备课素材：ＤＮＡ粗提取和鉴定实验设计与改进-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

ＤＮＡ粗提取和鉴定实验设计与改进 本实验为高中生物学选择性必修３《生物技术与工程》中基因工程的实验内容。该实验可以让学生更加直观地通过观察掌握ＤＮＡ 的理化性质，也是基因工程中获取目的基因必不可少的实验步骤。 然而，该实验本身属于粗提取，最终得到的 ＤＮＡ 杂质含量较多，会影响 ＤＮＡ 沉淀的溶解和后续的二苯胺显色反应，也无法继续用做基因工程的实验材料。 对ＤＮＡ 粗提物进行纯化，并利用超微量紫外可见分光光度计进行 ＤＮＡ 纯度的检测，获得了较纯的基因组ＤＮＡ，进一步提升了该实验的教学价值，有利于学生通过实验充分掌握ＤＮＡ的性质及其提取的原理，得到的基因组 ＤＮＡ 也可以用于基因工程的其他实验，如作为 ＰＣＲ 的模板进行扩增，使得不同实验之间具有连续性，也让学生更深入地理解基因工程的实验设计及原理。 实验原理 基因组ＤＮＡ位于细胞核内，获取基因组ＤＮＡ首先要将细胞破碎从而释放基因组ＤＮＡ。 破碎细胞常用的方法是通过加入含有ＳＤＳ或ＣＴＡＢ等化学试剂的研磨液进行研磨或匀浆 。 另外，液氮冷冻研磨或蛋白酶处理与加入化学试剂研磨液的联合使用更有利于 细胞破碎基因组ＤＮＡ 易溶于２ ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，不溶于酒精 。 因此可以利用酒精将ＤＮＡ以沉淀的方式析出再用２ｍｏｌ ／ＬＮａＣｌ溶液溶解ＤＮＡ沉淀从而获得基因组ＤＮＡ 溶液。ＤＮＡ在加热条件下与二苯胺试剂反应可生成蓝色物质，可以通过颜色 反应来确认是否成功提取出基因组 ＤＮＡ。 氯仿／ 异戊醇可以使蛋白质变性，有助于去除蛋白质，从而纯化ＤＮＡ粗提液。ＤＮＡ在波长为２６０ｎｍ 处有最大吸收值，蛋白质在２８０ｎｍ 处有最大吸收峰，盐和有机小分子在２３０ｎｍ 处有最大吸收峰。 纯的ＤＮＡ其１．７＜ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２８０＜１．９， ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２３０ ＞２．０。 若 ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２８０＜１．７ 表示存在蛋白质污染，＞１．９ 则表示存在 ＲＮＡ 污染。ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２３０＜２．０说明存在盐等小分子污染。 实验试剂与方法 实验试剂： 研磨液，９５％ 乙醇，氯仿 ∶ 异戊醇（２４ ∶ １），３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ， ２ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 溶液，１．５％二苯胺试剂。 实验方法：以新鲜菜花作为实验材料。 １．ＤＮＡ粗提取： 称取４ｇ菜花组织置于研钵中，加入７ｍＬ 研磨液进行匀浆，匀浆至没有大的组织块，缓慢地将匀浆液转移到１０ ｍＬ 离心管中，于１２０００ｒｐｍ离心１ ｍｉｎ。 转移上述上清液至新的离心管中，加入 ２倍体积９５％乙醇，上下颠倒数次，可见白色 ＤＮＡ 絮状沉淀。用玻璃棒同方向搅拌将ＤＮＡ絮状物挑出，置于滤纸上吸干多余液体，再转移至新的离心管中，加入２ｍＬ ２ ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，上下颠倒或缓慢吸打，直至ＤＮＡ 絮状物完全溶解，得到 ＤＮＡ 粗提液。 ２． ＤＮＡ的鉴定： 吸取１．５ｍＬ２ ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液作为实验对照，吸取１．５ｍＬ上述ＤＮＡ粗提液作为实验组。 分别在对照组和实验组中加入３ｍＬ二苯胺试剂，混合均匀后，于沸水浴加热 ５ ｍｉｎ，观察并比较两者颜色的变化。 ３．ＤＮＡ的纯化： 从剩余的ＤＮＡ粗提液中吸出２０μＬ备用，作为未纯化的基因组ＤＮＡ对照。 向剩余的ＤＮＡ 粗提液中加入 ５００μＬ氯仿∶异戊醇（２４∶１），上下颠倒混匀２ ｍｉｎ， １２０００ｒｐｍ 离心１０ ｍｉｎ。 