专题25 基因工程-2025年高考生物一轮复习热点专题精练（江苏专用）

专题25 基因工程 一、单选题 1．（2024·江苏·模拟预测）苏云金杆菌是一种细菌，它能产生使棉铃虫死亡的杀虫蛋白，这种杀虫蛋白对人和牲畜无任何毒害作用。科学家将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入棉花细胞，获得了能产生杀虫蛋白的抗虫棉，提高了棉花的产量。下列相关叙述不正确的是（    ） A．苏云金杆菌有成形的细胞核 B．抗虫棉的培育使用了转基因技术 C．苏云金杆菌是单细胞生物 D．该方法能减少农药对环境的污染 【答案】A 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 【详解】A、苏云金杆菌是原核生物，没有成形的细胞核，A错误； B、抗虫棉的培育是将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入棉花细胞，使用了转基因技术，B正确； C、苏云金杆菌是单细胞生物，一个细胞就是一个个体，C正确； D、抗虫棉的培育和种植，可以减少农药的使用，减少农药对环境的污染，D正确。 故选A。 2．（2024·江苏盐城·模拟预测）常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列相关叙述错误的是（    ） A．细胞分化与组织特异型启动子的调控和组成型启动子均有关 B．膀胱生物反应器的构建需要将目的基因连接在诱导型启动子的下游 C．真核生物细胞中，一般一个启动子只能启动一个基因的转录 D．强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性 【答案】B 【分析】动物基因工程的应用：培育快速生长的转基因动物，如转基因绵羊、转基因鲤鱼；改善畜产品品质的转基因动物，如乳汁中含乳糖较少的转基因牛；生产药物的转基因动物，如利用乳腺生物反应器生产药物；作器官移植供体的转基因动物，如无免疫排斥的转基因猪。 【详解】A、根据题干信息“组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达”，所以在细胞分化过程中，与组成型启动子有关，组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，所以细胞分化与组织特异型启动子的调控也有关，A正确； B、组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，而乳腺生物反应器需要将目的基因连接在组织特异性启动子的下游，导入细胞中，保证基因在乳腺细胞中表达，B正确； C、一般情况下，真核生物细胞中，一个启动子只能启动一个基因的转录，C正确； D、强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性，从而启动基因的转录，D正确。 故选B。 3．（2024·江苏盐城·模拟预测）PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是（    ）    A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸 B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关 C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物 D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充 【答案】D 【分析】PCR技术: 1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 2、原理：DNA复制。 3、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。 4、过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 【详解】A、TaqDNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确； B、图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，引物长度越长或者GC含量越高，则复性的温度设置越高，B正确； C、经过5次循环后会产生25=32个，其中只有2个DNA分子含有最初的模板链，另仅含有第一次复制产生的单链参与形成的DNA分子有8个，因此经过5次复制产生等长的目的基因片段32-10=22个，C正确； D、PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。 故选D。 4．（2024·江苏南通·模拟预测）下列有关PCR技术的叙述，正确的是（    ） A．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异 B．引物较短以及退火温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物 C．利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序 D．应用RT-PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶仅有耐高温DNA聚合酶 【答案】B 【分析】PCR的三个步骤分别是①、变性：利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链；②、退火：低温（经常是50℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；③、延伸：当调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。 【详解】A、在设定的PCR体系下可以特异性扩增目标DNA片段，主要是因为加入了与特定部位结合的引物，引物可以通过碱基互补配对特异性结合到模板DNA的相应位置，复性过程中引物结合到互补链DNA上，故不同反应体系PCR的温度差别主要表现为退火温度的差异，A错误； B、若退火温度低，引物较短时，引物和模板匹配低时，也能稳定存在，那么模板上可能存在很多区域能和引物上的少量碱基匹配，可能形成大量非特异性扩增产物，B正确； C、镰状细胞贫血患者的红细胞呈镰状，但其为哺乳动物成熟的红细胞，不含细胞核，不含核基因，因此无法利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序，C错误； D、应用RT-PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶有耐高温DNA聚合酶、逆转录酶，D错误。 故选B。 5．（2024·江苏扬州·模拟预测）研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述错误的是（    ） A．过程①一般需要用促性腺激素处理 B．过程②存在多种防止多精入卵的机制 C．过程③后应筛选出导入表达载体的胚胎 D．过程④需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 【答案】D 【分析】胚胎移植的生理学基础： ①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境； ②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能； ③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能； ④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。 【详解】A、过程①用促性腺激素对供体进行超数排卵处理，获得更多的卵母细胞，A正确； B、受精过程中存在防止多精子入卵的两道屏障是透明带反应和卵黄膜的封闭作用，B正确； C、将基因表达载体导入受体细胞后要筛选出导入表达载体的胚胎，C正确； D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，故过程④不需要抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥，D错误。 故选D。 6．（2024·江苏盐城·模拟预测）图1为DNA分子片段的结构模式图，图2为人体细胞内DNA复制部分过程，下列说法错误的是（　　） A．图1DNA的双链结构中，碱基的比例总是（A+G）/（T+C）=1 B．冈崎片段的存在，可进一步证明子链的延伸方向必然是5’→3’ C．据图2推测，细胞内DNA复制所用引物的去向与PCR时所用引物的去向是一样的 D．图1中，②和①的交替链接，构成DNA的基本骨架 【答案】C 【分析】DNA分子双螺旋结构的主要特点是：①DNA分子是由两条单链组成的，这两条链按反向平行方式盘旋成双螺旋结构；②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧；③两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对，并且碱基配对遵循碱基互补配对原则，即A（腺嘌呤）与T（胸腺嘧啶）配对，G（鸟嘌呤）与C（胞嘧啶）配对。 【详解】A、依据碱基互补配对原则可推知：在DNA的双链结构中，A＝T，G＝C，因此碱基比例总是（A+G）/（T+C）＝1，A正确； B、据图2分析可知，冈崎片段是在DNA复制过程中形成的短片段，它们的存在证明了DNA的复制不是连续的，而是半不连续的。即一条链是连续复制（前导链），另一条链是分段复制（后随链，形成冈崎片段）。由于DNA聚合酶只能从5'到3'方向合成DNA，因此这些冈崎片段的存在进一步证实了子链的延伸方向必然是5'→3'。B正确； C、据图2分析可知，在人体细胞内DNA复制过程中，引物是用于启动DNA复制的短RNA片段，它们会在复制过程中被新合成的DNA链所替换。而在PCR中，引物是人工合成的DNA片段，用于引导DNA的合成。在PCR过程中，引物不会被替换，而是作为DNA合成的一部分被保留下来。因此，细胞内DNA复制所用引物的去向与PCR时所用引物的去向是不同的，C错误； D、根据图1分析可知，①是磷酸基团，②是脱氧核糖，而DNA分子双螺旋结构的主要特点之一是：DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成DNA的基本骨架，D正确。 故选C。 7．（2024·江苏·模拟预测）真核细胞转座子有逆转录转座子和 DNA 转座子之分，可在染色体内部和染色体间转移。该过程依托转座酶将转座子两端特定序列进行切割，再将其插入到DNA分子的特定位点中，具体机制如下图①和②所示。下列相关叙述错误的是（    ）    A．转座酶和限制性内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键 B．转座引起的变异类型有基因突变、基因重组和染色体变异 C．DNA转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变 D．逆转录转座子通常存在于外显子等不易于转录的区域 【答案】D 【分析】可遗传的变异有三种来源：基因突变、染色体变异和基因重组。（1）基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换。（2）基因重组的方式有同源染色体上非姐妹单体之间的交叉互换和非同源染色体上非等位基因之间的自由组合，另外，外源基因的导入也会引起基因重组。（3）染色体变异是指染色体结构和数目的改变。 【详解】A、转座酶将转座子两端特定序列进行切割，破坏的是磷酸二酯键，限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，因此转座酶和限制性内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键，A正确； B、转座子在DNA分子内部转移，可造成基因突变，在真核细胞染色体内部转移，可造成基因重组，在染色体间转移造成染色体变异，B正确； C、由图可知，逆转录转座子不仅改变其在染色体上的位置，总数还会增多，DNA转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变，C正确； D、编码区分为能编码蛋白质的外显子和不能编码蛋白质的内含子，逆转录转座子通常存在于外显子等易于转录的区域，D错误。 故选D。 8．（2024·江苏南通·二模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述中，错误的是（    ） A．可将提取到的白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝 B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶可在延伸过程中起作用 C．琼脂糖溶液混合的核酸染料与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精来粗提DNA 【答案】A 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。 【详解】A、将丝状物溶于2mol/L的5mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现蓝色，A错误； B、PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在延伸过程中根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，B正确； C、琼脂糖溶液混合的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，C正确； D、DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精、但某些蛋白质溶于酒精的原理，可以初步粗提取DNA，D正确。 故选A。 9．（2024·江苏南通·二模）在Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列相关说法正确的是（　　） A．细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要Mg2+ B．PCR技术中的DNA聚合酶在90℃条件下不会失活 C．DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的3'端延伸子链 D．真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白 【答案】B 【分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用也需要Mg2+，A错误； B、DNA聚合酶在90℃条件下不会失活，B正确； C、DNA聚合酶需不与启动子结合，C错误； D、真核细胞内的DNA聚合酶也可以在细胞质发挥作用，D错误。 故选B。 10．（2024·江苏·一模）“标记”是生物技术与工程常用的技术手段，下列相关叙述错误的是（    ） A．诱导植物原生质体融合时，通过红绿荧光蛋白标记检测细胞融合情况 B．分析工程酵母发酵产物的合成及分泌时，通过同位素标记监测产物转移路径 C．验证转基因抗虫棉是否成功时，通过RNA分子标记检测目的基因是否表达 D．对目的基因进行扩增时，通过荧光标记技术实时定量测定产物的量 【答案】C 【分析】标记常见的方法有荧光标记法，同位素标记法。 【详解】A、诱导植物原生质体融合时，利用红绿荧光标记蛋白，通过红绿荧光蛋白标记混合情况检测细胞融合情况，A正确； B、利用同位素标记法可以监测工程酵母发酵产物的合成及分泌时产物转移路径，B正确； C、验证转基因抗虫棉是否成功时，应该通过接种实验验证，即为转基因抗虫棉接种相应抗的害虫，检测抗虫棉是否表现出抗虫特性，C错误； D、对目的基因进行扩增时，可通过荧光标记技术，利用荧光基团和淬灭基团制成探针，实时定量测定产物的量，D正确。 