种不同限制酶处理都只得到一条杂交带，而野生型无杂交带 (4) 4 DNA连接酶 T-DNA插入位点两侧的突变体DNA未知序列 不含 (5)促进 (6) 双螺旋 遗传密码 (7) 启动子 RNA聚合 相反 (8) 草甘膦 成功表达R基因 75% 稳定遗传 转基因水稻植株的产量是否增加 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）采集适量突变体和野生型水稻的幼嫩叶片，分别冷冻后研磨成粉末状，依次加入SDS、RNA酶等试剂，去除蛋白质和RNA等大分子杂质。提取过程中需加入DNA酶抑制剂并保持轻柔操作，以避免DNA被分解或断裂，从而提高总 DNA提取率； （2）PCR是进行DNA的扩增，为避免外源DNA等的污染，PCR实验中使用的相关器具如微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水等应提前进行高压蒸汽灭菌处理，可以通过在紫外灯下直接观察电泳结果中DNA条带的位置及粗细程度来评价扩增是否成功； （3）①不同酶切结果，杂交带的位置不同，这是由于不同酶切后含T-DNA的片段长度不同，因此各组 DNA片段在凝胶中电泳时的迁移速率不同，最终导致分布于不同位置；②若杂交结果显示突变体在不同限制酶处理时均出现杂交带，野生型组无杂交带， Ti质粒组有杂交带，则表明T－DNA 成功插入水稻染色体基因组中，且可判断突变体为T－DNA单一位点插入，依据是用三种不同限制酶处理都只得到一条杂交带，而野生型无杂交带； （4）用某种限制酶处理突变体的DNA，断开DNA 分子中的4个磷酸二酯键，再用DNA连接酶将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用引物①②进行 PCR，扩增出T-DNA插入位点两侧的突变体DNA未知序列，扩增产物不含T－DNA 完整序列； （5）由于该突变体产量明显低于野生型，而突变体内B基因由于插入了T-DNA导致功能丧失，据此推测B基因促进水稻穗粒的形成； （6）转基因技术的理论基础有：T－DNA 和水稻 DNA 均为双螺旋结构、生物界共用一套密码子等； （7）基因表达载体的结构应该包括启动子、 终止子、复制原点、限制酶切割位点、标记基因等，由图可知CaMV35S是启动子，功能是RNA聚合酶识别和结合的位点。RNA聚合酶的移动方向是从启动子移向终止子，故两个基因编码链方向相反； （8）①转基因后的水稻植株自交，收获种子（F₁） 并播种在含草甘膦的选择培养基上，若能够萌发并生长的个体即为成功表达R基因；②F₁存活个体自交所得种子（F₂） 按单株收种并播种于选择培养基上，选择存活率约75%的培养基中的幼苗继续培养获得F₂植株；③将F₂植株自交所得种子（F₃）按单株收种并播种于选择培养基上，选择种子全部存活的培养基中的幼苗即为单一位点插入且稳定遗传的抗草甘膦植株；④为实现最终育种目标，研究人员还需检测转基因植株的产量。 16．（2024·浙江金华·二模）组培再生体系是进行植物遗传转化、开展功能基因组学研究的前提条件，然而目前羊角蜜的组培再生及遗传转化体系仍不成熟。科研人员研究了外植体类型、激素浓度和农杆菌菌株等因素对其组培再生和遗传转化的影响。请回答下列问题： (1)切取播种后2d子叶节（子叶节-2DAS），播种后5d子叶节（子叶节-5DAS）和下胚轴（下胚轴-5DAS），置于诱导培养基（MS+0.5mg·L-16-BA+1mg·L-1ABA+30g·L-1蔗糖+9g·L-1琼脂）进行愈伤和不定芽诱导，结果如图1、图2所示；并进行了不同浓度6-BA[0（L1）、0.25（L2）、0.375（L3）、0.5（L4）、1（L5）和2（L6），各组单位均为mg·L-1]对不定芽诱导效果的实验，结果如图3所示。    由于所取的外植体具有 ，因此可在诱导培养基上直接诱导发芽。根据图1、图2可得出的结论是 。图3结果 （填“能”或“不能”）表明6-BA对诱导不定芽形成具有两重性。然后切取具有明显生长点的不定芽，置于生根培养基诱导生根，2周后观察并统计生根情况。生根培养基与发芽培养对比，主要的区别是 。 (2)通常用农杆菌转化法将外源基因导入到羊角蜜细胞中，以改造其遗传特性。农杆菌能将T质粒中的 片段转移并整合到羊角蜜细胞的染色体上。转化操作前，需要对野生农杆菌的Ti质粒进行T-DNA基因改造，改造后的质粒如图4所示，其中启动子来源于 （填“农杆菌”或“羊角蜜细胞”）；标记基因1的作用是 ；标记基因2的作用是 。据图可知，标记基因2与报告基因的模板链不在同一条DNA条链上，原因是 。利用报告基因（本研究用绿色荧光蛋白基因GFP基因）与目的基因相连形成融合基因，用于鉴定目的基因是否在角蜜细胞中表达。    (3)农杆菌侵染外植体后，需在培养基中加入 以抑制农杆菌生长。而后将不含农杆菌的外植体组培至幼苗。统计荧光幼苗数与幼苗总数，并计算出侵染效率1；并利用PCR技术鉴定并统计含有CFP基因的幼苗数，并计算出侵染效率2。结果发现侵染效率2大于侵染效率1，推测可能原因是 。用PCR技术鉴定时，科研人员设计了正向引物（与模板链结合的引物）GFP-F和反向引物GFP-R进行基因鉴定，请在下图方框中标出两种引物在GFP基因上结合的位置 。    为了更准确地鉴定出GFP基因，设计引物时需考虑的因素有 。 【答案】(1) 分生组织/生长点 羊角蜜子叶节和下胚轴（不同外植体）的愈伤诱导率差异不显著而不定芽诱导率差异显著，综合来看以播种后2d的子叶节效果最佳 不能 营养物质与激素配比不同 (2) T-DNA 羊角蜜细胞 筛选成功导入目的基因的农杆菌 选成功导入T-DNA的植物细胞 启动转录的方向不同 (3) 抗生素 GFP基因反向连接到质粒上/GFP在植物细胞内表达率低    引物长度/特异性高等 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）需要选取分裂能力强的组织作为外植体，所以选取分生组织/生长点，可在诱导培养基上直接诱导发芽。根据图2可知，羊角蜜子叶节和下胚轴（不同外植体）的愈伤诱导率差异不显著而不定芽诱导率差异显著，综合来看以播种后2d的子叶节效果最佳。根据图3可知，6-BA浓度为L5时不定根诱导率小于L1，L2、L3、L4、L6的不定根诱导率高于L1，所以不能表明6-BA对诱导不定芽形成具有两重性。利用营养物质与激素配比不同分别用于诱导生根和发芽。 （2）农杆菌能将T质粒中的T-DNA片段转移并整合到羊角蜜细胞的染色体上，所以用农杆菌转化法将外源基因导入到羊角蜜细胞中，以改造其遗传特性。为了使外源基因在羊角蜜细胞中表达，则重组质粒中的启动子来源于羊角蜜细胞。标记基因1可用于筛选成功导入目的基因的农杆菌。标记基因2可用于筛选成功导入T-DNA的植物细胞。由于启动转录的方向不同，所以标记基因2与报告基因的模板链不在同一条DNA条链上。 （3）农杆菌是原核生物，可用抗生素抑制农杆菌的生长。GFP基因反向连接到质粒上/GFP在植物细胞内表达率低，所以侵染效率2大于侵染效率1。用PCR技术鉴定时，科研人员设计了正向引物（与模板链结合的引物）GFP-F和反向引物GFP-R进行基因鉴定，则引物需要与模板链反向平行，且需要为DNA链的延伸提供3’末端，所以设计的引物如图。    为了更准确地鉴定出GFP基因，设计引物时需考虑引物长度/特异性高等因素。 17．（2024·浙江台州·二模）家蚕核型多角体病毒可侵染BmN细胞，其基因组中的Bm90基因在病毒感染周期中的表达以及对病毒增殖和组装均有一定作用。为进一步研究其功能，科学家构建了Bm90基因缺失型病毒（简称缺失型病毒）及Bm90基因补回型病毒（简称补回型病毒）2种重组病毒，与野生型病毒一起进行实验。回答下列问题： (1)自然界中病毒粒子的构造简单，通常包含一个外壳和核衣壳包裹的 。精确有效地研究某病毒特定基因的功能，往往需要在该病毒的基因组中诱变或 该基因。 (2)为了获取大量的Bm90基因，可通过检索基因数据库获取序列，利用 法合成，再根据合成的序列设计 ，在 酶的作用下，通过PCR技术实现Bm90基因的体外扩增；也可将Bm90基因与 载体连接，导入到大肠杆菌实现Bm90基因的菌体内扩增。 (3)构建Bm90基因表达载体后，需导入 （状态）的大肠杆菌细胞中，培养后收集菌体经超声波处理使细胞 ，然后进行蛋白质电泳分析鉴定。得到电泳条带后在相应部位割胶以纯化Bm90蛋白。再以Bm90蛋白为 ，注射到大白兔体内，利用相关技术制备Bm90蛋白的单克隆抗体，可用于Bm90基因表达的研究。 (4)将3种病毒的基因组DNA经脂质体法分别转染BmN细胞，收集转染后24、48、72和96h的BmN细胞，加入细胞裂解液和 制备蛋白质样品，以未转染病毒的细胞总蛋白质为阴性对照，利用蛋白质凝胶电泳检测Bm90蛋白的表达，结果如图。