将上清液转移至新的离心管中，加入１／１０ 体积的３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡＣ，轻柔颠倒混匀，再加入 ２ 倍体积的 ９５％乙醇，轻柔颠倒混匀后，１２０００ｒｐｍ 离心 ５ ｍｉｎ，管底的沉淀即基因组ＤＮＡ。 缓缓倒掉上清液，室温待沉淀晾干后，加入 １００μＬ ２ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 溶液溶解 ＤＮＡ 沉淀，最终获得纯化的 基因组 ＤＮＡ。 分别取 ２ μＬ 未纯化和纯化后的基因组ＤＮＡ 溶液，利用超微量紫外可见分光光度计测定 ＤＮＡ的纯度。 结果与分析 １．ＤＮＡ粗提液的二苯胺鉴定：在获得的１．５ｍＬ菜花组织ＤＮＡ粗提液中加入 ３ ｍＬ １．５％的二苯胺试剂，沸水浴加热 ５ ｍｉｎ。 结果显示，与对照组（ＮａＣｌ 溶液＋二苯胺试剂） 相比，ＤＮＡ 粗提液呈现明显的蓝色（图１），说明本次实验成功将基因组 ＤＮＡ 提取出来，且ＤＮＡ 量较多，足以进行二苯胺颜色反应，可以肉眼观察到明显的颜色差异。 ２．不同破碎方法对ＤＮＡ粗提取的影响：为了获得尽量多的组织研磨液，结合目前组织研磨常用的方法，分别采用破壁机电动匀浆、采用玻璃匀浆器和研钵手动匀浆。其中研钵研磨分为添加液氮研磨和不添加液氮研磨两种方式，比较以上４种研磨方法对 ＤＮＡ粗提取效果的影响。 结果显示，利用破壁机电动匀浆进行组织破碎，在破碎过程中会产生大量泡沫影响破碎过程，且破碎过程中会产生热量，导致 ＤＮＡ 断裂，呈现均匀的短片段，无法通过玻璃棒搅拌将 ＤＮＡ 絮状物取出。 这种现象同样也出现在使用研钵研磨并且添加液氮的方法中。 液氮研磨可以通过制造低温保证ＤＮＡ 不被胞内核酸酶降解，但是当加入液氮进行研磨后，在上清液中加入 ２ 倍体积的乙醇后 ＤＮＡ 不能形成絮状物，而是呈现均匀分布的小片段，不利于后续用玻璃棒搅拌获取 ＤＮＡ 的操作。 与上述两种方法相比较，使用玻璃匀浆器和研钵研磨得到的组织破碎液，加入乙醇后能够肉眼看到大量白色ＤＮＡ 絮状物，可以用玻璃棒通过搅拌的方式将ＤＮＡ 絮状物取出。 由于ＤＮＡ的二苯胺颜色反应中，需要有足够多的 ＤＮＡ，因此需要较多的植物组织。 利用玻璃匀浆器研磨，因其空间较小，且玻璃易碎，研磨量大的组织费时费力，所以利用研钵更有利于大量植物组织的研磨。 ３．ＤＮＡ粗提液经纯化后的纯度变化： 由于ＤＮＡ 粗 提液中仍然含有大量的杂质，如蛋白质等，纯度太低，导致ＤＮＡ 粗提取过程中出现 ＤＮＡ 沉淀不易溶解的问题，且纯度低的基因组 ＤＮＡ 无法用于基因工程中的相关酶促反应，如ＰＣＲ 等。利用氯仿／异戊醇将获得的ＤＮＡ粗提液进行纯化，利用超微量紫外可见分 光光度计对未纯化和纯化的基因组ＤＮＡ进行纯度检测。结果发现，未纯化的基因组ＤＮＡ其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ ＝１．２３，比值远小于１．８，说明该ＤＮＡ粗提液中含有蛋白质污染。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＝１．１９，比值远小于２．０，说明该ＤＮＡ粗提液中可能含有小分子有机物的污染（表１）。而纯化后的基因组 ＤＮＡ ＯＤ２６０ ／ ＯＤ２８０ ＝ １．８７， ＯＤ２６０／ ＯＤ２３０ ＝ ２．０６，说明 ＤＮＡ 纯度较高，基本不含蛋白质和小分子的污染（表 １）。 在 ＤＮＡ 粗提取实验中，最关键的一步就是破碎细胞使得基因组 ＤＮＡ 得到释放。 另外，本实验采用二苯胺试剂进行 ＤＮＡ 的鉴定，ＤＮＡ 在 ４０—４００ μｇ 范围内，与二苯胺试剂反应生成的蓝色物质吸光度与 ＤＮＡ 浓度呈线性关系。 如果 ＤＮＡ 含量太低则二苯胺显色反应无法得到预期的结果。 想要达到肉眼明显可见的蓝色，提取的 ＤＮＡ 含量需达到每毫升百微克，这就在破 碎细胞提取 ＤＮＡ 时需要较多的植物组织。 这样就带来一定的问题：①研磨费时费力，实验操作困难，导致研磨不充分，细胞破碎效果不好，ＤＮＡ 释放较少；②植物组织使用量太多，导致提取物含有大量的杂质，如蛋白质、多糖、脂质等。 杂质含量多会造成 ＤＮＡ 沉淀不能完全溶解，无法获得澄清的 ＤＮＡ 粗提液，盐类等污 染也会影响 ＤＮＡ 的二苯胺显色反应。ＤＮＡ粗提物也无法被基因工程其他实验所利用。 学科网（北京）股份有限公司 $$