故选C。 11．（23-24高三下·江苏镇江·开学考试）Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质，常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述，正确的是（　　） A．每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连 B．Ti质粒复制时具有多起点和双向复制特点 C．用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入 D．Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上 【答案】A 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 2、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】A、Ti质粒是双链环状DNA分子，每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连，A正确； B、Ti质粒通常具有单起点复制特性，在宿主细胞中，质粒能够自主复制，一般只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子,B错误； C、用Ca2＋处理农杆菌有利于重组Ti质粒的导入，C错误； D、Ti质粒的T-DNA片段可随机整合到受体细胞染色体的DNA上，D错误。 故选A。 12．（23-24高三下·江苏南通·开学考试）在利用洋葱进行“DNA的粗提取和鉴定”的实验中，相关操作正确的是（    ） A．研磨洋葱时，加入适量的研磨液瓦解细胞膜，充分释放核DNA B．利用定性滤纸进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度 C．向DNA滤液中加入等体积、预冷的50%酒精，以获得DNA粗提物 D．将白色丝状物加入4mL二苯胺试剂中沸水浴，以利于发生颜色反应 【答案】A 【分析】1、DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性； （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色； 2、DNA粗提取和鉴定的过程： （1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大； （2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可，如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜，例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液； （3）去除滤液中的杂质； （4）DNA的析出与鉴定：粗提取的DNA与二苯胺试剂，混合均匀后变蓝。 【详解】A、研磨洋葱时，加入适量的研磨液作用是瓦解细胞膜，有利于细胞破裂，充分释放核DNA，A正确； B、利用纱布进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度，B错误； C、向DNA滤液中加入等体积、预冷的95%酒精，以获得DNA粗提物，C错误； D、将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL二苯胺溶液，沸水浴，以利于发生颜色反应，D错误。 故选A。 13．（2024·江苏连云港·一模）基因工程中，为方便纯化蛋白质，构建表达载体时可将目的基因序列与标签基因序列连接，表达含有标签的融合蛋白。下图为某质粒编码链（转录时的非模板链）的部分序列。下列相关叙述错误的是（　　） A．转录后的mRNA序列与图中DNA序列一致，仅T替换为U B．若目的蛋白中只保留组氨酸标签，选择酶切位点时优先考虑Nde I和Xho I（或Ava I） C．若目的蛋白中保留了组氨酸标签，翻译时标签下游的基因序列不编码氨基酸 D．以组氨酸标签的基因序列为模板设计下游引物，扩增导入成功的目的基因时，获得的序列可能比预期的序列短 【答案】D 【分析】限制酶可将特定的DNA序列切割后形成黏性末端或者平末端，在DNA连接酶的作用下末端可进行连接从而实现基因的重新组合。 【详解】A、质粒的编码链不含内含子，与转录后的mRNA链序列一致，仅T换成U，A正确； B、若目的蛋白中只保留组氨酸标签，选择酶切位点时优先考虑Nde I和Xho I（或Ava I），以去除T7标签的基因序列，同时保留Nde I识别序列中对应的起始密码，B正确； C、标签下游TGA对应的密码子为UGA，为终止密码，不编码氨基酸，C正确； D、扩增导入成功的目的基因时，以组氨酸标签的基因序列为模板设计下游引物，获得的序列为目的基因序列+标签基因序列，比预期的序列长，D错误。 故选D。 14．（23-24高三上·江苏苏州·期末）当细胞接受到凋亡信号后，位于线粒体内膜上的细胞色素c（参与电子传递）会释放进而引发细胞凋亡。研究人员用某种药物处理家蚕细胞不同时间后，用凝胶电泳法测定细胞不同结构中细胞色素c及微管蛋白的含量，结果如下图所示。下列有关叙述错误的是（　　） A．细胞色素c参与有氧呼吸第三阶段的化学反应 B．在细胞中含量比较稳定的微管蛋白可作为实验参照 C．该种药物可促使细胞色素c释放到细胞质基质 D．凝胶电泳分离不同蛋白分子的关键是所带电荷性质 【答案】D 【分析】分析题图，用药物处理家蚕细胞后，细胞色素c从线粒体中逐渐释放出来进入细胞质基质。 【详解】A、细胞色素c位于线粒体内膜上参与电子传递，线粒体内膜是有氧呼吸第三阶段的场所，A正确； B、实验结果中，用微管蛋白作为实验参照，是因为其在细胞中含量比较稳定，B正确； C、使用药物后，随着时间延长，线粒体中的细胞色素c逐渐减少，而细胞质基质中的细胞色素c逐渐增多，可以推测该种药物可促使细胞色素c释放到细胞质基质，C正确； D、凝胶电泳分离不同蛋白分子的关键是分子大小，D错误。 故选D。 15．（23-24高三上·江苏扬州·阶段练习）酿酒酵母产酒精能力强，但没有合成淀粉酶的能力；糖化酵母能合成淀粉酶，但酒精发酵能力弱。科研人员通过两种途径如下图改良酵母菌种，实现以淀粉为底物高效生产酒精的目的。下列叙述正确的是（    ）    A．途径I需用纤维素酶处理酵母菌，再利用PEG诱导融合 B．途径Ⅱ需要以淀粉酶基因作为目的基因构建表达载体 C．以淀粉转化为还原糖的效率作为最终鉴定目的菌的指标 D．酵母菌有氧呼吸和无氧呼吸产物不完全相同，根本原因是酶的种类不同 【答案】B 【分析】1、途径Ⅰ利用了细胞融合技术，酵母菌细胞存在细胞壁，如果使二者细胞融合，必须除去细胞壁，根据酵母菌细胞壁的主要成分是几丁质，利用酶的专一性应该选择几丁质酶去除细胞壁，形成原生质体，融合后诱导再生新的细胞壁，形成杂种细胞即杂种酵母。 2、途径Ⅱ利用基因工程的方法，将从糖化酵母中获取的目的基因（淀粉酶基因）导入酿酒酵母中，使其既有合成淀粉酶的能力又有较强的产酒精能力。 【详解】A、途径Ⅰ需用几丁质酶处理酵母菌去除其细胞壁，再利用PEG诱导融合，A错误； B、途径Ⅱ是将糖化酵母的淀粉酶基因提取出来，通过构建基因表达载体导入酿酒酵母细胞中，从而获得目的酵母菌，B正确； C、通过两种途径改良酵母菌种，实现以淀粉为底物高效生产酒精的目的，所以淀粉转化为酒精的效率作为最终鉴定目的菌的指标，C错误； D、酵母菌有氧呼吸和无氧呼吸产物不完全相同，根本原因是基因的选择性表达，D错误。 故选B。 16．（23-24高三上·江苏盐城·期末）下列关于PCR技术相关叙述正确的是（    ） A．DNA聚合酶可从引物的5端开始连接脱氧核苷酸 B．退火温度过低导致得不到任何产物，过高导致产生非特异性片段 C．PCR反应体系中需加入TaqDNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用 D．扩增DNA片段的过程中，第n次循环共需要引物2n+1-2个 【答案】C 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、DNA聚合酶可从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，A错误； B、退火温度过低会导致引物与模板链不能形成互补的碱基对，从而不能进行延伸，过高会导致引物与非特异性片段结合，进而产生非特异性片段，B错误； C、PCR反应体系中需加入TaqDNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，C正确； D、扩增DNA片段的过程中，第n次循环共需要引物[（2n+1-2）-（2n-2）]=2n个，D错误。 故选C。 17．（23-24高三上·江苏·期末）农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法正确的是（　　） A．PCR扩增依据的是DNA分子边解旋边复制的特点 B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA 的插入位置 【答案】D 【分析】PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 2、原理：DNA复制。 3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】AB、PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，该过程是先解旋后复制，不需要解旋酶，AB错误； C、DNA的两条链反向平行，子链从引物的3′端开始延伸，则利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误； D、T-DNA的插入会改变基因的排列顺序，可通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置，D正确。 故选D。 18．（23-24高三上·江苏泰州·阶段练习）亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的880kb至903kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如图所示，下列说法错误的是（    ）    A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的8号染色体上的DNA进行PCR扩增 B．该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了碱基对的替换 C．据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小 D．该突变体的出现改变了该种群的基因频率，为生物进化提供了原材料 【答案】B 【分析】分析题图可知，分子量较大的扩增产物迁移速率慢，与点样处的距离较小，分子量较小的扩增产物迁移速率快，与点样处的距离较大。 【详解】A、由于8号染色体的~880 kb至~903 kb区间与突变体的光籽表型相关，故提取突变体和野生型的8号染色体上的DNA进行PCR扩增，A正确； B、根据题图分析，野生型和突变体经引物6扩增的产物不同，其中突变体的相应扩增产物较大，故可推知8号染色体上的引物6对应的区间发生碱基对的增添是该突变体光籽性状出现的根本原因，B错误； C、图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的，相对分子质量较大的扩增产物迁移速率较慢，与点样处的距离较近，C正确； D、基因突变、染色体变异和基因重组可为生物进化提供了原材料，生物进化的实质是种群基因频率的改变，D正确。 故选B。 19．（22-23高三上·江苏南通·阶段练习）OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如下图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　） A．图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去侵染能力 B．DNA的两条单链都可作为转录的模板链 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四种基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译 【答案】B 【分析】1、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 2、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术。 3、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、T-DNA可将T-DNA之间的DNA序列转移并整合至受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够稳定遗传，故T-DNA插入外源基因后不会失去作用，A错误； B、由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时不都以DNA的同一条单链为模板，因此DNA的两条单链都可作为转录的模板链，不同的基因转录的模板链可能不同，B正确； C、卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误； D、由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入到水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。 故选B。 20．（22-23高二下·江苏南通·阶段练习）人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，改造后的t-PA蛋白能显著降低出血副作用。下图表示构建含t-PA改良基因重组质粒的过程示意图。相关说法错误的是（　　） A．构建重组质粒时，选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ B．需要DNA聚合酶将t-PA改良基因与质粒连接 C．新霉素抗性基因的作用是便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来 D．在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存，②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入，③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的的切制位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶Xmal和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接，A正确； B、将t-PA改良基因与质粒连接的酶是DNA连接酶，不是DNA聚合酶，B错误； C、在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即该基因的作用是便于将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，C正确； D、重组质粒已经破坏了mlacZ基因，其不会表达产物，即细胞呈白色。所以，在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株，D正确。 故选B。 二、多选题 21．（22-23高三下·江苏南京·期中）通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述错误的是（　　）    A．限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5’端 B．