从表达时相来看，Bm90蛋白的表达特点是 。 CK：正常BmN细胞1-4：野生型病毒转染后24、48、72、96h；5-8：缺失型病毒转染后24、48、72、96h；  9-12：补回型病毒转染后24、48、72、96h；Bm90基因缺失型和补回型病毒转染BmN细胞后Bm90蛋白的表达情况 (5)为进一步研究Bm90 基因在病毒增殖中的作用，取3种病毒的基因组DNA经脂质体法分别转染BmN细胞，收集转染后24、48、72和96h的细胞培养上清液，测定病毒浓度。结果表明Bm90基因是病毒增殖的必需基因，Bm90 基因缺失使病毒失去了产生子代病毒粒子的能力，而Bm90基因的补回可使病毒恢复产生子代病毒粒子的能力。根据实验结论，用坐标曲线图表示实验结果 。 【答案】(1) 核酸分子 敲除 (2) 化学合成 引物 TaqDNA聚合 克隆（复制） (3) 感受态 破碎 抗原 (4) 蛋白酶抑制剂 病毒转染后72h有表达，96h表达水平明显上升 (5) 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 2、基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】（1）病毒结构简单，外壳和核衣壳包裹的遗传物质即核酸分子，要研究某基因的特定功能，可以使得该基因被诱变，或者敲除该基因，以观察给基因缺失后病毒的性状，从而推知该基因的功能。 （2）获取大量的Bm90基因，可在获取序列后利用化学合成法合成，然后利用PCR技术进行扩增，PCR技术使用时先设计引物，然后在TaqDNA聚合酶的作用下，进行体外扩增；也可将Bm90基因与克隆（复制）载体连接，进行体内扩增。 （3）感受态细胞能够吸收遗传物质，因此构建Bm90基因表达载体后，需导入感受态的大肠杆菌细胞中，培养后收集菌体经超声波处理使细胞破碎，再然后进行蛋白质电泳分析鉴定，以测定转入的基因是否被正常表达；要制备Bm90蛋白的单克隆抗体，则以Bm90蛋白为抗原注射入大白兔体内，得到的是能抗Bm90蛋白的抗体。 （4）将3种病毒的基因组DNA经脂质体法分别转染BmN细胞，收集转染后24、48、72和96h的BmN细胞，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，以防止表达的Bm90蛋白被酶水解；根据图示，野生型病毒转染后72h、96h和补回型病毒转染后72、96h的电泳检测结果表明，这两种情况下Bm90蛋白被表达，从表达时相来看，Bm90蛋白的表达特点是病毒转染后72h有表达，96h表达水平明显上升。 （5）结果表明Bm90基因是病毒增殖的必需基因，Bm90 基因缺失使病毒失去了产生子代病毒粒子的能力，而Bm90基因的补回可使病毒恢复产生子代病毒粒子的能力。根据实验结论，用坐标曲线图表示实验结果如图： 18．（2024·浙江·二模）野生型果蝇的眼色为暗红眼（++），现有两个纯合突变品系朱砂眼（cc）和猩红眼（ss）。为进一步研究其眼色的遗传机制，进行了三组杂交实验，结果如下表。 实验 P F1 ① 朱砂眼×野生型 野生型 ② 猩红眼×野生型 野生型 ③ 朱砂眼×猩红眼 野生型 回答下列问题： (1)雌果蝇的生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子，供多次受精使用。进行杂交实验前，应选择 的雌果蝇作为实验材料。 (2)由实验结果可知，该果蝇的突变眼色为 性状，控制突变品系的c基因与s基因 （“可能”或“不可能”）是等位基因。 (3)若c基因与s基因位于一对同源染色体上，则实验③F1相互交配产生的F2，其眼色表型及比例为 。 (4)若c基因与s基因位于两对同源染色体上，请尝试写出实验③亲本杂交得到F1过程的遗传图解： （要求写配子）。 (5)为探究s基因的分子作用机制，研究者分别提取 品系果蝇的基因组，设计特异性引物，对+和s基因片段进行PCR扩增后电泳，并对其表达量进行测定，结果见图1和图2所示。推测+基因发生了碱基对的 而突变为s基因，导致其基因表达量 ，从而引起了果蝇体内色素的含量变化。 【答案】(1)未交配过（未受精） (2) 隐性 不可能 (3)朱砂眼：暗红眼〈野生型〉：猩红眼=1：2：1 (4)2种遗传图解任选其一 (5) 野生型和猩红眼 缺失 下降（减少） 【分析】根据题图分析，野生型基因型为C-S-，朱砂眼基因型ccS-，猩红眼C-ss。 【详解】（1）雌果蝇的生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子，供多次受精使用。进行杂交实验前，应选择未受精的雌果蝇作为实验材料。 （2）由实验①和②可知，亲本杂交后，F1都是暗红色，该果蝇的突变眼色为隐性性状。根据组合丙的F1可知，朱砂眼和猩红眼杂交，后代表现为暗红眼，朱砂眼和猩红眼为隐性突变体，若一对等位基因控制，不可能出现暗红眼，因此c、s为非等位基因。 （3）实验③亲本朱砂眼×猩红眼即ccSS×CCss，F1为CcSs，若c基因与s基因位于一对同源染色体上，则F1为CcSs产生的配子为cS、Cs。则实验③F1相互交配产生的F2，其眼色表型及比例为朱砂眼：暗红眼〈野生型〉：猩红眼=1：2：1。 （4）实验③亲本朱砂眼×猩红眼即ccSS×CCss，F1为CcSs，若c基因与s基因位于两对同源染色体上，遗传图解如下图所示： （5）野生型和猩红眼可能含有s基因，探究s基因的分子作用机制，研究者分别提取野生型和猩红眼品系果蝇的基因组，设计特异性引物，对+和s基因片段进行PCR扩增后电泳，并对其表达量进行测定。根据图1和2分析，+基因的电泳片段大于s基因的，故推测+基因发生了碱基对的缺失而突变为s基因，导致其基因表达量下降，从而引起了果蝇体内色素的含量变化。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！4 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题18 生物技术与工程综合 考向 五年考情 考情分析 生物技术与工程综合 2024年6月浙江卷第23题 2024年1月浙江卷第22题 2023年6月浙江卷第23题 2023年1月浙江卷第24题 2022年6月浙江卷第29题 2022年1月浙江卷第29题 2021年6月浙江卷第29题 2021年1月浙江卷第29题 2020年7月浙江卷第29题 2020年1月浙江卷第29题 选择性必修3模块的综合考查，以发酵工程、细胞工程的真实情景为引入，结合多个工程的知识进行解答，其中基因工程基本上年年考查，这一模块考查学生基础知识掌握程度、知识综合应用能力、分析和获取信息的能力。 1、（2024年6月浙江卷）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： （1）获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为_____，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行_____获得分散的单细胞。 （2）对分离获得的单细胞进行_____培养，并通过添加_____或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了_____的胁迫。 （3）在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图_____（填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。_____ （4）多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过_____培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的_____和_____的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用_____工程生产植物的次生代谢产物。 2、（2024年1月浙江卷） 锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： （1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 （2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。 （3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 （4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 3、（2023年6月浙江卷）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： （1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 （2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 4、（2023年1月浙江卷）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： （1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的__________为外植体。 （2）植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。 （3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？__________ A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 （4）愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形成再生植株。 （5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的__________。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经__________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 5、（2022年6月浙江卷） 回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题： （1）为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。 （2）为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。 （3）为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。 （二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题： （4）在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。 （5）为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。 （6）植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。 6、（2022年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： （1）取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。 （2）红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。 （3）生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 （4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （5）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。 （6）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 7、(2021年6月浙江卷) 回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与甘蔗醋制作有关的问题： （1）为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经__________后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，振荡培养24 h。用__________将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有__________的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的__________培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。 （2）优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下振荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中______含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有____________________（答出2点即可）等特点。 （3）制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经_________后用于发酵。其固定化方法为_________。 （二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。 （1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。 （2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成_______，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有__________（答出2点即可）。提取质粒后，采用____法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。 （3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。 8、(2021年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题： （一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。 （1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或________法，两种方法均能在固体培养基上形成________。对分离的菌株进行诱变、________和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。 （2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除________；③检验固定化菌株的________。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是________。 （3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是________。 （二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。 （1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。 （2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。 （3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 9、(2020年7月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题： （1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的__________。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的__________，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值__________的处理效果好。