PCR反应体系需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等 C．第2轮PCR中，引物1与图中②结合形成两条链等长的突变基因 D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4 【答案】BC 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。 【详解】A、DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的（从引物的3'端延伸），据此可知，图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5’端，A正确； B、PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液（含Mg2+）等物质，B错误； C、第2轮PCR中，引物1与图中②结合形成两条链不等长的突变基因，因为图中②是由引物2开始直到完整的DNA单链，而引物1与该模板链的复性过程并没有从该模板DNA单链的一端开始，C错误； D、在第3轮PCR结束后，会产生23=8个DNA分子，其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有两个，其他的DNA分子均是不等长的，故含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4，D正确。 故选BC。 22．（23-24高三上·江苏淮安·期中）下列关于DNA片段扩增及其鉴定的叙述正确的有（    ） A．凝胶中DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来 B．-20℃储存的缓冲液和酶，为了加快融化速度，可以从冰箱取出直接水浴加热 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小、构象等有关 D．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前须进行无菌处理 【答案】ACD 【分析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反方向的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂凝胶电泳来鉴定。 【详解】A、凝胶中的DNA分子经染色后，对波长为300nm的紫外光吸收性强，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，A正确； B、缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化，B错误； C、DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子大小、构象等有关外，还与凝胶的浓度有关，C正确； D、PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前须进行高压灭菌处理，防止外源DNA等因素的污染，D正确。 故选ACD。 23．（2024·江苏扬州·模拟预测）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是（    ）    A．为连入GUS 基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 B．表达载体中GUS 基因和LUC基因转录时使用T-DNA的同一条DNA单链为模板 C．可用农杆菌转化法将表达载体导入植物细胞，在培养基中添加壮观霉素进行筛选 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子是否发挥了作用 【答案】ABC 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，A错误； B、表达载体中GUS 基因和LUC基因转录时双向启动子的转录方向不同，使用T-DNA的模板链也不同，B错误； C、将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，但壮观霉素抗性基因位于T-DNA序列之外，可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C错误； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选ABC。 24．（2024·江苏连云港·模拟预测）生物技术与工程的发展催生了生物药的生产。下列生物技术相关操作的叙述错误的是（    ） A．将基因组文库中的胰岛素基因与大肠杆菌的DNA重组后可利用发酵工程生产胰岛素 B．对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，对培养基及动物血清要湿热灭菌 C．体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度 D．将药用蛋白基因与腺病毒重组，然后侵染奶牛的乳腺可得到乳腺生物反应器 【答案】ABD 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。 （4）目的基因的检测与鉴定 【详解】A、从基因组文库中获得的胰岛素基因有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素，A错误； B、对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，对培养基要湿热灭菌，但是动物血清并不能用高温灭菌，否则会使其中部分有效成分失活，B错误； C、体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度，因为血浆中可能有其他的抗体，C正确； D、将药用蛋白基因和乳腺蛋白启动子等调控元件一起与腺病毒重组，导入受精卵中可制备乳腺生物反应器，不是导入乳腺中，D错误。 故选ABD。 25．（2024·江苏南通·二模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间后，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。分别用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述正确的是（　　） A．提取丝状物时双向缓慢搅拌更有利于获得结构完整的DNA B．电泳鉴定时，被染色的质粒还需要通过紫外灯才能看到结果 C．根据电泳结果，质粒上一定有限制酶I和Ⅱ的切割位点 D．溶菌酶能溶解大肠杆菌的细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜 【答案】BD 【分析】DNA的粗提取和鉴定：利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，以及DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可以将DNA与蛋白质分离开；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A、在提取白色丝状物时用玻璃棒轻轻单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA，A错误； B、电泳鉴定时，被染色的质粒还需要通过紫外灯，会发出荧光，在特定的仪器下能看到结果，B正确； C、质粒的化学本质是环状的DNA，且由图可知，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有1个条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，即质粒上不一定含有限制酶I和Ⅱ的切割位点，但限制酶III切割后有2个条带，故一定有限制酶Ⅲ的切割位点，C错误； D、溶菌酶能溶解大肠杆菌的细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响，D正确。 故选BD。 26．（23-24高三下·江苏扬州·开学考试）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，其中 V5 编码序列表达一种标签短肽V5．图乙表示重组质粒正确表达后用抗J蛋白抗体和抗 V5 抗体分别检测相应蛋白的结果。下列说法正确的是（    ） A．若用PCR 法确定J基因是否正确连接到质粒中，应选择的引物组合为F1和R1 B．若b链是J基因转录的模板链，则可推知引物F1与图甲中J基因a链相应部分的序列相同 C．若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制DNA聚合酶对启动子的识别和结合 D．图乙条带1表明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的 【答案】BD 【分析】基因表达载体的结构：①启动子：RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动RNA转录；②终止子：使转录停止的“信号灯”；③标记基因：便于重组DNA分子的筛选；④目的基因；复制原点。 【详解】A、引物F2和R1或F1和R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此若用PCR 法确定J基因是否正确连接到质粒中，应选择的引物组合为F2和R1或F1与R2，A错误； B、b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，B正确； C、启动子是转录时RNA聚合酶的识别和结合位点，因此若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制 RNA 聚合酶对启动子的识别和结合，C错误； D、图乙条带1可以和抗J蛋白抗体和抗 V5 抗体结合，表明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2只能和抗J蛋白抗体结合，不能和抗 V5 抗体结合，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合基因表达的，D正确。 故选BD。 27．（23-24高三上·江苏盐城·期末）单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。有一对夫妇均为镰形细胞贫血致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为这对夫妇和孩子核酸分子杂交诊断的结果示意图。下列相关叙述正确的有（    ）    A．与图中正常基因模板链杂交的探针碱基对应序列为“5'—AACTCGT-3'” B．根据凝胶电泳带谱分析，基因纯合的是Ⅱ-2 C．该地区镰形细胞贫血患病率为1/10000，若Ⅱ-3与另一正常女子婚配，则生出患病孩子的概率为1/202 D．若将正常的血红蛋白基因成功导入患者的骨髓造血干细胞中，可用于治疗该病 【答案】ACD 【分析】镰刀型细胞贫血症为常染色体隐性遗传病，一对夫妇均为携带者，设相关基因为B、b，则该夫妇的基因型均为Bb。 【详解】A、据图可知，正常基因模板链的核酸序列5’-ACGAGTT-3’，按照碱基互补配对的原则，则与图中正常基因模板链杂交的探针碱基对应序列为“5'—AACTCGT-3'”，A正确； B、图中夫妇的基因型均为Bb，根据凝胶电泳带谱分析，基因纯合的是Ⅱ-2和Ⅱ-1，他们的基因型依次为bb和BB，B错误； C、该地区镰形细胞贫血患病率为1/10000，说明该地区人群中b的基因频率为1/100，则B的基因频率为99/100，则正常人群中携带者的概率为2×1/100×99/100÷（1-1/10000）=2/101，结合图示可知，Ⅱ-3 的基因型为Bb，若其与正常女子Bb或BB婚配，则生出患病孩子的概率为2/101×1/4=1/202，C正确； D、镰刀型细胞贫血症是由基因突变导致的，属于遗传病，将正常血红蛋白的基因导入患者的骨髓造血干细胞中则可产生正常的红细胞，进而可达到治疗目的，D正确。 故选ACD。 三、非选择题 28．（2024·江苏南通·三模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的一种传染病。下图表示研究人员扩增ASFV的CP530R 和 F317L基因，并导入含病毒载体1和pSC101质粒的大肠杆菌，在细胞内实现同源重组并制备重组病毒疫苗的主要过程。pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒（在30℃下能复制、在37℃下不能复制），recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导。请回答下列问题。 (1)引物F的设计依据是 。过程①的程序为：98℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，35个循环；72℃3min。最后72℃3min的目的是 。 (2)ccdB基因编码的毒性蛋白CcdB抑制DNA促旋酶，导致细胞死亡。ccdA基因编码的蛋白CcdA 可保护细胞免受CcdB毒害。将大肠杆菌先接种在含 的培养基中，在 ℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；一段时间后将大肠杆菌接种在含 的培养基中，在 ℃下继续培养，获得含病毒载体2的大肠杆菌。 (3)据重组原理可知重组蛋白 RecT 的功能有 ，重组过程涉及 键的水解和形成。 (4)转化后的 Vero细胞，在37℃、含 （气体条件）的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用 技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是 。 【答案】(1) TK1 序列、CMV启动子序列 使子链充分延伸 (2) 鼠李糖、阿拉伯糖 30 氯霉素 37 (3) 与单链结合，保持单链稳定、介导单链入侵 磷酸二酯 (4) 5%CO2和95%空气 抗原-抗体杂交 能增殖，较长时间刺激免疫系统 【分析】PCR是一项根据DNA半保留复制原理进行的体外DNA复制技术，包括变性、复性和延伸三步。 【详解】（1）由图可知，使用引物F和引物R的目的是扩增出目的基因，同时便于扩增后的DNA片段进行同源重组，故引物F的设计依据是TK1 序列、CMV启动子序列。72℃属于延伸过程，故最后72℃3min的目的是保证延伸时间，使子链充分延伸。 （2）recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导，故先将大肠杆菌先接种在含鼠李糖、阿拉伯糖的培养基中，pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒，在30℃下能复制、在37℃下不能复制，先在30℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；由于大肠杆菌中含有氯霉素抗性基因，故一段时间后将大肠杆菌接种在含氯霉素的培养基中，在37℃下继续培养，阻止质粒pSC101复制，从而获得含病毒载体2的大肠杆菌。 （3）由图可知，据重组原理可知重组蛋白 RecT 能够与单链结合，保持单链的稳定，介导单链入侵，重组过程涉及到DNA片段的替换，故该过程涉及磷酸二酯键的水解和形成。 （4）转化后的 Vero细胞，在37℃、含5%CO2和95%空气的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用抗原-抗体杂交技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是能增殖，较长时间刺激免疫系统。 29．（23-24高二下·江苏无锡·阶段练习）BMP15蛋白由卵母细胞分泌，在哺乳动物卵巢、卵泡的生长发育、成熟以及排卵过程中起着不可或缺的作用。科研人员克隆出新西兰白兔BMP15基因后，构建该基因的真核表达载体，并对产生的BMP15蛋白进行分析，相关实验过程如图1所示。请回答下列问题。 (1)选取幼龄健康的新西兰白兔雌兔，采集 组织的 RNA，经①~③过程可获得大量的BMP15基因。①②过程中需要用到的酶分别是 。 (2)③过程中，添加的一种引物序列为5′—CGGAATTCGGATGGCCCTCCTCAGCATCCT—3′，则下列序列中最有可能是另一种引物序列的是______。 A．5′—GGTGGTTGGTTGGGCTTTTCAATTCCCGCG—3′ B．5′—TCAGGACGTGTACAGCCACTCCATGGGGC—3′ C．5′—CGGGGTACCTCACCGACATGTGCAGGACT—3′ D．5′—AGGTACCTGAGGAGGGCCATCCGAATTCCG—3′ (3)图示重组载体pCMV-Myc-BMP15中，未标明的结构有 ，CMV启动子的作用是 。 (4)④步骤应将转化好的菌涂在含有 的培养基上，筛选获取菌落。若通过抗原—抗体杂交技术来检测融合Myc-tag标签的BMP15蛋白是否表达成功，一般需加入 。 (5)实验组将重组载体pCMV-Myc-BMP15转染到人胚肾细胞HEK293T内，对照组将 转染到相应受体细胞，收取细胞样品用于检测mRNA和蛋白质水平的表达效果。检测结果如图2（CON：对照组；OVE：重组质粒转染组）。    分析图示结果可知， 。 (6)对不同物种BMP15基因进行核苷酸序列比较，得到下表，据表推测，兔与 的亲缘关系最近。 比较项目 同源性（%） 兔 马 猪 绵羊 鸡 　 变异度（%） 兔 　 81.2 81.9 79.9 38.3 兔 马 18.8 　 82.2 84.5 38 马 猪 18.1 18.1 　 87 38.6 猪 绵羊 19.2 16.5 13.4 　 39.7 绵羊 鸡 88.5 90.3 92.6 86.4 　 鸡 　 兔 马 猪 绵羊 鸡 　 【答案】(1) 卵巢 逆转录酶、RNA水解酶 (2)C (3) 复制原点、终止子 与RNA聚合酶结合，驱动BMP15基因和Myc-tag序列转录 (4) 氨苄青霉素 Myc抗体 (5) pCMV-Myc空载体 与对照组相比，BMP15基因mRNA水平和蛋白水平的表达效果均上升 (6)猪 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术；PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 【详解】（1）BMP15蛋白由卵母细胞分泌，所以应采集新西兰白兔卵巢组织的RNA，经RT-PCR过程获得大量的BMP15基因。图1中①是逆转录，需要逆转录酶，②是将cDNA上的RNA序列水解，需要RNA水解酶。 （2）由图1可知，③过程获得的大量的BMP15基因需要和pCMV-Myc载体拼接，而pCMV-Myc载体是用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ切割的，所以BMP15基因也需要用同种酶切割，已知添加的一种引物序列为5’—CGGAATTCGGATGGCCCTCCTCAGCATCCT—3’，其上含有EcoR Ⅰ的识别序列，所以添加的另一种引物上应含有Kpn Ⅰ的识别序列，5’—CGGGGTACCTCACCGACATGTGCAGGACT—3’上含有该识别序列，C正确，ABD错误。 故选C。 （3）图示重组载体pCMV-Myc-BMP15中，未标明的结构有复制原点、终止子，CMV启动子的作用是与RNA聚合酶结合，驱动BMP15基因和Myc-tag序列转录。 （4）重组载体含有氨苄青霉素抗性基因，含有重组载体的大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，所以④步骤应将转化好的菌涂在含有氨苄青霉素的培养基上进行筛选，获取菌落，没有转化的大肠杆菌不能形成菌落。可通过抗原-抗体杂交实验，加入Myc抗体来检测BMP15基因是否表达，因为BMP15基因与Myc基因形成融合基因，表达后形成融合蛋白，Myc表达即意味着BMP15基因表达。 （5）实验组将重组载体pCMV-Myc-BMP15转染到人胚肾细胞HEK293T内，对照组将pCMV-Myc空载体转染到相应受体细胞，收取细胞样品用于检测mRNA和蛋白质水平的表达效果。分析图示结果可知，与对照组相比，BMP15基因mRNA水平和蛋白水平的表达效果均上升。 （6）对不同物种BMP15基因进行核苷酸序列比较，据表可知，兔与猪的同源性最高，所以兔与猪的亲缘关系最近。 30．（2024·江苏南通·模拟预测）烟草具有生长周期短、生长环境要求低、叶片生物量大等优点，是良好的植物生物反应器。FLAG是由8个氨基酸组成的标签短肽，在基因工程中广泛应用，FLAG抗体常用于融合蛋白的分离、纯化。下图1表示科研人员构建瞬时超表达病毒载体感染烟草叶肉细胞，表达FLAG抗体，并纯化和鉴定的相关过程。构建的微型质粒无Vir序列，辅助Ti质粒无T-DNA序列，两者均显著小于野生Ti质粒。①～⑦代表相关过程，请回答下列问题。 LB和RB：T-DNA左右边界；C：病毒复制蛋白基因；T：终止子；HC、LC：抗体重链和轻链编码区；P35S：花椰菜花叶病毒启动子；GFP：绿色荧光蛋白基因：Kanr：卡那霉素抗性基因；Vir：表达产物参与T-DNA的转移 (1)过程①用FLAG注射小鼠，过程②从小鼠脾脏中获取 ，与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得杂交瘤细胞，再利用 技术获得能产生FLAG抗体的杂交瘤细胞。 (2)构建重组微型质粒时，选择 酶对微型质粒进行酶切，PCR扩增LC基因时，在基因一端不选择添加BamHⅠ识别序列，选择BgIⅡ识别序列，可能原因有 、 。 (3)与将目的基因和Vir序列插入同一质粒导入农杆菌相比，图中将目的基因和Vir序列插入不同质粒导入农杆菌的优点是 。 (4)过程⑤可通过检测 初步判断目的基因是否表达。T-DNA进入烟草叶肉细胞后就能迅速表达出大量FLAG抗体，从重组微型质粒组成分析，主要原因是 。 (5)过程⑦通过蛋白印迹技术分析抗体的亲和力，结果如下图所示（各检测组抗体量相同，抗原带有荧光标记）。结果表明在抗原稀释至 时仍有明显的荧光带，说明通过烟草生产的FLAG抗体具有较高的亲和力。 (6)与原核生物反应器相比，利用烟草生物反应器生产抗体的优点有 。 ①可利用生物膜系统对蛋白质进行加工 ②需要无菌、无毒环境 ③不需要较复杂的培养基 ④抗体易分离提纯 【答案】(1) 已免疫的B淋巴细胞 克隆化培养和抗原-抗体杂交 (2) XhoⅠ和BamHⅠ LC基因中有BamHⅠ识别序列 BglⅡ和BamHⅠ是同尾酶 (3)质粒更小，转化成功率更高（或可导入较大的目的基因） (4) 叶片是否具有绿色荧光 T-DNA中的C给基因可使T-DNA快速复制，P35S能使目的基因高效表达 (5)1ng.ml-1 (6)①③ 【分析】1、基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 2、单克隆抗体的制备：(1)制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞； (2)获得杂交瘤细胞：①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体； (3) 克隆化培养和抗体检测； (4)将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖；(5)提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取。 【详解】（1）在FLAG单克隆抗体过程中，首先需要用FLAG作为抗原刺激小鼠，以获得能产生FLAG抗体的已免疫的B淋巴细胞，经筛选或得杂交瘤细胞后，这些杂交瘤细胞种类较多，需要从中选出只能产生FLAG抗体得杂交瘤细胞，需要利用细胞的克隆化培养和抗原-抗体杂交技术筛选出既能产生FLAG抗体、又能大量增殖的杂交瘤细胞。 （2）由图可知，微型质粒上有XhoⅠ、BamHⅠ、BglⅡ三种限制酶的识别序列，其中BglⅡ位于终止子之后，因此只能选择位于启动子与终止子之间的XhoⅠ、BamHⅠ；分析题图可知，构建重组微型质粒过程中，PCR扩增LC基因后，将LC作为目的基因与微型质粒相连，通过酶切后要求目的基因和微型质粒上有相同的黏性末端，因此不选择添加BamHⅠ识别序列，选择BglⅡ识别序列，可能原因是LC基因上已有BamHⅠ识别序列，但位于基因编码区，使用酶BamHⅠ会破坏LC基因，BglⅡ与BamHⅠ是同尾酶，可使目的基因与微型质粒产生相同的黏性末端。 （3）根据题意，微型质粒较小，且微型质粒的T-DNA转移是需要Vir表达产物参与，因此二者插入不同质粒导入农杆菌，既能使质粒更小，转化成功率更高，也可携带更大的目的基因，同时也可使农杆菌中表达Vir表达产物，不影响T-DNA的转移。 （4）根据题图可知，含有目的基因的重组微型质粒的启动子与终止子之间有目的基因和GFP，若该对启动子与终止子正常发挥功能，则目的基因和GFP均可转录出产物甚至可能同时翻译出相关蛋白质，因此可用GFP基因表达产物绿色荧光蛋白初步判断目的基因是否表达，即检测叶片是否具有绿色荧光；因重组微型质粒上含有C（病毒复制蛋白基因），该基因可使重组微型质粒快速复制，同时重组微型质粒上还含有P35S，作为病毒的启动子，其启动转录的作用很强，因此T-DNA进入烟草叶肉细胞后就能迅速复制且表达出大量FLAG抗体。 （5）由图可知，在实验所给的浓度范围内，有明显荧光带的抗原最低浓度为1ng.ml-1。 （6）原核生物细胞中只有核糖体一中细胞器，抗体作为分泌蛋白，需要内质网高尔基体的加工才具备生物活性，利用烟草生物反应器生产抗体，可利用细胞中的内质网和高尔基体等细胞器对蛋白质进行加工，这两类细胞器均为膜性细胞器，属于生物膜系统的一部分，即可利用生物膜系统对蛋白质进行加工；原核生物通常为单细胞生物，需要配置培养基进行培养，而烟草作为生产者，种植之后可利用土壤、空气等自然环境中的物质，无需配置较复杂的培养基。 31．（2024·江苏扬州·模拟预测）乙醇是一种绿色、可再生能源。高粱等植物的秸秆主要水解产物是木糖，可以用作乙醇生产的原材料。酿酒酵母不能直接利用木糖进行乙醇发酵。研究人员通过生物工程手段使酵母细胞提高木糖转运效率，并将木糖代谢相关的XR酶和XDH酶的基因导入野生型的酿酒酵母中，在酵母细胞内建立起了某木糖代谢的通路。 (1)XR酶和XDH酶的基因导入野生型的酿酒酵母中，新建立起的木糖代谢通路是图1中的 （填写“途径I”或“途径II”）。研究人员采用PCR技术扩增时随机改变反应条件，创建一系列木糖转运体蛋白新基因序列，导入受体细胞后筛选得到了高亲和性的木糖转运体，发现其第4个氨基酸由甘氨酸替换为丙氨酸，此改造过程属于 工程，涉及的可遗传变异来源有 。 (2)为进一步提高乙醇的产量，研究人员利用基因工程技术将XK基因与强启动子相连，导入受体细胞中，观察工程菌的乙醇发酵情况，技术路线如图2所示，其中①～④代表PCR扩增引物编号，LEU2基因是亮氨酸合成基因，URA3基因是尿嘧啶合成基因。 PCR扩增XK基因时选择的引物是图2中的 （用编号选填），为了使XK基因与载体质粒有效连接，可以通过PCR技术在XK基因的上下游引入限制性内切核酸酶 的识别序列。 (3)为比较不同工程菌的乙醇发酵情况，研究人员制备工程菌a和工程菌b，根据图2，完成下列表格填空： 制备工程菌a 制备工程菌b 导入质粒 重组质粒① 重组质粒b 受体细胞 ② 缺陷型酿酒酵母 尿嘧啶缺陷型酿酒酵母 筛选用培养基 木糖为唯一碳源、缺少亮氨酸、缺少尿嘧啶 ③ 在同等适宜条件下分别将工程菌a和工程菌b进行发酵实验，发现工程菌a的乙醇产量是工程菌b的1.5倍，结合图1、2，工程菌a提高了乙醇产量的原因是 。 (4)研究人员还在嗜热细菌中发现了XI酶，将XI酶的相关基因导入野生型的酿酒酵母，建立了图1中途径II所示的木糖代谢通路。但并没有表现出比野生型酿酒酵母更优良的木糖利用率和乙醇产率。其原因可能是 。 【答案】(1) 途径I 蛋白质 基因突变和基因重组 (2) ②③ Bcl Ⅱ (3) ①a和b ②亮氨酸和尿嘧啶 ③木糖为唯一碳源、缺少尿嘧啶 工程菌a与工程菌b相比，导入了与增强启动子相连的XK基因，使得细胞超表达XK酶，提高了木糖代谢的中间产物木酮糖转变为X5P的效率，有利于产物向乙醇发酵转化 (4)导入XI酶基因的酿酒酵母转运木糖的效率并没有提高；XI酶最适反应温度偏高 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。 【详解】（1）研究人员将木糖代谢相关的XR酶和XDH酶的基因导入野生型的酿酒酵母中，在酵母细胞内建立起了某木糖代谢的通路。据此分析图1可知：新建立起的木糖代谢通路是图1中的途径Ⅰ。基因突变是新基因产生的途径。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，基因工程的原理是基因重组。研究人员采用PCR技术扩增时随机改变反应条件，创建一系列木糖转运体蛋白新基因序列，导入受体细胞后，筛选得到的高亲和性的木糖转运体的第4个氨基酸由甘氨酸替换为丙氨酸，说明此改造过程属于蛋白质工程，涉及的可遗传变异来源有基因突变和基因重组。 （2）为了使XK基因与载体质粒有效连接，可以通过PCR技术在XK基因的上、下游引入限制酶Bcl Ⅱ的识别序列，之所以这样设计是因为在质粒的强启动子和终止子之间只有该限制酶的识别序列，因此为了实现目的基因和载体的连接，需要在引物的5′ 端添加上该限制酶的识别序列，再用对应酶切后通过DNA连接酶连接。由于引物的作用是在DNA聚合酶的催化下，在引物的3′ 端连接上脱氧核苷酸，且引物应接在模板链的3′ 端，因此，设计的扩增引物位置是图2中的②③。 （3）制备工程菌a导入的是质粒a和质粒b，其中含有亮氨酸合成基因（LEU2基因）和尿嘧啶合成基因（URA3基因），因此所用的受体细胞是亮氨酸和尿嘧啶缺陷型酿酒酵母。制备工程菌b导入的是质粒b，质粒b中含有尿嘧啶合成酶基因，因此，所用的受体细胞是尿嘧啶缺陷型酿酒酵母。工程菌a中导入了重组质粒a和b，因而成功导入的工程菌应该具有合成亮氨酸和尿嘧啶的能力，同时也可利用木糖，因此可在培养基中加入木糖为唯一碳源、缺少亮氨酸、缺少尿嘧啶，将工程菌a筛选出来。工程菌b中导入了重组质粒b，具有利用木糖的能力和自身合成尿嘧啶的能力，因此需要用作筛选的培养基中加入木糖为唯一碳源、缺少尿嘧啶。工程菌a与工程菌b相比，导入了与增强启动子相连的XK基因，使得细胞超表达XK酶，提高了木糖代谢的中间产物木酮糖转变为X5P的效率，有利于产物向乙醇发酵转化，因此，在同等适宜条件下分别将工程菌a和工程菌b进行发酵实验，工程菌a的乙醇产量高于工程菌b的乙醇产量。 （4）将从嗜热细菌中提取的XI酶的相关基因导入野生型的酿酒酵母，建立了图1中途径II所示的木糖代谢通路。但该酿酒酵母并没有表现出比野生型酿酒酵母更优良的木糖利用率和乙醇产率。其原因可能是：导入XI酶基因的酿酒酵母转运木糖的效率并没有提高；XI酶最适反应温度偏高，该酿酒酵母并不能为木糖转运过程和XI酶活性提供最适的反应温度。 32．（2024·江苏盐城·模拟预测）江苏某研究团队利用TetR和GFP两种基因，构建了监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”大肠杆菌工程菌。限制酶的识别序列及切割位点、TerR和GFP两种基因所在的DNA片段以及相关的载体如图1所示，监测原理如图2所示。天然大肠杆菌中不具备TerR、GFP和Ampr（青霉素抗性基因）这三种基因。请据图回答下列问题： 限制酶 EcoRI XbaI SpeI BamHI 识别序列及切割位点 (1)基因工程的核心工作是 。若要拼接DNA片段1和2，结合图1中信息，在 酶作用后再添加 酶，可拼接成功。成功拼接后的连接处碱基序列为 （按5'→3'的顺序只写一条链）。最终构建成功的重组质粒示意图是 （填字母）。 A．  B.   C．    D. (2)在上述研究中，需导入天然菌的基因有 （编号选填）。 ①四环素合成相关基因②GFP基因③TetR基因④RNA聚合酶基因 (3)据图2分析，该工程菌检测环境中四环素水平的原理是 。 (4)下列操作不能证明重组质粒和大肠杆菌工程菌建构成功的方法及现象有 。 a．通过琼脂糖凝胶电泳实验证明重组质粒的大小符合预期 b．大肠杆菌工程菌不能在含有青霉素的培养基上生长 c．