③对不同处理进行__________，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。 （2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成__________，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已__________的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径__________的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的__________下降。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。 （2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。 （3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。 （4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。 10、(2020年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与泡菜制作有关的问题： （1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。 （2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。 （3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。 （4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。 （2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。 （3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。 1、 选择题 1．（2024·浙江温州·三模）普通小麦是两性植株，体细胞中染色体成对存在。条锈病由条锈菌引起，严重危害小麦生产，Yr5和Yr15基因都是有效的显性抗条锈病基因。回答下列问题： (1)Yr5基因和Yr15基因分别在斯卑尔脱小麦和野生二粒小麦中被发现，两种基因的根本区别是 不同。将Yr5基因或Yr15基因导入普通小麦中，实现了物种间的 (填变异类型)，提高了小麦的抗逆性。 (2)研究者将Yr15基因整合到普通小麦1B染色体的短臂上(如图甲)，获得抗条锈病小麦品系F。提取抗条锈病小麦的 作为PCR的模板扩增Yr15基因，用凝胶电泳技术分离、鉴定扩增产物。利用上述方法不能区分纯合和杂合的抗条锈病小麦，因为 ，两者电泳后DNA条带的数量和位置相同。 (3)研究者培育了不抗条锈病小麦品系T，其1B染色体的短臂(1BS)被黑麦 1R染色体的短臂(1RS)取代，形成了B．R染色体(如图乙)，B．R染色体形成的原因是发生了染色体结构变异中的 。品系T的其他染色体形态、功能与正常小麦相同。为检测小麦细胞中的B．R染色体，研究者根据该染色体 中DNA片段的特殊核苷酸序列，设计了荧光标记的探针1RNOR，将该探针导入小麦的体细胞，根据观察到荧光点的数目可判断细胞中 B．R染色体数目。 注：B．R染色体可与IB染色体联会并正常分离，但IRS与IBS不能发生重组。 (4)以纯合的不抗条锈病小麦品系T、条锈菌、探针 1RNOR 及抗条锈病小麦品系F(含杂合子和纯合子)为材料，可快速获得大量纯合的抗条锈病小麦，方法如下：让纯合小麦品系T与小麦品系F杂交得到F₁代， 。 (5)研究者将Yr5基因导入小麦品系T中，得到图丙所示植株，将该植株与杂合的小麦品系F杂交，让所有F₁植株进行自交，用探针 1RNOR 对F₂植株进行检测，若各种基因型的植株结籽率相同，F₂植株中抗条锈病且含荧光点的植株占 。 2．（2024·浙江金华·模拟预测）纤维素酶能将纤维素降解为单糖或寡糖，且转化过程绿色、低碳，被认为是纤维素资源化利用的可持续方法。在牛、羊等反刍动物的瘤胃中有能分解纤维素的微生物。某科研团队按照下图所示的流程分离瘤胃中的纤维素分解菌，实验中需要甲、乙两种培养基，并在平板上筛选到有透明降解圈的菌落。 (1)过程①中甲培养基中除水、无机盐、氮源还应有 成分，培养基表面加入一层无菌的石蜡主要目的是 。 (2)过程②中用适宜浓度NaCl溶液而不用无菌水进行梯度稀释的目的是 。 (3)科学家发现分离到的微生物产纤维素酶能力弱，进一步研究发现其体内的M基因抑制了其体内纤维素酶基因表达。某科研团队基于CRISPR/Cas9系统拟对某细菌内的M基因进行敲除，以探究该基因对其体内纤维素酶基因表达的调控效果。CRISPR/Cas9系统是其中一种能敲除特定基因的系统，该系统主要包含Cas9蛋白和由tracrRNA和crRNA形成的sgRNA两部分组成，sgRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA。 ①在设计sgRNA序列时，必须事先测定M基因的 ，从而设计一段能 得到sgRNA的DNA．在sgRNA与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区最多含有 种核苷酸，若要将M基因从目标DNA上剪切下来，需要设计 种sgRNA。 ②将sgRNA基因和Cas9蛋白基因导入 目标细菌，科研人员为提高转化效率，常常用 处理目标细菌一旦细胞中同时含有sgRNA和Cas9，Cas9就会与sgRNA结合在一起并在sgRNA的带领下，来到能够与sgRNA 的目的基因处，特异性地切割M基因。 ③将CRISPR/Cas9系统基因重组载体成功转染至目标细菌后，与对照组相比，实验组纤维素酶的表达量如图所示，由此得出的实验结论是 ，判断依据是 。 3．（2024·浙江绍兴·模拟预测）A型塞内卡病毒(SVA)会导致猪患水疱传染病，症状与猪口蹄疫等传染病非常相似，增加了临床鉴别诊断的难度。VP1蛋白是SVA核衣壳的主要成分，可作为SVA诊断的靶蛋白。研究人员尝试制备抗VP1蛋白单克隆抗体，以便快速、准确检测SVA病毒。回答下列问题： (一)基因工程抗原的制备 (1)提取病毒RNA，经 形成cDNA，根据GenBank上发表的VP1蛋白基因序列，设计一对特异性引物，在引物的 (5’或3’)端引入限制酶BamHⅠ和XhoI的识别序列，并进行PCR扩增。考虑一个模板DNA分子的扩增，PCR第四次循环时，需要消耗 对引物。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分析正确后，通常还需进行序列测定，原因是 。 (2)将回收后的VP1基因片段及pET-28a载体经酶切和连接后转化大肠杆菌DH5a菌株，接种至LB固体培养基。37℃恒温箱培养，挑取 至LB液体培养基，置于37℃摇床震荡培养12h，提取重组质粒，经鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21菌株。扩增成功转化的菌株，最后经 后收集菌体沉淀，并 细菌，纯化得到VP1蛋白。 (二)抗VP1蛋白单克隆抗体的制备 (3)用纯化的VPl蛋白多次免疫小鼠，然后诱导小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合，推测SP2/0细胞的生长特点是 。常用方法有PEG融合法、电融合法和 。通过选择培养的方法筛选出杂交瘤细胞，再经过96孔板 培养和抗体检测筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的2个杂交瘤细胞株分别注射到小鼠腹腔中，从腹水中成功提取得到了2种鼠源单克隆抗体—2E10和3E4。 (4)为进一步确定2E10和3E4在VP1蛋白上的结合位点，将VP1蛋白截为4段(VP1-1~VP1-4)，电泳后分别用2E10和3E4为探针进行杂交，结果如图所示。根据实验结果，可判断2E10和3E4与VP1的结合位点是 (填“相同”或“不同”)的，依据是 。 4．（2024·浙江绍兴·模拟预测）绍兴腐乳，又叫“霉豆腐”，具有酒醉醇香、细腻松酥、入口即化等特点，是浙江地区的传统名菜。其制作的流程是：让豆腐表面长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。腐乳味道鲜美的主要原因是微生物产生的蛋白酶和脂肪酶等将豆腐中的蛋白质和脂肪等分解成小分子的肽、氨基酸、脂肪酸等，其中的氨基酸与钠盐作用形成氨基酸钠（其中的谷氨酸钠是味精的主要成分）。