用显微镜观察重组质粒上的外源DNA片段的碱基序列 (5)为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP蛋白的第65位丝氨酸替换成苏氨酸，该项技术属于 。 【答案】(1) 基因表达载体的构建 XbaI和SpeI DNA连接 5'TCTAGT3'或5'ACTAGA3' D (2)②③ (3)当环境中含四环素时，抑制TetR蛋白作用增强，解除TetR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白（GFP蛋白）而发光 (4)bc (5)蛋白质工程和基因的定点突变 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因工程的核心工作是基因表达载体的构建。若要拼接DNA片段1和2，XbaI和SpeI酶切后产生的黏性末端相同，所以可用XbaI和SpeI切割DNA片段1和2，然后再用DNA连接酶进行连接，获得拼接DNA。成功拼接后的连接处碱基序列为5'TCTAGT3'（或5'ACTAGA3'），由于重新拼接形成的序列不能被XbaI和SpeI识别，且DNA片段1和2反向连接，则最终构建成功的重组质粒示意图是D。 （2）据图分析可知，启动子1可与RNA聚合酶结合，促进TetR基因的表达TetR蛋白，TetR蛋白抑制启动子2与RNA聚合酶的结合，抑制GFP（绿色荧光蛋白）基因的表达绿色荧光蛋白。四环素可以抑制TetR蛋白的作用，因此当环境中没有四环素时，GFP（绿色荧光蛋白）基因不表达；当环境中有四环素时，四环素能够解除TetR蛋白对启动子2的抑制作用，最终使菌体发出绿色荧光。因此可以通过检测荧光强弱来判定环境中的四环素浓度，因此需导入天然大肠杆菌的目的基因有②③。 （3）当环境中含四环素时，抑制TetR蛋白作用增强，解除TetR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白（GFP蛋白）而发光，因此成功构建的大肠杆菌工程菌，环境中含有四环素能发出绿色荧光。 （4）a.通过琼脂糖凝胶电泳实验证明重组质粒的大小符合预期，说明重组质粒建构成功，a不符合题意； b.含普通质粒和重组质粒的大肠杆菌均含有青霉素抗性基因，从而都能在含有青霉素的培养基上生长，b符合题意； c.显微镜无法观察到重组质粒上的外源DNA片段的核苷酸序列，c符合题意。 故选bc。 （5）该项技术最终改变的是GFP（蛋白质）的结构，属于蛋白质工程。要将GFP的第65位丝氨酸突变成苏氨酸，就需要改变基因中对应的碱基序列，因此也属于基因的定点突变。 33．（2024·江苏连云港·模拟预测）科研人员利用黄曲霉缺陷型（WTpyrg-）菌株（不能合成尿嘧啶和尿苷—简称UU）对黄曲霉相关基因的功能进行研究，部分研究过程如图所示。据图分析回答下列问题。 (1)下表是部分实验操作过程，请将空格处填写完整。 序号 实验操作步骤 具体操作及现象 结论或结果 1 纯种的WTpyrg -菌株的检测 将待测菌株转接在① 上能正常生长，而 接种在② 上却不能生长。 说明该菌株未被污染 2 获得WTpyrg- 菌株的DNA并鉴定 将粗提取并晾干的黄曲霉DNA放入试管 中，加入③ ，沸水浴5min，冷 却后观察溶液呈④ 色。 说明提取物为DNA 3 ⑤ 用WTpyrg-菌株的DNA、缓冲液、上下游 引物、原料、酶等建立反应体系，设置相关程序。 获得大量的DNA片段 (2)图1所示为pyrg基因中一条脱氧核苷酸链，进行PCR扩增pyrg时选用下列哪组引物可以扩增出pyrg序列 A．5′GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC 3′ B．5′GTCTGAGAGGAGGCACTGATGC 3′ C．5′CGGAGTTTGTTACGAGAAGTGGG 3′ D．5′CGTAGTCACGGAGGAGAGTCTG 3′ (3)图2所示，目的基因ORF片段长度约1000bp，通过设计引物扩增目的基因片段的上、下游片段各约1500bp，pyrg基因片段约1891bp，首先将pyrg片段与上下游片段相连接，通过转化将该片段导入受体细胞的目的是 。图3是将pyrg片段与上下游片段相连接后利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，M是参照，则图中 泳道的DNA是目的条带（选填A/B/C）。若扩增结果中出现非目的条带的原因可能有 。 【答案】(1) 普通固体培养基+UU 普通固体培养基 2mol/LNaCL溶液和二苯胺试剂 蓝色 PCR扩增WTpyrg-菌株的DNA片段 (2)AB (3) 替换目的基因片段 A 引物设计不合理，出现二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶质量不好等 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）该菌为黄曲霉缺陷型（WTpyrg-）菌株（不能合成尿嘧啶和尿苷—简称UU），将其接种在普通固体培养基+UU能正常生长，而在普通固体培养基不能生长，说明该菌株未被污染；DNA在2mol/LNaCl溶液中溶解度最大，可以溶解DNA；沸水浴下，二苯胺试剂可以和DNA发生蓝色反应；PCR为体外DNA复制，可以获得大量的DNA。 （2）进行DNA复制时，DNA的两条链为模板链，引物与模板链的3，端结合，因此可以选用引物5′GTCTGAGAGGAGGCACTGATGC 3′和5′CGGAGTTTGTTACGAGAAGTGGG 3′。故选BC。 （3）将pyrg片段与上下游片段相连接，导入受体细胞，可以替换目的基因片段；将pyrg片段与上下游片段相连接，质量为1500bp+1500bp+1891bp=4891bp，A的条带质量与其相近，为目标条带；引物设计不合理，出现二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶质量不好等，都可能出现非目的条带。 34．（2024·江苏盐城·模拟预测）为研究编码铁运输相关蛋白的基因A（约963bp）在拟南芥缺铁胁迫响应中的作用，需要构建超量表达A的拟南芥转基因株系。质粒的结构如图2所示。回答下列问题。    (1)图1中，过程①指的是从拟南芥中提取RNA，经 催化，合成cDNA；过程②指的是以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，需要在引物的 端，加入限制酶 、 的识别序列。 (2)构建表达载体时，将PCR产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA连接酶进行连接，以避免 。 (3)将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR鉴定，如图3所示，选择“1、2”号菌进行测序的原因是 。 (4)将拟南芥的 直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并将得到的种子接种在含有 （抗生素）的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目的基因的阳性植株。 (5)提取转基因及野生型植株的蛋白质进行电泳检测，如图4。若其中 号为转基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A的拟南芥转基因株系。 【答案】(1) 逆转录酶 5’ BamHI Sa1I (2)目标片段与无关片段重新连接（目的基因自连以及质粒自连） (3)图3结果显示1、2的PCR产物长度与A基因相符。但无法确定pcr产物的碱基序列是否与A基因相同 (4) 花序 潮霉素 (5)① 【分析】基因工程的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）图1中，过程①指的是从拟南芥中提取RNA，经逆转录酶催化，合成cDNA；过程②指的是以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，防止限制酶识别序列在基因内部而导致目的基因被切割，需要在引物的5’端，由于KpnI会切割目的基因，再结合质粒上限制酶识别位点与T-DNA的位置关系可知，应加入限制酶BamHI、Sa1I的识别序列。 （2）构建表达载体时，将PCR产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA连接酶进行连接，以避免目标片段与无关片段重新连接（目的基因自连以及质粒自连）。 （3）将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR鉴定，如图3所示，选择“1、2”号菌进行测序的原因是图3结果显示1、2的PCR产物长度与A基因相符，但无法确定pcr产物的碱基序列是否与A基因相同。 （4）将拟南芥的花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，由于T-DNA上有潮霉素抗性基因，所以宿主细胞能够抗潮霉素，然后培养植株并将得到的种子接种在含有潮霉素的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目的基因的阳性植株。 （5）由图4可知，①的目的蛋白含量明显多于②，若①号为转基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A的拟南芥转基因株系。 35．（2024·江苏·模拟预测）虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β-胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”（如图1）构建含BKT基因和CRTR-B基因的表达载体（如图2，3），导入杜氏盐藻，以实现虾青素的工厂化生产，回答下列问题。 (1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总DNA为 ，设计特异性引物扩增BKT基因和CRTR-B基因，此过程需要 酶的催化。 (2)构建转化载体： ①PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的一端添加对应的同源序列。若将来需要将抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则扩增抗除草剂基因时，设计的引物序列（→）为 。 A．同源序列＋抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列 B．同源序列＋限制酶识别序列＋抗除草剂基因部分序列 C．抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列＋同源序列 ②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将BKT基因和CRTR-B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增BKT基因所用的引物为 ；扩增CRTR-B基因所用的引物为 。 ③最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是 。 (3)准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养，一段时间后，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。两次培养的目的分别为 、 。 (4)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，先用含 的培养基初筛已转化的杜氏盐藻，然后采用相关技术检测是否成功表达 。 (5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。 【答案】(1) 模板 耐高温DNA聚合/Taq DNA聚合 (2) B ①③ ⑥⑧ 确保目的基因正常表达 (3) 纯化杜氏盐藻 扩大培养杜氏盐藻 (4) 除草剂 β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶 (5) 目的基因的表达量 基因污染 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）因雨生红球藻是天然虾青素重要来源，是目的基因的来源，故可提取雨生红球藻的总 DNA为模板，设计特异性引物扩增其 DNA中的 BKT基因和CRTR-B 基因进行PCR扩增，此过程需要 Taq DNA聚合酶（耐高温DNA聚合酶）的催化。 （2）①根据 PCR扩增的原理，在 PCR过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在5’ 端添加对应的同源序列；根据题意，若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，则所需引物（5’一 3’）的序列应为“同源序列十限制酶识别序列十特异性扩增引物序列（抗除草剂基因部分序列）”，AC错误，B正确， 故选B。 ②根据图2所示，要通过“无缝克隆法”同时将 BKT基因和CRTR-B 基因插入质粒，则要保证BKT基因一侧有一致同源序列，另一侧能带上CRTR-B 基因，因此扩增 BKT基因所用的引物为①③ ； 同理，扩增CRTR-B基因所用的引物为⑥⑧。 ③启动子是转录的起始信号，选用内源性启动子的目的是防止基因沉默，确保目的基因能表达。 （3）选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养的目的是纯化杜氏盐藻，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养的目的是扩大培养杜氏盐藻。 （4）筛选已转化的杜氏盐藻的培养基是选择培养基，其中含除草剂；再通过抗原—抗体杂交实验检测是否成功表达 β-胡萝卜素酮化酶和 β-胡萝卜素羟化酶。 （5）因每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量；且叶绿体基因位于细胞质中，一般不能稳定遗传，因此可避免基因污染。 36．（2024·江苏·一模）热带玉米（WT）对光周期有较高的敏感性，开花需要短日照条件（SD），只能生活在热带。经长期驯化，进化出适应长日照条件（LD）的温带玉米。研究表明，热带玉米光周期敏感性与ZmCCT9基因有关，Cas9核酸酶敲除该基因过程中，获得了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种突变类型（图1）。在长日照条件下种植，发现三种突变型开花时间明显提前。请回答下列问题。 (1)图1方框中的三个碱基为NGG（N可为任何碱基），若该序列缺失，Cas9核酸酶将无法完成切割，该序列作用是 。结合图1分析，碱基序列中虚线代表 ，从表达结果看，敲除基因会导致 。该基因敲除导致的变异类型属于 。 (2)为探究ZmCCT9基因的表达模式，研究人员测定玉米发育过程中不同部位ZmCCT9表达量（图2），结果表明 。还测定在LD和SD下温带玉米和热带玉米的成熟叶片中ZmCCT9的昼夜表达量（图3），结果显示，在LD条件下， 。 (3)为探究驯化过程中玉米适应长日照的分子机制，测序发现温带玉米和热带玉米的ZmCCT9基因编码区无显著变异位点，但前者在基因上游携带了一段特殊序列（TE元件）。 ①据此推测，TE元件的功能是 。为证明TE元件的功能，需利用相关载体和元件构建LUC基因（一种荧光素酶基因）表达载体，图4长方框中构建的相关元件的先后位置是 （用图中字母排序）。 ②可以预测，实验组玉米细胞荧光比对照组玉米细胞荧光 （填写“强”或“弱”）。 ③根据以上材料，请完善温带玉米适应长日照的调控机制。ZmCCT9启动子（含TE）→ →适应长日照环境 【答案】(1) 便于Cas9核酸酶进行准确定位 敲除序列区域 ZmCCT9基因表达非正常终止（或无法正常表达出相应产物） 基因突变 (2) ZmCCT9基因在热带玉米中表达量高于温带玉米，且主要在成熟叶片表达 热带玉米中ZmCCT9基因昼夜表达量显著高于温带玉米 (3) 抑制ZmCCT9的表达（抑制启动子功能，使基因无法表达） cadb 弱 ZmCCT9基因表达量下降→光周期敏感性下降 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）分析题意，若该序列缺失，Cas9核酸酶将无法完成切割，说明该序列作用是引导Cas9核酸酶到对应位点，便于Cas9核酸酶进行准确定位；结合图1分析，碱基序列中虚线代表敲除序列区域；基因决定蛋白质的合成，从表达结果看，敲除基因会导致一些基因无法执行正常功能，导致ZmCCT9基因表达非正常终止（或无法正常表达出相应产物）；该基因敲除导致的变异类型是基因内碱基对的缺失，属于基因突变。 （2）分析题图，与温带玉米相比，热带玉米的成熟叶片中表达量大，说明ZmCCT9基因在热带玉米中表达量高于温带玉米，且主要在成熟叶片表达；据图3分析，黑桃和白条分别表示48h内黑夜和白天，图示结果表明在LD条件下，热带玉米中ZmCCT9基因昼夜表达量显著高于温带玉米。 （3）①启动子位于基因上游，可启动转录过程，分析题意可知，温带玉米和热带玉米的ZmCCT9基因编码区无显著变异位点，但前者在基因上游携带了一段特殊序列（TE元件），据此推测TE元件的功能是：抑制ZmCCT9的表达（抑制启动子功能，使基因无法表达）；启动子和终止子分别调控基因的转录起始和终止，LUC基因应插入到两者之间，而TE元件应位于启动子上游，故图4长方框中构建的相关元件的先后位置是cadb。 ②由于实验组插入TE元件，抑制表达过程，故实验组玉米细胞荧光比对照组玉米细胞荧光弱。 ③据以上材料可完善温带玉米适应长日照的调控机制;ZmCCT9启动子（含TE）→ZmCCT9基因表达量下降→光周期敏感性下降→适应长日照环境. 37．（2024·江苏南通·一模）蒂蛀虫是荔枝的重要害虫。科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程如下图1所示。图2是SalI、HindⅢ和BamHI三种限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题： (1)与RNA相比，质粒特有的化学成分是 ；抗氨苄青霉素基因的作用是 。 (2)研究人员采用了如下图巢式PCR技术获取抗虫基因，巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。 ①PCR扩增时加入引物的原因是 ，在最后一个循环结束后通常还需要维持72℃5min的目的是 ，PCR产物常采用 来鉴定。 ②相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物概率 ，这是因为 。 ③为了使抗虫基因定向插入质粒中，第二次PCR扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序列是 ，不添加在引物3'端的原因是 。 (3)科研人员采用农杆菌转化法将抗虫基因导入荔枝细胞，由于农杆菌中的 ，能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞 上。 (4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可采用鉴定方法是 。 【答案】(1) 脱氧核糖和胸腺嘧啶 便于筛选含重组DNA分子的受体细胞 (2) Taq酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3’端上 充分延伸子链 琼脂糖凝胶电泳 低 如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式（内）引物能在错误片段上进行配对的概率低 AAGCTT和GTCGAC 使引物的3’端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸 (3) Ti质粒含有一段T-DNA 染色体DNA (4)采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）质粒的本质为小型环状的DNA片段，与RNA相比，质粒特有的化学成分是脱氧核糖和胸腺嘧啶；抗氨苄青霉素基因可作为标记基因，标记基因的作用为便于筛选含重组DNA分子的受体细胞。 （2）①由于Taq酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3’端上，故PCR扩增时加入引物，延伸过程的温度一般为72℃，最后一个循环结束后通常还需要维持72℃5min的目的是充分延伸子链，琼脂糖凝胶电泳能将不同分子量的DNA分开，PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 ②如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式（内）引物能在错误片段上进行配对的概率低，故巢式PCR获得错误目标产物概率低。 ③由图1可知，BamHI会破坏目的基因，所以可以用SalI、HindⅢ两种限制酶切割目的基因的两端及质粒，可防止目的基因和质粒的自我环化或反向连接，所以第二次PCR扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序列是AAGCTT和GTCGAC。子链延伸的方向为5'端→3’端，为了使引物的3’端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸，故不添加在引物3'端。 （3）农杆菌含有Ti质粒，Ti质粒含有一段T-DNA，T-DNA能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。 （4）培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可从个体水平做抗性实验鉴定，鉴定方法是采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况。 38．（23-24高三下·江苏苏州·开学考试）为筛选出宿主细胞中能与某病毒S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，过程如下图。请回答下列问题：    (1)S基因及TAP基因的体外扩增 ①通过PCR体外扩增S基因时，应该在S基因的5'端引入 和 序列，并删除S基因3'端的 编码序列。 ②为了防止PCR反应中发生突变，常选择高保真Pyrobest DNA聚合酶，与一般的Taq DNA聚合酶相比，它具有3'到5'核酸外切酶活性，Pyrobest DNA聚合酶能防止发生突变的原因是 。 ③PCR 一般要经历三十多次循环，在第一次循环之前，常进行预变性（95℃5min），目的是 。 (2)重组质粒的构建 下表为四种限制酶的识别序列及切割位点： 限制酶 Xho l Sma l EcoR I BamH l 识别序列 ↓ 5'-CTCGAG-3' 3'-GAGCTC-5'      ↑ ↓ 5'-CCCGGG-3' 3'-GGGCCC-5' ↑ ↓ 5-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'      ↑ ↓ 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5'      ↑ 由图可知TAP标签应该插入 酶切位点之间，经限制酶切割后，为得到目标 DNA片段，还需要通过 进行鉴定和纯化，再加入DNA连接酶完成质粒的环化。 (3)细胞转染 使用特定转染试剂，将纯化后的重组质粒进行细胞转染，为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做法为 。 (4)融合蛋白的表达 ①TAP标签含有特定的氨基酸序列，可用异硫氰酸荧光素标记的 来检测融合蛋白的表达。 ②研究发现，转染质粒之后融合蛋白的表达量较低，推测原因可能有 a. 重组质粒pcDNA3.1-S-TAP在病毒敏感细胞中大量复制 b. S-TAP融合基因在病毒敏感细胞中转录出的mRNA量较少 c. 病毒敏感细胞与病毒原宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA的tRNA数量不足 ③若病毒敏感细胞在转染前感染过重组痘苗病毒，则共转染后发出荧光的细胞数量会明显增多，且荧光强度显著增强，原因可能是 。 【答案】(1) Kozak序列 Smal识别序列 终止密码子 能切除不正确掺入的单核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸 增加模板DNA分子彻底变性的概率 (2) EcoRI和BamHI 琼脂糖凝胶电泳 (3)使用PCDNA3.1空载体转染细胞，其余操作相同 (4) 特定抗体 bc 重组痘苗病毒感染细胞后，细胞中合成了能与T7特异性结合的RNA聚合酶 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）①根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列，为了使目的基因和质粒连接，根据启动子的方向、质粒上的酶切位以及S基因内部存在XhoI序列进行分析，上游不能用XhoI酶，故应在S基因的上游加入Smal识别序列；因为S基因和TAP序列需要同步表达才能利用TAP作为S蛋白的标签，二者共用一个启动子，故应去除S基因下游的终止密码子编码序列。 ②Pyrobest DNA聚合酶具有3'到5'核酸外切酶活性，能切除不正确掺入的单核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸，故而可防止发生突变。 ③变性是利用高温使DNA解旋，第一次循环之前，常进行预变性可增加模板DNA分子彻底变性的概率，增大PCR成功率。 （2）由图可知TAP标签上游具有EcoRI序列，下游具有BamHI，质粒上也具有EcoRI和BamHI序列，但实际上用EcoRI切割后TAP直接与目的基因下游相连接，故应插入EcoRI和BamHI之间。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 （3）对照组是为了排除空质粒的影响，故应使用PCDNA3.1空载体转染细胞，其余操作相同。 （4）①TAP标签含有特定氨基酸序列，可利用抗原-抗体结合原理，利用异硫氰酸荧光素标记的特定抗体对TAP标签进行检测，从而检测融合蛋白的表达。 ②基因的表达包括转录和翻译两个过程，一方面若S-TAP融合基因在病毒敏感细胞中转录出的mRNA量较少，会导致蛋白表达量低；另一方面tRNA的数量与密码子的使用频率呈正相关，实验所使用的病毒敏感细胞与病毒原宿主细胞在翻译时，若不同密码子的使用频率不同，会导致翻译的tRNA数量不足，导致蛋白表达量低，bc正确。 故选bc。 ③T7是强启动子，能与病毒RNA聚合酶特异性结合，若重组痘苗病毒感染细胞后，细胞中合成了能与T7特异性结合的RNA聚合酶，转染质粒之前若受体细胞感染某重组痘苗病毒，则发出荧光的细胞数量明显增多，且荧光强度显著增强。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题25 基因工程 一、单选题 1．（2024·江苏·模拟预测）苏云金杆菌是一种细菌，它能产生使棉铃虫死亡的杀虫蛋白，这种杀虫蛋白对人和牲畜无任何毒害作用。科学家将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入棉花细胞，获得了能产生杀虫蛋白的抗虫棉，提高了棉花的产量。下列相关叙述不正确的是（    ） A．苏云金杆菌有成形的细胞核 B．抗虫棉的培育使用了转基因技术 C．苏云金杆菌是单细胞生物 D．该方法能减少农药对环境的污染 2．（2024·江苏盐城·模拟预测）常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列相关叙述错误的是（    ） A．细胞分化与组织特异型启动子的调控和组成型启动子均有关 B．膀胱生物反应器的构建需要将目的基因连接在诱导型启动子的下游 C．真核生物细胞中，一般一个启动子只能启动一个基因的转录 D．强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性 3．（2024·江苏盐城·模拟预测）PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是（    ）    A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸 B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关 C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物 D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充 4．（2024·江苏南通·模拟预测）下列有关PCR技术的叙述，正确的是（    ） A．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异 B．引物较短以及退火温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物 C．利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序 D．应用RT-PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶仅有耐高温DNA聚合酶 5．（2024·江苏扬州·模拟预测）研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述错误的是（    ） A．过程①一般需要用促性腺激素处理 B．过程②存在多种防止多精入卵的机制 C．过程③后应筛选出导入表达载体的胚胎 D．过程④需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 6．（2024·江苏盐城·模拟预测）图1为DNA分子片段的结构模式图，图2为人体细胞内DNA复制部分过程，下列说法错误的是（　　） A．图1DNA的双链结构中，碱基的比例总是（A+G）/（T+C）=1 B．冈崎片段的存在，可进一步证明子链的延伸方向必然是5’→3’ C．据图2推测，细胞内DNA复制所用引物的去向与PCR时所用引物的去向是一样的 D．图1中，②和①的交替链接，构成DNA的基本骨架 7．（2024·江苏·模拟预测）真核细胞转座子有逆转录转座子和 DNA 转座子之分，可在染色体内部和染色体间转移。该过程依托转座酶将转座子两端特定序列进行切割，再将其插入到DNA分子的特定位点中，具体机制如下图①和②所示。下列相关叙述错误的是（    ）    A．转座酶和限制性内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键 B．转座引起的变异类型有基因突变、基因重组和染色体变异 C．DNA转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变 D．逆转录转座子通常存在于外显子等不易于转录的区域 8．（2024·江苏南通·二模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述中，错误的是（    ） A．可将提取到的白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝 B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶可在延伸过程中起作用 C．琼脂糖溶液混合的核酸染料与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精来粗提DNA 9．（2024·江苏南通·二模）在Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列相关说法正确的是（　　） A．细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要Mg2+ B．PCR技术中的DNA聚合酶在90℃条件下不会失活 C．DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的3'端延伸子链 D．