研究人员欲从自然发酵的传统“霉豆腐”中筛选出新的毛霉菌株以进一步改良风味。 (1)腐乳发酵过程中所用的毛霉菌株是一种 菌。腌制完成后需要加卤汤装瓶，卤汤中酒精的含量一般控制在12%左右，从发酵角度分析主要原因是酒精含量过高，导致 ；过低，导致杂菌生长，引起变质。 (2)酪素培养基的原理是在培养基中添加酪素，如果菌株能产生蛋白酶并分泌到胞外，则能将酪素降解形成透明圈，从培养基的用途上分，该培养基属于 （填“选择”或“鉴别”）培养基。Hc值是透明圈直径与菌落直径的比值，据Hc值初步筛选出三种具有高蛋白酶活力的菌株编号为M2、M3、M4，原人工接种发酵工艺所用的毛霉菌株编号为M1。将各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合，接种于豆腐小块表面，分别以接种 为对照，培养后测定各组蛋白酶活力和脂肪酶活力如图1所示（柱状图上的误差线“I”代表数据的波动范围）。根据下图1数据，最优的毛霉菌株组合是 。 (3)根据以上研究，研究者想通过以下细胞工程的方案获得M2M3杂种菌株，以期获得优质毛霉菌株。 处理③过程可选择 、离心等物理方法，也可选择合适的化学方法；在此处理前需要先对原生质体2和3进行 。在获得杂种毛霉后，往往还需要经过 和鉴定。结果发现，利用细胞工程得到的杂种毛霉并没有达到预期的效果，其原因可能之一是 。 (4)另一研究小组想通过改造M4菌株形成新的单菌株毛霉发酵工艺，图3为M4菌株改造的基本思路。 图3的流程是利用 工程对毛霉进行改造，A是指活力更高的 （蛋白质）。 若图4为目的基因的部分序列： 现需要在目的基因上游添加EcoRⅠ识别序列（5'-G↓AATTC-3'），下游添加BamHⅠ识别序列（5’-G↓GATCC-3'）以便与载体正确链接，利用PCR扩增目的基因应选择的一对引物是 。 上游引物 下游引物 A 5'-…GAATTCATGACAGTTAGT…-3' 5'-…GGATCCTCACCGGCAGTA…-3' B 5'-…GGATCCATGACAGTTAGT…-3' 5'-…GAATTCTCACCGGCAGTA…-3' C 5'-…GAATTCTACTGTCAATCA…-3' 5'-…GGATCCAGTGGCCGTCAT…-3' D 5'-…GAATTCAGTGGCCGTCAT…-3' 5'-…GGATCCTACTGTCAATCA…-3' 5．（2024·浙江绍兴·模拟预测）叶酸是生物体内极其重要的维生素，化学性质不稳定，部分植物和微生物可以合成叶酸，人类则需额外补充。GCHI和ADCS是叶酸合成途径中两种重要的酶。研究人员通过RACE技术获得转录因子APBP2基因，并将其在粮食作物小麦中过量表达，结果显示转基因小麦中叶酸量显著提高，人类有望通过食用面包补充部分叶酸。回答下列问题： (1)RACE技术是一种基于PCR技术利用低含量的mRNA快速扩增DNA的有效方法，通过此技术获取大量APBP2基因需经逆转录和 两个基本过程，这两个过程需要逆转录和 酶。 (2)PCR的产物可通过凝胶电泳鉴定，由于APBP2基因在电泳缓冲液中带 电，电泳时加样孔一端应该靠近 极。电泳结果如图甲，其中1号泳道是DNAMarker的电泳结果，DNAMarker是一组已知长度和 的标准DNA片段混合物，2号泳道是以 为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组。含有APBP2基因条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA片段，从而达到 目的。    (3)为提高转录因子APBP2的表达量，研究人员构建了携带特异性强启动子的APBP2基因表达载体，如图乙。强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被 识别并结合，驱动基因的持续转录，该特异性启动子能使APBP2基因在小麦植株的 部位表达。 (4)将含重组Ti质粒的农杆菌和小麦愈伤组织混合培养一段时间，经过 后进行植物组织培养，在培养基中加入 进行筛选，此物质能抑制叶绿体和线粒体中蛋白质的合成，从而引起植物细胞死亡。愈伤组织是一种相对没有 的薄壁细胞团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成 ，再继续发育成转基因小麦株系。 (5)在小麦内过量表达转录因子APBP2可提高小麦叶酸量，推测APBP2基因在细胞内发挥的作用可能是 。 6．（2024·浙江·模拟预测）CRISPR/Cas9基因编辑系统是由Cas9蛋白和向导RNA构成的复合体，可利用向导RNA识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目标DNA进行编辑，其过程如下图所示。利用该系统对某种野生食用真菌进行了DNA编辑，培育出转基因真菌。CRISPR/Cas9系统的相关基因能否成功转入受体细胞是遗传转化体系建立的重要前提。 (1)将真菌细胞置于一定浓度的PEG溶液中，一段时间后再与重组DNA混合可以提高转化效率，其中PEG的作用是 。在转基因真菌的培育中，一般以原生质体为主，极少尝试菌丝体和孢子，说明遗传转化体系中 的选择是制约转化效率的另一重要因素。 (2)野生型核基因组中含有pyrg、ura3基因，这两类基因表达可产生乳清核苷-5’-磷酸脱羧酶，参与催化尿嘧啶的合成，通过CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA与 基因中的序列进行 ，将Cas9蛋白带到靶基因附近并对基因进行剪切。当目标基因序列被破坏后，菌体表现为尿嘧啶营养缺陷，只能在含有 和5-氟乳清酸的培养基上正常生长，利用这种选择作用可以初步区分出野生型真菌及完成了转化的转基因品系。研究发现CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA序列长度应当适中否则极易脱靶即难以精准找到目标DNA序列，脱靶最可能的原因是 。 (3)Cas9蛋白和向导RNA基因在真菌细胞中表达水平低，可通过在基因一端添加合适的 来构建高表达基因编辑系统，还可以通过基因优化，使其转录产物中含有真菌细胞高频使用 ，以此来提高翻译效率。 (4)该食用菌是某种逆转录病毒的特定宿主，侵染时，病毒将 （填物质）注入食用菌细胞合成双链DNA片段，说明注入的酶可能具有①以病毒核酸为模板，催化 键的形成、②解开 的作用。这些功能的实现由酶分子相应的结构区域完成，体现了酶的 以及酶功能的复杂性。食用菌细胞中合成的这些DNA片段通过 进入细胞核内，并 （选填“随机”或者“定向”）整合到食用菌的核基因组中，使其发生 （填变异类型），进而引发食用菌减产。 (5)某些食用菌具有天然抗击该种逆转录病毒的能力，有同学指出，可能是因为这些食用菌中含有限制性内切核酸酶切割了病毒核酸，你认为这种推测合理吗？ ，请说明原因 。 7．（2024·浙江·三模）天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶二羧酸合成酶（DHDPS）是玉米赖氨酸合成途径中的关键酶。野生型玉米赖氨酸含量很低，科学家利用蛋白质工程技术将天冬氨酸激酶第352位苏氨酸替换为异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶第104位天冬酰胺替换为异亮氨酸，显著提高两种酶的活性，使玉米中赖氨酸含量提高数倍。回答下列问题： (1)将天冬氨酸激酶基因模板链中的单个碱基 替换为 ，可得到改造后的基因（苏氨酸的密码子为ACU、ACC、ACA、ACG，异亮氨酸的密码子为AUU、AUC、AUA）。将改造后的基因导入玉米细胞中，使玉米获得高活性天冬氨酸激酶。用 （写出1点即可）等物理或化学因素处理玉米种子也可能得到类似结果，但该育种方式具有一定的盲目性，因为基因突变具有 的特点。 (2)将改造后的AK基因（记为基因A）和改造后的DHDPS基因（记为基因D）导入玉米细胞，经组培获得高赖氨酸含量的植株甲、乙、丙，已知三个植株中的每个细胞中仅导入一个基因A和1个基因D。让植株甲、乙、丙分别自交，所得子代表型及比例如下： 亲本 子代表型及比例 甲 高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=9：7 乙 高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=3：1 丙 高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=1：1 （注：不考虑基突变和交叉互换） ①植株甲的子代中，低赖氨酸含量植株基因型有 种，高赖氨酸含量植株中纯合子占 。 ②为快速获得稳定遗传的高赖氨酸含量玉米，应取植株 （“乙”或“丙”）的 置于适宜培养基上培养，对全部幼苗进行染色体加倍处理，最终所得纯合植株中高赖氨酸含量个体占 。 ③若植株乙和植株丙进行杂交，所得子代表型及比例为 。 (3)分别提取野生型玉米和第（2）小题中植株甲的DNA，用下图所示引物1和引物2进行PCR扩增，用限制酶A充分切割扩增产物，之后进行凝胶电泳，已知图乙泳道1对应野生型玉米，请在图乙泳道2中画出植株甲对应的结果 。    8．（2024·浙江绍兴·模拟预测）果蔬生产过程中，农药、化肥、土壤微生物等均可产生NO（一氧化氮），NO作为一种气体信号分子对植物的生命活动产生一定影响；NO同时也是重要的环境响应因子，在植物的抗逆境生理中发挥重要作用。某研究小组为探究NO对某果蔬植株光合作用强度的影响进行了如下实验。实验中用SNP（硝普钠）作为NO的供体。回答下列问题。 (1)实验中测定了叶片的NO含量、叶绿素和类胡萝卜素含量、气孔导度，结果如图1。测定色素含量时，需用 提取色素并测定含量。提取液中的叶绿素主要吸收 光。相较于甲组，推测乙组叶片的光合作用强度较弱，依据是 。 (2)进一步检测发现，转录因子（HY5）基因敲除的植株叶绿素含量下降。PORC基因是叶绿素合成的关键基因，推测HY5蛋白可直接结合PORC基因的启动子调控其转录。为研究HY5基因与PORC基因的关系，研究者利用亮氨酸合成缺陷型酵母菌进行相关转基因实验，其操作步骤如下。 ①先将载体1导入亮氨酸缺陷型酵母细胞，但始终无法在添加金担子素（AbA，一种抗生素）和亮氨酸的培养基上获得重组酵母菌菌落，因此，可采过 技术筛选出重组酵母细胞。 ②再将载体2导入①步骤获得的重组酵母细胞，接种到选择培养基上，能筛选获得如图2所示的重组酵母细胞。关于该选择培养基的配方正确是 。 A．加亮氨酸和AbA    B．不加亮氨酸加AbA C．不加亮氨酸和AbA  D．加亮氨酸不加AbA ③据此分析步骤①中培养基上无法培养得到菌落的原因是 。 (3)已知NO不直接影响PORC基因的表达也不影响其表达产物的活性，综合上述研究，阐明NO降低植物叶绿素的可能机制： 叶绿素合成减少。 (4)NO作为环境响应因子，还能通过抑制需氧呼吸中 、三羧酸（TCA）循环、电子传递链途径中关键酶的活性，抑制了呼吸速率，延缓了植物衰老，此功能与 （植物激素）的作用相互拮抗。 9．（2024·浙江杭州·模拟预测）为使甘蓝具有抗除草能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。（见图1，注：BamHI识别的序列是G↓GATCC；BgⅢ识别的序列是A↓GATCT，EcoRI识别的序列是C↓AATTC）    (1)利用PCR扩增草甘膦抗性基因时，需要在引物的 （填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，原因可能是 （答2条）。 (2)构建表达载体时切割质粒应选择 酶切。酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用 酶对两种重组质粒进行剪切，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小进行区分，电泳结果出现长度为 的片段即为所需基因表达载体。 (3)步骤②将重组质粒与经 处理农杆菌的混合，完成转化后先置于 培养基中培养，其目的是 。再将菌液涂布在含有抗生素的固体培养基中进行筛选。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在培养基中添加 以便筛选出含目的基因的甘蓝愈伤组织。 (4)基因芯片技术是一种能有效地对转基因作物进行检测的新技术，通常被检测的特定DNA序列包括两类：一类是非目的基因序列，主要为载体上通常具有的各种组成元件；另一类则是目的基因序列本身。使用方法如下：第一步，针对待测的特定DNA片段设计引物，扩增出的特定DNA片段带上标记制成探针，经变性后通过芯片点样仪固定到杂交膜上，再经过一定的处理，便得到可用于检测的DNA芯片（见图2）；第二步，从待测植物中提取DNA作为模板，加入引物进行扩增；第三步，将扩增产物经过变性处理后铺于芯片表面，放入杂交盒中，在适宜条件下进行杂交；第四步，待反应结束后，对芯片进行清洗等处理，用仪器检测芯片上的杂交结果。    利用基因芯片可检测特定DNA序列依据的是 原则。对抗草甘膦转基因甘蓝进行检测的基因芯片的阵列设计为：第1列为空白对照，第2列固定甘蓝植株的内源基因作为阳性对照，第3列固定与甘蓝DNA序列高度 （填“同源”或“非同源”）的DNA片段作为阴性对照，第4~6列可分别固定 、 和潮霉素抗性基因进行检测，每列重复多次以保证结果的准确性。若该基因芯片检测有效，转基因甘蓝的样本在芯片的第 列上均应出现检测信号。 (5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。 10．（2024·浙江·模拟预测）小麦是雌雄同花植物。科研人员偶然发现一株高秆雄性不育小麦（甲），其雄性不育受显性基因M控制，另有一株矮秆可育小麦（乙），株高由A、a基因控制。科研人员进行了以下实验： 杂交一：甲×乙→F1矮秆雄性不育：矮秆雄性可育=1∶1 杂交二：F1中的矮秆雄性不育×高秆雄性可育（野生型）→F2矮秆雄性可育：高秆雄性不育=1：1回答下列问题： (1)A、a基因的根本区别是 ，其显性现象的表现形式是 。 (2)杂交一实验中甲作为 （父本/母本）。根据杂交一、二实验结果可知，甲和乙的基因型分别为 、 ，两对等位基因的遗传 （遵循/不遵循）自由组合定律。 (3)假设让实验二的F2自由交配，后代中高秆雄性可育植株占 。 (4)研究发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且M及其等位基因的编码区相同；为研究该序列与雄性不育之间的关系，科研人员在野生型小麦中获得了M等位基因的启动子并利用Ti质粒构建表达载体，部分结构如下图所示，GFP表达后会发出绿色荧光。将载体转入小麦幼胚，获得转基因植株，对植株表型和M基因表达情况进行鉴定。 a．通用的强启动子b．M等位基因启动子c．插入TRIM序列的M等位基因启动子d．M编码区e．M基因f．无关基因 实验材料 转入载体组成I、II 植株表型 M基因表达情况 雄性不育小麦 - 雄性不育 仅在花药发育早期表达，在根、 茎、叶、雌蕊中均不表达 野生型小麦 - 可育 在花药发育各时期均不表达，在 根、茎、叶、雌蕊中均不表达 野生型小麦 ad 死亡 - 野生型小麦 ①________ ②________ 仅在花药发育早期表达，在 根、茎、叶、雌蕊中均不表达 （1）表中①处转入的载体组成为 （从a~f中选择），②处植株表型为 。 （2）在存活的转基因小麦花药中特异性检测到绿色荧光。根据实验结果推测导致雄性不育的原因是 。 11．（2024·浙江·三模）干旱胁迫会引起植物细胞内重要生理代谢途径紊乱，如细胞呼吸电子传递链受损、光反应中电子散逸，细胞内活性氧自由基（ROS）积累等，因此干旱胁迫下ROS对膜脂质、蛋白质及DNA等的氧化损伤是植物损伤的重要方式。Lon1蛋白具有降低叶绿体和线粒体内ROS产生，维护细胞正常代谢的功能。某研究团队以耐干旱胁迫突出的“夏普蓝”蓝莓为材料，构建了如下图所示表达载体，导入烟草后以研究Lon1蛋白在植物应对干旱胁迫时的相关功能。回答下列问题： 注：1.KpnⅠ和SmaⅠ为限制酶，CaMV35S表示启动子，Lon1为目的基因。2.Gus基因表达产物能催化无色X-Gluc生成蓝色物质，植物无此基因。3.左右边界之间的区段表示T-DNA片段。 (1)获取目的基因及构建重组表达载体。通过检索基因数据库，获得蓝莓 ，以此设计引物并在引物的5’端添加 。由图可知，SmaⅠ识别位点位于目的基因模板链的 端。PCR扩增产物可用电泳技术分离后将含有 切割下来以便回收并提纯。 (2)利用农杆菌转化烟草细胞及培育转基因植株。使用的外植体是带有伤口的叶圆片，将重组的农杆菌和叶圆片共培养一段时间，该过程需控制好 （答两点）和pH、温度等环境条件，以保证外植体的存活率和转化率均较高。将共培养后的叶圆片转入添加适当抗生素的培养基上培养，目的是 。培养基中还含有 （答两点）等有机成分及植物生长调节剂来调控叶圆片细胞脱分化、再分化过程，从而得到转基因烟草植株。 (3)筛选转基因烟草植株及耐旱特性观察鉴定。选取转基因烟草叶片，将其置于含 的鉴别培养基中染色，若叶片出现蓝色斑点即为转基因烟草转化成功。染色前需对叶片进行 处理，以防对结果产生干扰。将转基因烟草叶片，一组置于添加10% PEG的MS培养基中培养，另一组置于未添加PEG的MS培养基中培养。添加10% PEG的作用是 。