真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白 10．（2024·江苏·一模）“标记”是生物技术与工程常用的技术手段，下列相关叙述错误的是（    ） A．诱导植物原生质体融合时，通过红绿荧光蛋白标记检测细胞融合情况 B．分析工程酵母发酵产物的合成及分泌时，通过同位素标记监测产物转移路径 C．验证转基因抗虫棉是否成功时，通过RNA分子标记检测目的基因是否表达 D．对目的基因进行扩增时，通过荧光标记技术实时定量测定产物的量 11．（23-24高三下·江苏镇江·开学考试）Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质，常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述，正确的是（　　） A．每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连 B．Ti质粒复制时具有多起点和双向复制特点 C．用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入 D．Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上 12．（23-24高三下·江苏南通·开学考试）在利用洋葱进行“DNA的粗提取和鉴定”的实验中，相关操作正确的是（    ） A．研磨洋葱时，加入适量的研磨液瓦解细胞膜，充分释放核DNA B．利用定性滤纸进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度 C．向DNA滤液中加入等体积、预冷的50%酒精，以获得DNA粗提物 D．将白色丝状物加入4mL二苯胺试剂中沸水浴，以利于发生颜色反应 13．（2024·江苏连云港·一模）基因工程中，为方便纯化蛋白质，构建表达载体时可将目的基因序列与标签基因序列连接，表达含有标签的融合蛋白。下图为某质粒编码链（转录时的非模板链）的部分序列。下列相关叙述错误的是（　　） A．转录后的mRNA序列与图中DNA序列一致，仅T替换为U B．若目的蛋白中只保留组氨酸标签，选择酶切位点时优先考虑Nde I和Xho I（或Ava I） C．若目的蛋白中保留了组氨酸标签，翻译时标签下游的基因序列不编码氨基酸 D．以组氨酸标签的基因序列为模板设计下游引物，扩增导入成功的目的基因时，获得的序列可能比预期的序列短 14．（23-24高三上·江苏苏州·期末）当细胞接受到凋亡信号后，位于线粒体内膜上的细胞色素c（参与电子传递）会释放进而引发细胞凋亡。研究人员用某种药物处理家蚕细胞不同时间后，用凝胶电泳法测定细胞不同结构中细胞色素c及微管蛋白的含量，结果如下图所示。下列有关叙述错误的是（　　） A．细胞色素c参与有氧呼吸第三阶段的化学反应 B．在细胞中含量比较稳定的微管蛋白可作为实验参照 C．该种药物可促使细胞色素c释放到细胞质基质 D．凝胶电泳分离不同蛋白分子的关键是所带电荷性质 15．（23-24高三上·江苏扬州·阶段练习）酿酒酵母产酒精能力强，但没有合成淀粉酶的能力；糖化酵母能合成淀粉酶，但酒精发酵能力弱。科研人员通过两种途径如下图改良酵母菌种，实现以淀粉为底物高效生产酒精的目的。下列叙述正确的是（    ）    A．途径I需用纤维素酶处理酵母菌，再利用PEG诱导融合 B．途径Ⅱ需要以淀粉酶基因作为目的基因构建表达载体 C．以淀粉转化为还原糖的效率作为最终鉴定目的菌的指标 D．酵母菌有氧呼吸和无氧呼吸产物不完全相同，根本原因是酶的种类不同 16．（23-24高三上·江苏盐城·期末）下列关于PCR技术相关叙述正确的是（    ） A．DNA聚合酶可从引物的5端开始连接脱氧核苷酸 B．退火温度过低导致得不到任何产物，过高导致产生非特异性片段 C．PCR反应体系中需加入TaqDNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用 D．扩增DNA片段的过程中，第n次循环共需要引物2n+1-2个 17．（23-24高三上·江苏·期末）农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法正确的是（　　） A．PCR扩增依据的是DNA分子边解旋边复制的特点 B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA 的插入位置 18．（23-24高三上·江苏泰州·阶段练习）亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的880kb至903kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如图所示，下列说法错误的是（    ）    A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的8号染色体上的DNA进行PCR扩增 B．该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了碱基对的替换 C．据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小 D．该突变体的出现改变了该种群的基因频率，为生物进化提供了原材料 19．（22-23高三上·江苏南通·阶段练习）OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如下图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　） A．图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去侵染能力 B．DNA的两条单链都可作为转录的模板链 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四种基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译 20．（22-23高二下·江苏南通·阶段练习）人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，改造后的t-PA蛋白能显著降低出血副作用。下图表示构建含t-PA改良基因重组质粒的过程示意图。相关说法错误的是（　　） A．构建重组质粒时，选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ B．需要DNA聚合酶将t-PA改良基因与质粒连接 C．新霉素抗性基因的作用是便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来 D．在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株 二、多选题 21．（22-23高三下·江苏南京·期中）通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述错误的是（　　）    A．限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5’端 B．PCR反应体系需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等 C．第2轮PCR中，引物1与图中②结合形成两条链等长的突变基因 D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4 22．（23-24高三上·江苏淮安·期中）下列关于DNA片段扩增及其鉴定的叙述正确的有（    ） A．凝胶中DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来 B．-20℃储存的缓冲液和酶，为了加快融化速度，可以从冰箱取出直接水浴加热 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小、构象等有关 D．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前须进行无菌处理 23．（2024·江苏扬州·模拟预测）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是（    ）    A．为连入GUS 基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 B．表达载体中GUS 基因和LUC基因转录时使用T-DNA的同一条DNA单链为模板 C．可用农杆菌转化法将表达载体导入植物细胞，在培养基中添加壮观霉素进行筛选 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子是否发挥了作用 24．（2024·江苏连云港·模拟预测）生物技术与工程的发展催生了生物药的生产。下列生物技术相关操作的叙述错误的是（    ） A．将基因组文库中的胰岛素基因与大肠杆菌的DNA重组后可利用发酵工程生产胰岛素 B．对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，对培养基及动物血清要湿热灭菌 C．体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度 D．将药用蛋白基因与腺病毒重组，然后侵染奶牛的乳腺可得到乳腺生物反应器 25．（2024·江苏南通·二模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间后，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。分别用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述正确的是（　　） A．提取丝状物时双向缓慢搅拌更有利于获得结构完整的DNA B．电泳鉴定时，被染色的质粒还需要通过紫外灯才能看到结果 C．根据电泳结果，质粒上一定有限制酶I和Ⅱ的切割位点 D．溶菌酶能溶解大肠杆菌的细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜 26．（23-24高三下·江苏扬州·开学考试）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，其中 V5 编码序列表达一种标签短肽V5．图乙表示重组质粒正确表达后用抗J蛋白抗体和抗 V5 抗体分别检测相应蛋白的结果。下列说法正确的是（    ） A．若用PCR 法确定J基因是否正确连接到质粒中，应选择的引物组合为F1和R1 B．若b链是J基因转录的模板链，则可推知引物F1与图甲中J基因a链相应部分的序列相同 C．若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制DNA聚合酶对启动子的识别和结合 D．图乙条带1表明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的 27．（23-24高三上·江苏盐城·期末）单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。有一对夫妇均为镰形细胞贫血致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为这对夫妇和孩子核酸分子杂交诊断的结果示意图。下列相关叙述正确的有（    ）    A．与图中正常基因模板链杂交的探针碱基对应序列为“5'—AACTCGT-3'” B．根据凝胶电泳带谱分析，基因纯合的是Ⅱ-2 C．该地区镰形细胞贫血患病率为1/10000，若Ⅱ-3与另一正常女子婚配，则生出患病孩子的概率为1/202 D．若将正常的血红蛋白基因成功导入患者的骨髓造血干细胞中，可用于治疗该病 三、非选择题 28．（2024·江苏南通·三模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的一种传染病。下图表示研究人员扩增ASFV的CP530R 和 F317L基因，并导入含病毒载体1和pSC101质粒的大肠杆菌，在细胞内实现同源重组并制备重组病毒疫苗的主要过程。pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒（在30℃下能复制、在37℃下不能复制），recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导。请回答下列问题。 (1)引物F的设计依据是 。过程①的程序为：98℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，35个循环；72℃3min。最后72℃3min的目的是 。 (2)ccdB基因编码的毒性蛋白CcdB抑制DNA促旋酶，导致细胞死亡。ccdA基因编码的蛋白CcdA 可保护细胞免受CcdB毒害。将大肠杆菌先接种在含 的培养基中，在 ℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；一段时间后将大肠杆菌接种在含 的培养基中，在 ℃下继续培养，获得含病毒载体2的大肠杆菌。 (3)据重组原理可知重组蛋白 RecT 的功能有 ，重组过程涉及 键的水解和形成。 (4)转化后的 Vero细胞，在37℃、含 （气体条件）的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用 技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是 。 29．（23-24高二下·江苏无锡·阶段练习）BMP15蛋白由卵母细胞分泌，在哺乳动物卵巢、卵泡的生长发育、成熟以及排卵过程中起着不可或缺的作用。科研人员克隆出新西兰白兔BMP15基因后，构建该基因的真核表达载体，并对产生的BMP15蛋白进行分析，相关实验过程如图1所示。请回答下列问题。 (1)选取幼龄健康的新西兰白兔雌兔，采集 组织的 RNA，经①~③过程可获得大量的BMP15基因。①②过程中需要用到的酶分别是 。 (2)③过程中，添加的一种引物序列为5′—CGGAATTCGGATGGCCCTCCTCAGCATCCT—3′，则下列序列中最有可能是另一种引物序列的是______。 A．5′—GGTGGTTGGTTGGGCTTTTCAATTCCCGCG—3′ B．5′—TCAGGACGTGTACAGCCACTCCATGGGGC—3′ C．5′—CGGGGTACCTCACCGACATGTGCAGGACT—3′ D．5′—AGGTACCTGAGGAGGGCCATCCGAATTCCG—3′ (3)图示重组载体pCMV-Myc-BMP15中，未标明的结构有 ，CMV启动子的作用是 。 (4)④步骤应将转化好的菌涂在含有 的培养基上，筛选获取菌落。若通过抗原—抗体杂交技术来检测融合Myc-tag标签的BMP15蛋白是否表达成功，一般需加入 。 (5)实验组将重组载体pCMV-Myc-BMP15转染到人胚肾细胞HEK293T内，对照组将 转染到相应受体细胞，收取细胞样品用于检测mRNA和蛋白质水平的表达效果。检测结果如图2（CON：对照组；OVE：重组质粒转染组）。    分析图示结果可知， 。 (6)对不同物种BMP15基因进行核苷酸序列比较，得到下表，据表推测，兔与 的亲缘关系最近。 比较项目 同源性（%） 兔 马 猪 绵羊 鸡 　 变异度（%） 兔 　 81.2 81.9 79.9 38.3 兔 马 18.8 　 82.2 84.5 38 马 猪 18.1 18.1 　 87 38.6 猪 绵羊 19.2 16.5 13.4 　 39.7 绵羊 鸡 88.5 90.3 92.6 86.4 　 鸡 　 兔 马 猪 绵羊 鸡 　 30．（2024·江苏南通·模拟预测）烟草具有生长周期短、生长环境要求低、叶片生物量大等优点，是良好的植物生物反应器。FLAG是由8个氨基酸组成的标签短肽，在基因工程中广泛应用，FLAG抗体常用于融合蛋白的分离、纯化。下图1表示科研人员构建瞬时超表达病毒载体感染烟草叶肉细胞，表达FLAG抗体，并纯化和鉴定的相关过程。构建的微型质粒无Vir序列，辅助Ti质粒无T-DNA序列，两者均显著小于野生Ti质粒。①～⑦代表相关过程，请回答下列问题。 LB和RB：T-DNA左右边界；C：病毒复制蛋白基因；T：终止子；HC、LC：抗体重链和轻链编码区；P35S：花椰菜花叶病毒启动子；GFP：绿色荧光蛋白基因：Kanr：卡那霉素抗性基因；Vir：表达产物参与T-DNA的转移 (1)过程①用FLAG注射小鼠，过程②从小鼠脾脏中获取 ，与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得杂交瘤细胞，再利用 技术获得能产生FLAG抗体的杂交瘤细胞。 (2)构建重组微型质粒时，选择 酶对微型质粒进行酶切，PCR扩增LC基因时，在基因一端不选择添加BamHⅠ识别序列，选择BgIⅡ识别序列，可能原因有 、 。 (3)与将目的基因和Vir序列插入同一质粒导入农杆菌相比，图中将目的基因和Vir序列插入不同质粒导入农杆菌的优点是 。 (4)过程⑤可通过检测 初步判断目的基因是否表达。T-DNA进入烟草叶肉细胞后就能迅速表达出大量FLAG抗体，从重组微型质粒组成分析，主要原因是 。 (5)过程⑦通过蛋白印迹技术分析抗体的亲和力，结果如下图所示（各检测组抗体量相同，抗原带有荧光标记）。结果表明在抗原稀释至 时仍有明显的荧光带，说明通过烟草生产的FLAG抗体具有较高的亲和力。 (6)与原核生物反应器相比，利用烟草生物反应器生产抗体的优点有 。 ①可利用生物膜系统对蛋白质进行加工 ②需要无菌、无毒环境 ③不需要较复杂的培养基 ④抗体易分离提纯 31．（2024·江苏扬州·模拟预测）乙醇是一种绿色、可再生能源。高粱等植物的秸秆主要水解产物是木糖，可以用作乙醇生产的原材料。酿酒酵母不能直接利用木糖进行乙醇发酵。研究人员通过生物工程手段使酵母细胞提高木糖转运效率，并将木糖代谢相关的XR酶和XDH酶的基因导入野生型的酿酒酵母中，在酵母细胞内建立起了某木糖代谢的通路。 (1)XR酶和XDH酶的基因导入野生型的酿酒酵母中，新建立起的木糖代谢通路是图1中的 （填写“途径I”或“途径II”）。研究人员采用PCR技术扩增时随机改变反应条件，创建一系列木糖转运体蛋白新基因序列，导入受体细胞后筛选得到了高亲和性的木糖转运体，发现其第4个氨基酸由甘氨酸替换为丙氨酸，此改造过程属于 工程，涉及的可遗传变异来源有 。 (2)为进一步提高乙醇的产量，研究人员利用基因工程技术将XK基因与强启动子相连，导入受体细胞中，观察工程菌的乙醇发酵情况，技术路线如图2所示，其中①～④代表PCR扩增引物编号，LEU2基因是亮氨酸合成基因，URA3基因是尿嘧啶合成基因。 PCR扩增XK基因时选择的引物是图2中的 （用编号选填），为了使XK基因与载体质粒有效连接，可以通过PCR技术在XK基因的上下游引入限制性内切核酸酶 的识别序列。 (3)为比较不同工程菌的乙醇发酵情况，研究人员制备工程菌a和工程菌b，根据图2，完成下列表格填空： 制备工程菌a 制备工程菌b 导入质粒 重组质粒① 重组质粒b 受体细胞 ② 缺陷型酿酒酵母 尿嘧啶缺陷型酿酒酵母 筛选用培养基 木糖为唯一碳源、缺少亮氨酸、缺少尿嘧啶 ③ 在同等适宜条件下分别将工程菌a和工程菌b进行发酵实验，发现工程菌a的乙醇产量是工程菌b的1.5倍，结合图1、2，工程菌a提高了乙醇产量的原因是 。 (4)研究人员还在嗜热细菌中发现了XI酶，将XI酶的相关基因导入野生型的酿酒酵母，建立了图1中途径II所示的木糖代谢通路。但并没有表现出比野生型酿酒酵母更优良的木糖利用率和乙醇产率。其原因可能是 。 32．（2024·江苏盐城·模拟预测）江苏某研究团队利用TetR和GFP两种基因，构建了监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”大肠杆菌工程菌。限制酶的识别序列及切割位点、TerR和GFP两种基因所在的DNA片段以及相关的载体如图1所示，监测原理如图2所示。天然大肠杆菌中不具备TerR、GFP和Ampr（青霉素抗性基因）这三种基因。请据图回答下列问题： 限制酶 EcoRI XbaI SpeI BamHI 识别序列及切割位点 (1)基因工程的核心工作是 。若要拼接DNA片段1和2，结合图1中信息，在 酶作用后再添加 酶，可拼接成功。成功拼接后的连接处碱基序列为 （按5'→3'的顺序只写一条链）。最终构建成功的重组质粒示意图是 （填字母）。 A．  B.   C．    D. (2)在上述研究中，需导入天然菌的基因有 （编号选填）。 ①四环素合成相关基因②GFP基因③TetR基因④RNA聚合酶基因 (3)据图2分析，该工程菌检测环境中四环素水平的原理是 。 (4)下列操作不能证明重组质粒和大肠杆菌工程菌建构成功的方法及现象有 。 a．通过琼脂糖凝胶电泳实验证明重组质粒的大小符合预期 b．大肠杆菌工程菌不能在含有青霉素的培养基上生长 c．用显微镜观察重组质粒上的外源DNA片段的碱基序列 (5)为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP蛋白的第65位丝氨酸替换成苏氨酸，该项技术属于 。 33．（2024·江苏连云港·模拟预测）科研人员利用黄曲霉缺陷型（WTpyrg-）菌株（不能合成尿嘧啶和尿苷—简称UU）对黄曲霉相关基因的功能进行研究，部分研究过程如图所示。据图分析回答下列问题。 (1)下表是部分实验操作过程，请将空格处填写完整。 序号 实验操作步骤 具体操作及现象 结论或结果 1 纯种的WTpyrg -菌株的检测 将待测菌株转接在① 上能正常生长，而 接种在② 上却不能生长。 说明该菌株未被污染 2 获得WTpyrg- 菌株的DNA并鉴定 将粗提取并晾干的黄曲霉DNA放入试管 中，加入③ ，沸水浴5min，冷 却后观察溶液呈④ 色。 说明提取物为DNA 3 ⑤ 用WTpyrg-菌株的DNA、缓冲液、上下游 引物、原料、酶等建立反应体系，设置相关程序。 获得大量的DNA片段 (2)图1所示为pyrg基因中一条脱氧核苷酸链，进行PCR扩增pyrg时选用下列哪组引物可以扩增出pyrg序列 A．5′GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC 3′ B．5′GTCTGAGAGGAGGCACTGATGC 3′ C．5′CGGAGTTTGTTACGAGAAGTGGG 3′ D．5′CGTAGTCACGGAGGAGAGTCTG 3′ (3)图2所示，目的基因ORF片段长度约1000bp，通过设计引物扩增目的基因片段的上、下游片段各约1500bp，pyrg基因片段约1891bp，首先将pyrg片段与上下游片段相连接，通过转化将该片段导入受体细胞的目的是 。图3是将pyrg片段与上下游片段相连接后利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，M是参照，则图中 泳道的DNA是目的条带（选填A/B/C）。若扩增结果中出现非目的条带的原因可能有 。 34．（2024·江苏盐城·模拟预测）为研究编码铁运输相关蛋白的基因A（约963bp）在拟南芥缺铁胁迫响应中的作用，需要构建超量表达A的拟南芥转基因株系。质粒的结构如图2所示。回答下列问题。    (1)图1中，过程①指的是从拟南芥中提取RNA，经 催化，合成cDNA；过程②指的是以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，需要在引物的 端，加入限制酶 、 的识别序列。 (2)构建表达载体时，将PCR产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA连接酶进行连接，以避免 。 (3)将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR鉴定，如图3所示，选择“1、2”号菌进行测序的原因是 。 (4)将拟南芥的 直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并将得到的种子接种在含有 （抗生素）的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目的基因的阳性植株。 (5)提取转基因及野生型植株的蛋白质进行电泳检测，如图4。若其中 号为转基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A的拟南芥转基因株系。 35．（2024·江苏·模拟预测）虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β-胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”（如图1）构建含BKT基因和CRTR-B基因的表达载体（如图2，3），导入杜氏盐藻，以实现虾青素的工厂化生产，回答下列问题。 (1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总DNA为 ，设计特异性引物扩增BKT基因和CRTR-B基因，此过程需要 酶的催化。 (2)构建转化载体： ①PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的一端添加对应的同源序列。若将来需要将抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则扩增抗除草剂基因时，设计的引物序列（→）为 。 A．同源序列＋抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列 B．同源序列＋限制酶识别序列＋抗除草剂基因部分序列 C．抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列＋同源序列 ②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将BKT基因和CRTR-B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增BKT基因所用的引物为 ；扩增CRTR-B基因所用的引物为 。 ③最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是 。 (3)准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养，一段时间后，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。两次培养的目的分别为 、 。 (4)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，先用含 的培养基初筛已转化的杜氏盐藻，然后采用相关技术检测是否成功表达 。 (5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。 36．（2024·江苏·一模）热带玉米（WT）对光周期有较高的敏感性，开花需要短日照条件（SD），只能生活在热带。经长期驯化，进化出适应长日照条件（LD）的温带玉米。研究表明，热带玉米光周期敏感性与ZmCCT9基因有关，Cas9核酸酶敲除该基因过程中，获得了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种突变类型（图1）。在长日照条件下种植，发现三种突变型开花时间明显提前。请回答下列问题。 (1)图1方框中的三个碱基为NGG（N可为任何碱基），若该序列缺失，Cas9核酸酶将无法完成切割，该序列作用是 。结合图1分析，碱基序列中虚线代表 ，从表达结果看，敲除基因会导致 。该基因敲除导致的变异类型属于 。 (2)为探究ZmCCT9基因的表达模式，研究人员测定玉米发育过程中不同部位ZmCCT9表达量（图2），结果表明 。还测定在LD和SD下温带玉米和热带玉米的成熟叶片中ZmCCT9的昼夜表达量（图3），结果显示，在LD条件下， 。 (3)为探究驯化过程中玉米适应长日照的分子机制，测序发现温带玉米和热带玉米的ZmCCT9基因编码区无显著变异位点，但前者在基因上游携带了一段特殊序列（TE元件）。 ①据此推测，TE元件的功能是 。为证明TE元件的功能，需利用相关载体和元件构建LUC基因（一种荧光素酶基因）表达载体，图4长方框中构建的相关元件的先后位置是 （用图中字母排序）。 ②可以预测，实验组玉米细胞荧光比对照组玉米细胞荧光 （填写“强”或“弱”）。 ③根据以上材料，请完善温带玉米适应长日照的调控机制。ZmCCT9启动子（含TE）→ →适应长日照环境 37．（2024·江苏南通·一模）蒂蛀虫是荔枝的重要害虫。科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程如下图1所示。图2是SalI、HindⅢ和BamHI三种限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题： (1)与RNA相比，质粒特有的化学成分是 ；抗氨苄青霉素基因的作用是 。 (2)研究人员采用了如下图巢式PCR技术获取抗虫基因，巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。 ①PCR扩增时加入引物的原因是 ，在最后一个循环结束后通常还需要维持72℃5min的目的是 ，PCR产物常采用 来鉴定。 ②相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物概率 ，这是因为 。 ③为了使抗虫基因定向插入质粒中，第二次PCR扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序列是 ，不添加在引物3'端的原因是 。 (3)科研人员采用农杆菌转化法将抗虫基因导入荔枝细胞，由于农杆菌中的 ，能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞 上。 (4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可采用鉴定方法是 。 38．（23-24高三下·江苏苏州·开学考试）为筛选出宿主细胞中能与某病毒S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，过程如下图。请回答下列问题：    (1)S基因及TAP基因的体外扩增 ①通过PCR体外扩增S基因时，应该在S基因的5'端引入 和 序列，并删除S基因3'端的 编码序列。 ②为了防止PCR反应中发生突变，常选择高保真Pyrobest DNA聚合酶，与一般的Taq DNA聚合酶相比，它具有3'到5'核酸外切酶活性，Pyrobest DNA聚合酶能防止发生突变的原因是 。 ③PCR 一般要经历三十多次循环，在第一次循环之前，常进行预变性（95℃5min），目的是 。 (2)重组质粒的构建 下表为四种限制酶的识别序列及切割位点： 限制酶 Xho l Sma l EcoR I BamH l 识别序列 ↓ 5'-CTCGAG-3' 3'-GAGCTC-5'      ↑ ↓ 5'-CCCGGG-3' 3'-GGGCCC-5' ↑ ↓ 5-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'      ↑ ↓ 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5'      ↑ 由图可知TAP标签应该插入 酶切位点之间，经限制酶切割后，为得到目标 DNA片段，还需要通过 进行鉴定和纯化，再加入DNA连接酶完成质粒的环化。 (3)细胞转染 使用特定转染试剂，将纯化后的重组质粒进行细胞转染，为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做法为 。 (4)融合蛋白的表达 ①TAP标签含有特定的氨基酸序列，可用异硫氰酸荧光素标记的 来检测融合蛋白的表达。 ②研究发现，转染质粒之后融合蛋白的表达量较低，推测原因可能有 a. 重组质粒pcDNA3.1-S-TAP在病毒敏感细胞中大量复制 b. S-TAP融合基因在病毒敏感细胞中转录出的mRNA量较少 c. 病毒敏感细胞与病毒原宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA的tRNA数量不足 ③若病毒敏感细胞在转染前感染过重组痘苗病毒，则共转染后发出荧光的细胞数量会明显增多，且荧光强度显著增强，原因可能是 。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$