另取野生型烟草叶片作为对照。 (4)电镜下显示正常培养的烟草细胞叶绿体、线粒体形态结构完整。添加PEG的野生型烟草细胞出现叶绿体基粒片层结构模糊，线粒体变形嵴断裂等现象，而添加PEG的转基因烟草细胞未出现上述现象；检测各组植株叶绿素相对含量，结果如下图。推测干旱胁迫下Lon1蛋白可能是通过 ，来维护光合作用的正常进行，从而抵御干旱。 12．（2024·浙江·模拟预测）莫内林是从一种西非植物的浆果中分离提纯到的甜味蛋白，甜度是蔗糖的3000倍左右。下图1所示利用大肠杆菌生产莫内林，其中M基因可表达合成莫内林。表1是为PCR扩增M基因设计的引物，画线部分是所需使用的限制性内切核酸酶的识别序列。 Ampr为氨苄青霉素抗性基因，氨苄青霉素可抑制细菌细胞壁的形成，对真核生物生长无影响 限制性内切核酸酶识别序列及切割位点：BamHI：5’-G↓GATCC-3’   XhoI：5’-C↓TCGAG-3’   Sau3AI：5’-↓GATC-3’   SacI：5’-GAGCT↓C-3’ 引物1 5’GGAATTCCTCGAGGGCGAATGGGAAATTATCG3’ 引物2 5’TTTGGATCCTTACGGCGGCGGAACCGGAC3’ (1)若选用XhoI和Sau3AI对质粒A进行切割，为实现其与目的基因的连接，可在目的基因两端添加 。引物1的结合位点可能在 （选填图1中的编号）。引物1的画线部分序列在A中 （有/没有），引物2画线部分的序列在B中 （有/没有）的可能性较高。 (2)已知C中的培养基成分有水、酵母粉、蛋白胨和氯化钠，并按一定比例添加氨苄青霉素。将C中有生长优势的菌落经多次 后作为菌种在发酵罐中培养，积累产物，发酵罐中培养基成分与C中培养基相较可不添加 ，并采用 的方法对装填在发酵罐中的培养基灭菌。 (3)通过大肠杆菌生产的莫内林甜度较天然莫内林大为降低，天然莫内林也易因温度等因素导致甜度降低甚至甜味消失，科学家分析其中的原因并进行了后续的工程学改造，请结合所学知识，分析两种莫内林甜度降低的原因分别是 。 (4)针对上述问题，从分子水平对蛋白质进行改造是解决莫内林甜度降低的工程学思路。以甜味蛋白质的三维结构为基础，选择影响其与受体相互作用的关键氨基酸残基，进行定点突变，将获取的新基因与酵母质粒中构建 ，导入到真核细胞如甲醇营养型毕赤酵母中，并评价突变体的功能，筛选能产生 等优良性能的甜味蛋白质的菌种。研究结果表明，相对于天然的野生型甜味蛋白质monellin，突变体E2N/E23A的甜味均提高了约3倍左右，而突变体E2N/E23A的热稳定性(Tm值)提高了约10℃。 (5)接上题，与大肠杆菌转化不同，毕赤酵母转化前一般先用低温山梨醇溶液处理，使其处于一种 的生理状态；同时需将外源DNA处理成线性，分析原因可能是 。转化后的毕赤酵母进行发酵培养分为两个阶段：生长阶段，以甘油为碳源、获取大量的功能性细胞；诱导阶段，通过添加甲醇来诱导表达重组蛋白。培养基中除加入甘油、甲醇外，还需要提供的营养物质有 。 13．（2024·浙江·三模）葡萄是两性花植株。无核葡萄品质优良，但抗寒性差，中国野生山葡萄具有较强抗寒性。回答下列问题： Ⅰ．利用中国野生山葡萄培育抗寒无核葡萄品种 (1)人工杂交。研究者对无核种子败育型（经过授粉受精，胚和胚乳一段时间后停止发育）葡萄植株进行 、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的 ，完成杂交。 (2)胚离体培养。杂交后7-10天，剪取子房经75%乙醇或 消毒后，用 多次冲洗，用解剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。 Ⅱ．利用基因工程技术对抗寒相关D基因的功能展开相关研究 (3)科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中，如下图所示。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。 ①为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的 组，此外还需额外添加 ，通过显色反应做进一步验证。 A组：加色氨酸和组氨酸 B组：不加色氨酸和组氨酸 C组：加组氨酸，不加色氨酸 D组：加色氨酸，不加组氨酸 ②实验结果表明抗寒相关D基因编码的蛋白质具有转录激活功能，完善实验分组及预期实验结果。 对照组1：酵母菌导入pG-GAL4重组载体，实验结果：有菌落，变蓝。 对照组2：酵母菌导入 ，实验结果： 。 实验组：酵母菌导入 ，实验结果： 。 (4)将抗寒相关D基因导入无核葡萄植株中，研究者常构建含D基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，用含 的培养基筛选愈伤组织，用PCR方法筛选出 植株，72小时 诱导培养，检测植株中D蛋白的含量以判断抗寒能力。 14．（2024·浙江·三模）农杆菌转化法存在单个Ti质粒可承载外源基因大小有限的不足，研究人员通过改进转化过程，获得了抗虫牧草。表为实验所用菌株和质粒特性，图为质粒2的T-DNA片段基因和限制酶识别序列分布。 实验农杆菌和质粒特性 菌株 E 含有利福平抗性基因 质粒 1 质粒 2 含有链霉素抗性基因和 Vir基因，无T-DNA 片段 含有卡那霉素抗性基因，无Vir基因，有T-DNA 片段 备注：利福平、链霉素和卡那霉素都是抗生素， Vir 基 因在特定物质下表达， 其产物是 T-DNA 片段转入植物 细胞的必需物质。有无 T-DNA 片段不影响质粒其他基因的表达。 回答下列问题： (1)愈伤组织获取。选取牧草种子后，剥去外壳，70%乙醇消毒后，用 冲洗，接种在培养基中，通过 和细胞增殖，获得愈伤组织。 (2)构建重组载体和转化农杆菌。选用限制酶 对质粒2进行酶切，目的是保留潮霉素抗性和 。用 处理农杆菌后，将其与质粒1和质粒2共培养一段时间。将转化后的农杆菌接种到含有 的培养基中培养，一段时间后，挑取单克隆培养物，接种到不含抗生素的培养基中培养一段时间。采用双质粒转化农杆菌的优点是 。 (3)转基因愈伤组织的获取。将重组农杆菌分别接种至含乙酰丁香酮（AS）和不含AS的培养基中预培养，再与愈伤组织共培养3天，然后取少量愈伤组织接种到不同浓度潮霉素的培养基中培养30分钟，结果如表所示。 表不同浓度潮霉素对愈伤组织存活率的影响 潮霉素浓度（mg/L） 0 20 40 60 80 不含 AS 组存活率（%） 93 86 23 0 0 含 AS 组存活率（%） 93 90 77 15 0 由表2可知，AS的作用是 ，应选用 的潮霉素浓度作为筛选浓度对所有转化后愈伤组织进行筛选。 (4)抗虫牧草的鉴定。将愈伤组织接种至分化培养基培养至幼苗，经炼苗后，转移至移植到土壤中培育，获得抗虫牧草甲、乙、丙。取三组牧草的适量叶片细胞，提取总DNA。以抗虫基因的特异序列和叶肉细胞自身基因的特异序列分别做2对引物，PCR扩增后进行 ，结果显示植株甲、丙成功导入抗虫基因，组1和组2分别是阴性对照和阳性对照，请在电泳结果图2上绘制组1和组2的电泳结果 。植株甲和丙不能立即推广种植，原因是 。 15．（2024·浙江宁波·二模）草甘膦是一种除草剂，但会影响水稻产量。水稻产量与高产基因有关，研究人员拟采用农杆菌转化法对水稻高产基因进行定位，并进一步培育能稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。回答下列问题： Ⅰ.水稻高产基因定位水稻穗粒数可影响水稻产量。农杆菌 Ti质粒的 T－DNA 可以转移并随机插入野生型水稻基因组中（可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点），导致被插入的基因功能丧失，从而得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常突变体，并进行下列研究。 (1)提取 DNA。采集适量突变体和野生型水稻的幼嫩叶片，分别冷冻后研磨成粉末状，依次加入SDS、RNA酶等试剂，去除蛋白质和 等大分子杂质。提取过程中需加入 酶抑制剂并保持轻柔操作，以避免 ，从而提高总 DNA提取率。 (2)PCR扩增。对提取获得的两组总DNA分别进行PCR 扩增。为避免外源DNA等因素的污染，微量离心管、枪头和蒸馏水等在 PCR 前需进行 处理。可以通过在紫外灯下直接观察电泳结果中DNA条带的 及粗细程度来评价扩增是否成功。 (3)结果鉴定。分别用EcoRI、Hind Ⅲ、BamHI三种限制酶处理突变体总DNA 扩增产物，处理后进行电泳，并与野生型 DNA 和 Ti质粒对照。电泳后的 DNA 与含放射性同位素标记的 DNA 探针（T－DNA的一条单链） 进行杂交，得到突变体总 DNA 不同酶切处理后的放射性检测结果如图1所示。 ①不同酶切结果的杂交带位置不同的原因是：不同酶切后含 的片段长度不同，因此各组 DNA片段在凝胶中电泳时的 不同，最终导致分布于不同位置。 ②若杂交结果显示突变体在不同限制酶处理时均出现杂交带，野生型组 （填“有”或“无”） 杂交带， Ti质粒组 （填“有”或“无”） 杂交带，则表明T－DNA 成功插入水稻染色体基因组中，且可判断突变体为T－DNA 位点插入，依据是 。（注：T－DNA 上没有 EcoRI、HindⅢ、BamHI三种限制酶的酶切位点）。 (4)用某种限制酶处理突变体的DNA（如图2所示），断开DNA 分子中的 个磷酸二酯键，再用 将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用下表中的引物①②进行 PCR，扩增出 序列，扩增产物 （填“不含”或“含”）T－DNA 完整序列。经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T－DNA 插入2号染色体上的B基因中。 T-DNA序列 引物序列 5ˊ-AACTATGCGC…….CGTAGCCTAT-3ˊ ①5ˊ-GCGCATAGTT-3ˊ 3ˊ-TTGATACGCG…….GCATCGGATA-5ˊ ②5ˊ-CGTAGCCTAT-3ˊ (5)研究发现，该突变体产量明显低于野生型，据此推测 B基因可 （填“促进”或“抑制”） 水稻穗粒的形成，可控制高产性状。 Ⅱ.抗草甘膦高产水稻培育，研究者构建如图3所示的Ti表达载体，采用农杆菌转化法将抗草甘膦基因R 和基因B转入野生型水稻中，培育稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。 (6)转基因技术的理论基础有：T－DNA 和水稻 DNA 均为 结构、生物界共用一套 等。 (7)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S 是 ，其功能是 酶的识别和结合部位。Ti 表达载体中，B基因和R基因转录的模板链的方向 （填“相同”或“相反”）。 (8)现需选出单一位点插入R基因和B基因且稳定遗传的水稻新品种，筛选方案如下： ①转基因后的水稻植株自交，收获种子（F₁） 并播种在含 的选择培养基上，若能够萌发并生长的个体即为 的个体； ②F₁存活个体自交所得种子（F₂） 按单株收种并播种于选择培养基上，选择存活率约 的培养基中的幼苗继续培养获得F₂植株； ③将F₂植株自交所得种子（F₃）按单株收种并播种于选择培养基上，选择种子全部存活的培养基中的幼苗即为单一位点插入且 的抗草甘膦植株。 ④为实现最终育种目标，研究人员还需检测 。 16．（2024·浙江金华·二模）组培再生体系是进行植物遗传转化、开展功能基因组学研究的前提条件，然而目前羊角蜜的组培再生及遗传转化体系仍不成熟。科研人员研究了外植体类型、激素浓度和农杆菌菌株等因素对其组培再生和遗传转化的影响。请回答下列问题： (1)切取播种后2d子叶节（子叶节-2DAS），播种后5d子叶节（子叶节-5DAS）和下胚轴（下胚轴-5DAS），置于诱导培养基（MS+0.5mg·L-16-BA+1mg·L-1ABA+30g·L-1蔗糖+9g·L-1琼脂）进行愈伤和不定芽诱导，结果如图1、图2所示；并进行了不同浓度6-BA[0（L1）、0.25（L2）、0.375（L3）、0.5（L4）、1（L5）和2（L6），各组单位均为mg·L-1]对不定芽诱导效果的实验，结果如图3所示。    由于所取的外植体具有 ，因此可在诱导培养基上直接诱导发芽。根据图1、图2可得出的结论是 。图3结果 （填“能”或“不能”）表明6-BA对诱导不定芽形成具有两重性。然后切取具有明显生长点的不定芽，置于生根培养基诱导生根，2周后观察并统计生根情况。生根培养基与发芽培养对比，主要的区别是 。 (2)通常用农杆菌转化法将外源基因导入到羊角蜜细胞中，以改造其遗传特性。农杆菌能将T质粒中的 片段转移并整合到羊角蜜细胞的染色体上。转化操作前，需要对野生农杆菌的Ti质粒进行T-DNA基因改造，改造后的质粒如图4所示，其中启动子来源于 （填“农杆菌”或“羊角蜜细胞”）；标记基因1的作用是 ；标记基因2的作用是 。据图可知，标记基因2与报告基因的模板链不在同一条DNA条链上，原因是 。利用报告基因（本研究用绿色荧光蛋白基因GFP基因）与目的基因相连形成融合基因，用于鉴定目的基因是否在角蜜细胞中表达。    (3)农杆菌侵染外植体后，需在培养基中加入 以抑制农杆菌生长。而后将不含农杆菌的外植体组培至幼苗。统计荧光幼苗数与幼苗总数，并计算出侵染效率1；并利用PCR技术鉴定并统计含有CFP基因的幼苗数，并计算出侵染效率2。结果发现侵染效率2大于侵染效率1，推测可能原因是 。用PCR技术鉴定时，科研人员设计了正向引物（与模板链结合的引物）GFP-F和反向引物GFP-R进行基因鉴定，请在下图方框中标出两种引物在GFP基因上结合的位置 。    为了更准确地鉴定出GFP基因，设计引物时需考虑的因素有 。 17．（2024·浙江台州·二模）家蚕核型多角体病毒可侵染BmN细胞，其基因组中的Bm90基因在病毒感染周期中的表达以及对病毒增殖和组装均有一定作用。为进一步研究其功能，科学家构建了Bm90基因缺失型病毒（简称缺失型病毒）及Bm90基因补回型病毒（简称补回型病毒）2种重组病毒，与野生型病毒一起进行实验。回答下列问题： (1)自然界中病毒粒子的构造简单，通常包含一个外壳和核衣壳包裹的 。精确有效地研究某病毒特定基因的功能，往往需要在该病毒的基因组中诱变或 该基因。 (2)为了获取大量的Bm90基因，可通过检索基因数据库获取序列，利用 法合成，再根据合成的序列设计 ，在 酶的作用下，通过PCR技术实现Bm90基因的体外扩增；也可将Bm90基因与 载体连接，导入到大肠杆菌实现Bm90基因的菌体内扩增。 (3)构建Bm90基因表达载体后，需导入 （状态）的大肠杆菌细胞中，培养后收集菌体经超声波处理使细胞 ，然后进行蛋白质电泳分析鉴定。得到电泳条带后在相应部位割胶以纯化Bm90蛋白。再以Bm90蛋白为 ，注射到大白兔体内，利用相关技术制备Bm90蛋白的单克隆抗体，可用于Bm90基因表达的研究。 (4)将3种病毒的基因组DNA经脂质体法分别转染BmN细胞，收集转染后24、48、72和96h的BmN细胞，加入细胞裂解液和 制备蛋白质样品，以未转染病毒的细胞总蛋白质为阴性对照，利用蛋白质凝胶电泳检测Bm90蛋白的表达，结果如图。从表达时相来看，Bm90蛋白的表达特点是 。 CK：正常BmN细胞1-4：野生型病毒转染后24、48、72、96h；5-8：缺失型病毒转染后24、48、72、96h；  9-12：补回型病毒转染后24、48、72、96h；Bm90基因缺失型和补回型病毒转染BmN细胞后Bm90蛋白的表达情况 (5)为进一步研究Bm90 基因在病毒增殖中的作用，取3种病毒的基因组DNA经脂质体法分别转染BmN细胞，收集转染后24、48、72和96h的细胞培养上清液，测定病毒浓度。结果表明Bm90基因是病毒增殖的必需基因，Bm90 基因缺失使病毒失去了产生子代病毒粒子的能力，而Bm90基因的补回可使病毒恢复产生子代病毒粒子的能力。根据实验结论，用坐标曲线图表示实验结果 。 18．（2024·浙江·二模）野生型果蝇的眼色为暗红眼（++），现有两个纯合突变品系朱砂眼（cc）和猩红眼（ss）。为进一步研究其眼色的遗传机制，进行了三组杂交实验，结果如下表。 实验 P F1 ① 朱砂眼×野生型 野生型 ② 猩红眼×野生型 野生型 ③ 朱砂眼×猩红眼 野生型 回答下列问题： (1)雌果蝇的生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子，供多次受精使用。进行杂交实验前，应选择 的雌果蝇作为实验材料。 (2)由实验结果可知，该果蝇的突变眼色为 性状，控制突变品系的c基因与s基因 （“可能”或“不可能”）是等位基因。 (3)若c基因与s基因位于一对同源染色体上，则实验③F1相互交配产生的F2，其眼色表型及比例为 。 (4)若c基因与s基因位于两对同源染色体上，请尝试写出实验③亲本杂交得到F1过程的遗传图解： （要求写配子）。 (5)为探究s基因的分子作用机制，研究者分别提取 品系果蝇的基因组，设计特异性引物，对+和s基因片段进行PCR扩增后电泳，并对其表达量进行测定，结果见图1和图2所示。推测+基因发生了碱基对的 而突变为s基因，导致其基因表达量 ，从而引起了果蝇体内色素的含量变化。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！4 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$